全 文 ：第 wt卷 第 t期
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林 业 科 学
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¤±qou s s x
转双抗虫基因 zwt杨基本特性分析 3
杨敏生 高宝嘉 王进茂 梁海永 杜克久
k河北农业大学 保定 sztsssl
摘 要 } 对携带两个外源抗虫基因k部分改造的 …·ΧρψtΑχ基因和慈菇蛋白酶抑制剂基因 ΑΠΙl的白杨杂种 zwt杨
的抗虫性 !生长特性 !木材品质 !结实特性及适应性进行多年连续观测 ∀结果表明 ov个转双抗虫基因 zwt杨株系对
杨扇舟蛾 !舞毒蛾 !美国白蛾等鳞翅目食叶害虫具有高抗虫性 o幼虫死亡率均在 {s h以上 o并且还能抑制存活下来
的昆虫幼虫的发育 o使其发育速率减缓 o不能正常结茧 o连续 w年饲虫试验未发现其抗虫性有规律下降的趋势 ∀转
基因受体 zwt杨具有生长速度快 o特别是胸径和材积生长在生长后期具有明显的速生优势 o单株材积生长量平均
超出对照 ws h以上 ~zwt杨木材品质优良 o木材密度 !纤维特性及各项力学性质均优于毛白杨 ∀连续 v年观测表明 o
zwt杨为高度败育雌株 o果穗小 !数量少 o成熟开裂前 zs h ∗ |s h脱落 o基本不飞絮 ∀转基因 zwt杨没有发生明显变
异 o生长未受影响 o可在毛白杨适生区推广应用 ∀建议采用适宜的栽培模式 o控制害虫抗性发展 ∀
关键词 } zwt杨 ~双抗虫基因 ~抗虫性 ~生长及材性 ~适应性
中图分类号 }≥zuu1vn y 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlst p ss|t p sz
收稿日期 }ussv p s{ p t{ ∀
基金项目 }国家自然科学基金kssusysvsu和 vsvzttzyl与河北省自然科学基金kvsuvtul资助 ∀
3 本课题参加人还有郑均宝 !田颖川教授 ∀
Αναλψσισ οφ Μαιν Χηαραχτεριστιχ οφ Ωηιτε Ποπλαρ Ηψβριδ 741
Τρανσφορµεδ Τωο Ινσεχτ−Ρεσισταντ Γενεσ
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kΑγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψοφ Ηεβει Βαοδινγsztsssl
Αβστραχτ} ≠ ¤¨µ¶²©¶¨µ¬¨¶²¥¶¨µ√¤·¬²±·²·«¨ • «¬·¨ °²³¯¤µ‹¼¥µ¬§zwtk°²³¯¤µzwtl ·µ¤±¶©²µ°¨ §·º²¬±¶¨¦·p µ¨¶¬¶·¤±·ª¨ ±¨ ¶
k…·ΧρψtΑχ ¤±§ ΑΠΙ ª¨ ±¨ ¶µ¨¥∏¬¯§¨§³¤µ·¯¼l¬±·«¨ ¦«¤µ¤¦·¨µ²©·«¨ ¬±¶¨¦·pµ¨¶¬¶·¤±¦¨ oªµ²º·«o¯ ∏°¥¨µ ∏´¤¯¬·¼o¶¨ §¨¬±ª¦«¤µ¤¦·¨µ
¤±§·«¨ ¤§¤³·¤¥¬¯¬·¼¬±§¬¦¤·¨§·«¤·v ²©·«¨ °²³¯¤µzwt ¦¯²±¨ ¶·²²®²±¤«¬ª«¬±¶¨¦·2µ¨¶¬¶·¤±·¬§¨±·¬·¼·²·«¨ ¯¨ ¤©³¨¶·¶¶∏¦«¤¶·«¨
Χλοστερα αναχηορετα ƒ¤¥µ¬¦¬∏¶o¤±§·«¨ Λψµαντρια δισπαρ¬±±¤¦∏¶ ¦¨·qo¤±§·«¨ °¨ ¤± §¨¤·«µ¤·¨ ²©·«¨ ªµ∏¥¶º¨ µ¨ ¤¯¯ ¤¥²√¨
{s h o©∏µ·«¨µ°²µ¨ o·«¨ ªµ∏¥¶. ªµ²º·«º«¬¦«¶∏µ√¬√¨ §¦²∏¯§¥¨ µ¨¶·µ¤¬±¨ §¤±§·«¨ ªµ²º·«µ¤·¨ º¤¶µ¨§∏¦¨§¶²·«¤··«¨¼ ¦²∏¯§±.
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Κεψ ωορδσ} ³²³¯¤µzwt ~·º²¬±¶¨¦·2µ¨¶¬¶·¤±·ª¨ ±¨ ¶~¬±¶¨¦·2µ¨¶¬¶·¤±·¦¨ ~ªµ²º·«¤±§ ¬¯ª±∏° ¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦~¤§¤³·¤¥¬¯¬·¼
杨树是我国东北 !华北 !西北广泛栽种的主要速生造林树种之一 ∀近年来 o随着杨树人工造林面积的不
断扩大 o杨树的虫害问题越来越突出 ∀由于害虫危害 o大量的杨树生长不良 o丧失绿化 !美化和防护效果 o甚
至大面积死亡 ∀有些地区因害虫危害 o不得不成片砍伐销毁 o以防治害虫扩散 ~一些受害虫危害严重的杨树
种 o不得不淘汰 ∀因此 o培育抗虫杨树新品种已成为当务之急的重要任务 ∀通过转基因技术培育抗虫新品种
是目前解决杨树虫害问题的最佳方法和有效途径 ∀转抗虫基因杨树的应用与传统害虫防治方法相比 o具有
安全有效 o降低投资和减少环境污染等诸多优点k谢先芝 ot||| ~李志兰等 oussul ∀
自 t|{z年首次报道了转抗虫基因植物以来 o国内外对苏云金芽孢杆菌k…·l杀虫蛋白基因研究很多 o已
获得一些转 …·基因的农作物 o并已商品化生产 ∀在培育转基因抗虫林木方面 o国内外已有在杨树≈欧洲黑杨
kΠοπυλυσ νιγραl o欧美杨 k Πq ≅ ευραµεριχαναl o毛白杨 k Πq τοµεντοσαl o欧美山杨 k Πq τρεµυλα ≅ Πq
τρεµυλοιδεσl o银白杨 ≅大齿杨k Πq αλβα ≅ Πq γρανδιδενταταl  !落叶松kΛαριξ γ µελινιιl !白云杉k Πιχεα ασπεραταl !
枫香kΛιθυιδαµβαρφορµοσαναl树转入抗虫基因的报道 o特别是杨树转基因研究取得了较大进展k李志兰等 o
ussu ~Ž¤µ¯ ετ αλqot||x ~Ž¯²³¨ ±¨¶·¨± ετ αλqot||t ~t||v ~ ¦≤²º± ετ αλqot||tl ∀我国于 t||v年报道了欧洲黑
杨转 …·ΧρψtΑχ基因研究 o获得的抗虫无性系对舞毒蛾kΛψµαντρια δισπαρl和杨尺蠖k Αποχηειµα χινεραριυσl毒杀
死亡率可达 {s h ∗ |s h k陈颖等 ot||x ~李明亮等 ousssl o其它抗虫基因对杨树的转化也取得了较大进展k郝
贵霞等 ot||| ~usss ~饶红宇等 ousssl ∀经过近 ts ¤的研究 o我们将部分改造的 …·ΧρψtΑχ基因与慈菇蛋白酶
抑制剂基因构建的双抗虫基因表达载体 o通过农杆菌介导法转化了优良白杨杂种 zwt杨 o并获得了一批对多
种鳞翅目害虫具有高抗虫性的无性系 o其中 v个高抗无性系具有高的害虫杀死率和对存活害虫发育抑制k田
颖川等 ousss ~郑均宝等 ousssl ∀目前转双抗虫基因 zwt杨已获得林业生物基因工程安全委员会批准的商品
化许可证书 ∀为科学地介绍这一转基因杨树 o促进其在生产上的推广应用 o本文报道了转双抗虫基因 zwt杨
基本生物学特性 o为转基因杨树在生产中应用提供理论依据 ∀
t 材料和方法
111 试验材料
试验材料为白杨杂种 zwt杨及转双抗虫基因 zwt杨 ∀zwt杨是于 t|zw年开始采用有性杂交获得杂种 o
经过选育获得的白杨杂种无性系 o杂交组合为¾银白杨k Πqαλβαl ≅ ≈山杨k Πqδαϖιδιαναl n 小叶杨k Πq
σιµοννιl À ≅毛白杨k Πqτοµεντοσαl ∀转双抗虫基因 zwt杨是将构件在一个载体上的 …·毒蛋白基因及慈菇蛋
白酶抑制剂基因k…·ΧρψtΑχ和 ΑΠΙ p Αl采用农杆菌介导法转化受体 zwt杨 o经过 °≤• 和 ≥²·«¨µ±2¥¯²·等分子生
物学检测和饲虫试验 o获得的对鳞翅目害虫具抗虫性的转基因株系 ∀
112 研究方法
t1u1t 受体 zwt杨生长特性分析 分别于 t|{t年和 t|{w年在河北易县西陵建立 u片 zwt杨无性系对比试
验林 ∀以易县毛白杨和生产上常用的其他毛白杨为对照 o随机区组 ow次重复 ow株小区 o株行距 x ° ≅ y °∀
于 t||s年和 ussu年分别调查树高 !胸径和材积 o考察无性系生长表现 ∀
t1u1u 木材特性分析 试验材料取自 z年生 zwt杨 !毛白杨雄株及北京杨k Πq≅ Βειϕινγενσισl对比试验林 ∀
随机伐取毛白杨 !zwt杨 !北京杨各 x株作样木 o齐地伐倒后 o取每一株的 t1v ∗ v1s °处的木段进行木材物
理 !力学性质的测定与分析 ∀测定了木材含水率 !密度 !干缩率 !纤维特性及抗弯强度等木材物理力学指标 o
在每株样木上均匀采取各项样品 w ∗ x个 o样品测定按国家标准进行 o于 ussu年在河北农业大学木材学实验
室测定 ∀
t1u1v 结实特性分析 以对比栽植的 z年生 zwt杨和易县毛白杨雌株为观测对象 o随机选取 ts ∗ tx株树木
为观测株 o每株选取 v ∗ x个枝条为标准枝 o室内水培与室外观察相结合 o测定果穗长度 !果穗粗度 !每穗蒴果
数 !每米枝条果穗数 !蒴果开裂前果穗脱落数 o考察 zwt杨和易县毛白杨结实情况 ∀
t1u1v 室内饲虫试验 以苗圃中生长的转基因 zwt杨和未转基因 zwt杨为材料 o选取当年生枝条新鲜叶片
在室内饲养昆虫 ∀饲养的害虫种类为杨扇舟蛾k Χλοστερα αναχηορεταl !舞毒蛾 !美国白蛾k Ηψπηαντρια χυνεαl !杨
小舟蛾k Μιχροµελαλοπηατρογλοδψταl等 ∀饲养容器为高 y ¦°直径 tu ¦°的罐头瓶 o用所料薄膜扎紧瓶口 o细针扎
孔通气 ∀选取孵化 t ∗ u天的一龄幼虫开始饲养 o每瓶至少 vs头幼虫 o重复 v次 o每天更换新鲜叶片 o直到结
茧为止 ∀隔日观察一次 o记载昆虫死亡数 o定期称取虫体重等 ∀
t1u1w zwt杨适应性分析 以 zwt杨和白杨杂种无性系 vsv !tsy及对照易县毛白杨为材料 ot|{u ) t|{x年在
河北省内易县 !阜城 !正定 !迁西 !涿鹿设置无性系对比试验林 ∀完全随机区组设计 ow次重复 ov ∗ x株小区 o
株行距 x ° ≅ y °∀用一年生带根苗定植 o田间管理措施一致 o每株实测树高及胸径 o并计算单株材积 ∀单株
u| 林 业 科 学 wt卷
材积按5全国阔叶树通用二元立木材积表6求得 ∀根据 x个试验点 y年生生长数据 o对无性系在不同环境下
的稳定性进行评估 ∀稳定性分析模型根据 ∞¥¨«¤µ·等kt|yyl提出的公式 ∀
t1u1x 转基因 zwt杨遗传变异性分析 以 tz个转基因 zwt杨株系为材料 o测定了谷氨酸脱氢酶等 tt种等
位酶 o实验主要采用水平切片淀粉凝胶电泳分离酶 ∀测定方法参照 ‹ µ¨·¨¯ 等kt|||l的方法进行 ∀对上述 tz
个转基因株系叶片提取 ⁄‘„ o采用 ts对随机引物进行 • „°⁄分析 ∀
u 结果与分析
211 转基因受体 741杨经济性状表现
u1t1t 生长特性 表 t结果表明 ozwt杨和易县毛白杨相比 o在高生长上优势不明显 o略优于易县毛白杨 o
而在胸径生长上显著超出易县毛白杨 ∀uu年生时 o平均胸径达到 wv1t ¦°o超出易县毛白杨 u| h ∀由于胸径
的生长优势 o材积生长量在 uu年生时超出对照 y| h ∀从表 t还可以看出 o随着年龄的增加 ozwt杨的生长优
势更加明显 o胸径生长量在 ts年生时超出易县毛白杨 t{ h o到 uu年生时超出 u| h ∀
表 1 741 杨在易县试验点生长情况比较 ≠
Ταβ . 1 Γροωτη χοµ παρισον οφ Ποπλαρ 741 πλαντεδ ιν Ψιξιαν Χουντψ
调查年份
× ¶¨·§¤·¨
树龄
×µ¨¨¤ª¨Π¤
树高 ×µ¨¨«¨¬ª«· 胸径 ⁄…‹ 材积 ∂²¯∏°¨²© º²²§
zwtχΠ° 易毛Π° ϖΠh zwtχΠ° 易毛Π¦° ϖΠh zwtχΠ°v 易毛Π°v ϖΠh
t||s ts ut1| us1y y±¶ uz1t uu1| t{ 3 3 s1x{v s1v|x w{ 3 3
ussu uu u|1v u{1v v±¶ wv1tz vv1wv u| 3 3 t1z{u t1sxz y| 3 3
≠ ±¶示无显著差异k Π€ s1sxl ~3 3 示差异达极显著水平kΑ€ s1stl ~∃表示 zwt杨超出百分率 ∀下同 ∀±¶° ¤¨±¶±²·¶¬ª±¬©¬¦±·¯¼ §¬©©¨µ¨±·k Π€
s1sxl o 3 3 °¨ ¤±¶¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ §¬©©¨µ¨±·k Π€ s1stl o∃ °¨ ¤±¶²∏·µ∏±±¬±ª³¨µ¦¨±·²√¨ µ¦¯²±¨ zwt1׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
zwtχ }zwt杨 °²³¯¤µzwt ~易毛 }易县毛白杨 Πqτοµεντοσα ¦√ q≠¬¬¬¤±q
对比结果表明k表 ul ozwt杨均显著优于其他毛白杨 o这种优势主要来自于胸径和材积 o而且随着树龄的
增加 ozwt杨胸径生长优势更加明显 ∀
表 2 741 杨与其他毛白杨类型生长比较
Ταβ . 2 Γροωτη χοµ παρισον οφ Ποπλαρ 741 ωιτη οτηερ ωηιτε ποπλαρσ
调查年份
× ¶¨·§¤·¨
树龄
×µ¨¨¤ª¨Π¤
无性系
≤¯ ²±¨
树高 ×µ¨¨«¨¬ª«· 胸径 ⁄…‹ 材积 ∂²¯∏°¨ ²© º²²§
‹Π° ∃Πh ⁄…‹Π¦° ∃Πh ∂Π°v ∃Πh
zwt杨 °²³¯¤µzwt tu tw1v s1s|z
t||s z 易县毛白杨 Πqτοµεντοσα ¦√ q ≠¬¬¬¤± tt1{ u
±¶ tu1s t| 3 3 s1sy| wt 3 3
普通毛白杨 Πqτοµεντοσα |1v u| 3 3 |1{ wy 3 3 s1sv| tw| 3 3
窄冠毛白杨 Πqτοµεντοσα ¦√ q°¼µ¤°¬§¤¯¬¶ |1t vu 3 3 {1v zu 3 3 s1suz ux| 3 3
zwt杨 °²³¯¤µzwt uz1tx vv1xv t1suv
ussu t| 易县毛白杨 Πqτοµεντοσα ¦√ q ≠¬¬¬¤± uy1uv w
±¶ uz1tx uv 3 3 s1yyu xx 3 3
普通毛白杨 Πqτοµεντοσα uw1vv tu±¶ uu1x{ w| 3 3 s1wvv tvy 3 3
窄冠毛白杨 Πqτοµεντοσα ¦√ q°¼µ¤°¬§¤¯¬¶ us1zs vt 3 3 t|1t{ zx 3 3 s1uzv uzx 3 3
u1t1u 木材特性 从表 v可以看出 ozwt杨在木材密度 !纤维特性及抗弯曲强度 !顺纹抗拉强度 !顺纹抗压强
度 !顺纹抗劈力 !冲击韧性等木材物理力学指标均不同程度优于对照毛白杨和北京杨 ∀经方差分析检测 o大
部分指标达到显著差异水平 ∀由于 zwt杨木材密度较大 o在体积干缩率上高于毛白杨和北京杨 o但从弦向与
径向比值来看 o三个树种之间并未达到显著差异 ∀
u1t1v 结实特性 毛白杨雌株结实量大 o种子成熟后蒴果开裂 o释放大量絮状物 o造成环境污染 ∀随着毛白
杨栽植数量的增多 o飞絮现象已经成为重要的环境问题 o引起社会重视 ∀从转基因树木生物安全角度考虑 o
雌性植株产生种子 o存在外源基因漂流隐患 o因此对转基因 zwt杨结实特性进行研究 o是十分必要的 ∀通过
对 zwt杨和易县毛白杨成熟大树连续 v年结实特性调查结果表明k表 wl ozwt杨在果穗长度 !果穗粗度 !每个
穗蒴果数均显著低于对照易县毛白杨 o果穗数量约为毛白杨的 ys h ∀通过果穗解剖观察发现 o在受精后约 u
∗ v周 o幼胚逐渐消失 o到成熟时已没有种子 ∀由于 zwt杨高度不育 o果穗在成熟开裂前 zs h ∗ |s h脱落 o因
此不会造成明显的飞絮现象 ∀
v| 第 t期 杨敏生等 }转双抗虫基因 zwt杨基本特性分析
表 3 7 年生 741 杨木材基本物理力学性质比较
Ταβ . 3 Μαιν πηψσιχσ ανδ µεχηανιχσ χηαραχτεριστιχσ οφ Ποπλαρ 741 ατ 7 ψεαρσ ολδ
测定项目 × ¶¨·¨§¬·¨° zwt杨 °²³¯¤µzwt 毛白杨 Πqτοµεντοσα 北京杨 Πq≅ βειϕινγενσισ
含水率 ‹∏°¬§¬·¼µ¤·¬²Πh zw1vv ? s1{u y|1zz ? y1ys zv1yz ? u1wz
干缩率
•¤·¨ ²©¶«µ¬±®¤ª¨Πh
径向 •¤§¬¤¯ v1xt ? s1wu v1yz ? s1wz u1{v ? s1wz
弦向 פ±ª¨ ±·¬¤¯ z1vx¤ ? s1yv w1xs¥ ? s1zt y1xv¤ ? s1sx
体积 ∂²¯∏°¨ ts1zx¤ ? s1v{ {1yv¥ ? s1uv |1t{¥ ? s1w{
弦向Π径向 פ±ª¨ ±·¬¤¯Π •¤§¬¤¯ u1tv ? s1v{ t1u{ ? s1v| u1vy ? s1vw
密度
⁄¨ ±¶¬·¼Πkª#¦°pvl
基本 …¤¶¬¶ s1v{s ? s1ssz s1vy{ ? s1stu s1vy| ? s1ss|
全干 ⁄µ¼ s1wuv ? s1sts s1wsy ? s1st{ s1wsy ? s1sts
气干 „¬µ§µ¼ §¨±¶¬·¼ s1wxv ? s1ss{ s1wvy ? s1st{ s1wwz ? s1ss{
含水 tu h时 „·tu h «∏°¬§¬·¼µ¤·¬² s1wxt ? s1ss| s1wvv ? s1st{ s1wwx ? s1ss|
抗弯强度 …¨ ±§¬±ª¶·µ¨±ª·«Π°¤ ts{1yz¤ ? u1|z |z1yv¥ ? s1vz |w1|x¥ ? t1vu
顺纹抗压强度 ≥·µ¨±ª·«¬± ¦²°³µ¨¶¶¬²± º¬·«ªµ¤¬±Π°¤ vw1w¤ ? t1|s vs1w¤¥ ? u1tw uy1v¥ ? s1yx
顺纹抗拉强度 ≥·µ¨±ª·«¬±·¨±¶¬²± º¬·«ªµ¤¬±Π°¤ |x1{¤ ? w1sw {{1xu¤¥ ? u1us z{1{¥ ? x1|x
顺纹抗劈力Πk‘#°°ptl 径面 •¤§¬¤¯ uu1xv ? s1xy ut1zz ? t1wv us1zv ? t1xx
≤¯ ¤¨√¬±ª¶·µ¨±ª·« º¬·«ªµ¤¬± 弦面 פ±ª¨ ±·¬¤¯ uv1{z¥ ? s1vv uy1tv¤ ? s1xs ut1zz¦ ? s1{{
冲击韧性 Œ°³¤¦·©¯ ¬¨¬¥¬¯¬·¼Πk®ª#°pul z{1|v¤ ? z1zw z|1xv¤ ? v1{{ u|1yz¥ ? w1tv
纤维特性 纤维长度 ƒ¬¥µ¨ ¯¨ ±ª·«ΠΛ° tsv|1v|¤ ? yw1s| {s{1wy¥ ? vs1xt yw{1xs¦ ? yv1|w
ƒ¬¥µ¨ ¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦ 长r宽 ¨±ª·«Π •¬§·« wz1xz¤ ? y1xu v|1ss¤¥ ? w1zt vt1wv¥ ? t1y|
≠同行字母不同表示 x h水平上差异显著 o下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨¯¨ ·¨µº¬·«¬± ¤¨¦«µ²º ° ¤¨±¶±²·¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ §¬©©¨µ¨±·k Π€ s1sxl q
表 4 连续 3 α 741 杨结实特性比较
Ταβ . 4 Φρυχτιφιχατιον χηαραχτερισιτιχ χοµ παρισον οφ Ποπλαρ 741 βψ 3 ψεαρστεστ
测定年份
× ¶¨·¼¨ ¤µ
无性系
≤ ²¯±¨
穗长
≥³¬®¨ ¯¨ ±ª·«Π¦°
穗粗
≥³¬®¨ §¬¤°¨ ·¨µΠ¦°
每穗蒴果数
Š¨ ° ±¨¶³¨µ¶³¬®¨
每米穗数
≥³¬®¨ ¶³¨µ°¨ ·¨µº¤·¯¨
开裂前脱落率
•¤·¬²²©§µ²³¥¨©²µ¨ §¨«¬¶¦¨Πh
usst zwt杨 °²³¯¤µzwt z1xy ? s1w{ s1wy ? s1sy t|1z ? tv1yu {x1xs ? w1u{ |s
毛白杨 Πqτοµεντοσα tu1us ? s1yy t1tx ? s1sw vt1ws ? x1us tuy1t ? y1tw x
ussu zwt杨 °²³¯¤µzwt ts1yw ? s1y| s1{x ? s1s| t{1xs ? v1vx |s1us ? y1|{ zs
毛白杨 Πqτοµεντοσα tw1w| ? t1yt t1sw ? s1sy vt1xs ? {1ts twz1s ? y1|{ u
ussv zwt杨 °²³¯¤µzwt {1uz ? t1vz s1{t ? s1su t{1{v ? v1zz zx1vs ? z1xz zx
毛白杨 Πqτοµεντοσα tw1sv ? u1|{ t1sw ? s1su vt1tz ? y1tz tuv1y ? {1|v u
212 转双抗虫基因 741杨抗虫性表现
u1u1t 对害虫的致死效应 应用群体饲虫方法 o用不同转基因杨株系及对照的叶片饲养目的昆虫 o以饲养
末期昆虫的总死亡数占饲养初期昆虫数的百分率为昆虫总死亡率 o并以此评价转基因杨株系的抗虫性 ∀从
约 ys个转基因株系中筛选出 z个株系 o用危害杨树的主要食叶害虫进行饲虫试验 o结果列于表 x ∀
表 5 转基因 741 杨毒杀昆虫的总死亡率
Ταβ . 5 Γενεραλ µ ορταλιτψ οφινσεχτσ κιλλεδ βψτρανσγενιχ ηψβριδ Ποπλαρ 741 h
转基因杨系号 ‘²q²©¦¯²±¨ 杨扇舟蛾 Χq αναχηορετα 美国白蛾 Η q χυνεα 舞毒蛾 Λq δισπαρ 杨小舟蛾 Μq τρογλοδψτα
‘²qvΠ≤Ž {x1z ? x1sΠt1z ? t1z ) |u1s ? {1tΠs )
‘²qu|Π≤Ž {{1v ? x1sΠt1z ? t1z tssΠtw1x {v1v ? sΠs ||1x ? s1yΠtt1z ? x1s
‘²qttΠ≤Ž {y1z ? tv1wΠt1z ? t1z |u1vΠtw1x {v1u ? x1tΠs tss ? sΠ{1w ? {1w
‘²qtΠ≤Ž zx1s ? {1vΠv1| ? s1y ) yt1z ? tt1zΠs tss ? sΠ{1w ? {1w
‘²qtsΠ≤Ž x{1w ? tt1zΠx1s ? t1z ) ) )
‘²qtuΠ≤Ž zx1s ? ut1zΠts1s ? v1v zt1zΠtw1x xs1s ? uv1tΠs )
‘²qtzΠ≤Ž zs1s ? sΠtv1v ? ts1s u{1tΠtw1x yz1y ? y1yΠtu1t ? ts1s tss ? sΠ{1w ? {1w
由表 x可见 o各转基因杨株系表现出不同杀虫效果 ∀测试的 v个株系 ‘²qv !‘²qu| !‘²qtt表现出较高的
w| 林 业 科 学 wt卷
杀虫效果 o对杨扇舟蛾 !美国白蛾 !舞毒蛾和杨小舟蛾的幼虫总死亡率达到 {v h ∗ tss h ∀另外 w个株系 ‘²q
t !‘²qtu !‘²q| !‘²qts !‘²qtz o杀虫效果较差 o对杨扇舟蛾 !美国白蛾和舞毒蛾的幼虫杀死率在 vs h ∗ zx h之
间 o仅对杨小舟蛾表现出较高的杀虫效果 ∀说明外源基因在不同无性系中插入的位置不同 o毒蛋白的表达
量也不相同 ∀在叶片饲虫筛选中 o只有约 x h ∗ ts h的转基因无性系能表现出较强的杀虫效果 o大部分转入
基因的毒蛋白表达量较低或处于沉默状态 o杀虫效果不明显 ∀
u1u1u 抗虫稳定性 用 v个高抗株系对杨扇舟蛾和舞毒蛾连续 w年饲虫试验结果表明k表 yl ov个转基因无
性系对两种害虫的杀虫效果存在一定变化 o对杨扇舟蛾的害虫死亡率变动在 zy1z h ∗ ||1| h o对舞毒蛾的幼
虫死亡率变动在 ys1y h ∗ |w1x h之间 ∀各无性系杀虫效果在不同年份存在一定差异 o如在 t|||年 ‘²qu|号
和 ‘²qtt号对舞毒蛾的杀虫效果略差 o而在 t|||年和 usss年 ‘²qu|对杨扇舟蛾的杀虫效果表现不理想 ∀但
是 o随着年代的推移 o各无性系均未表现出有规律下降的趋势 o表明转基因植株具有稳定的抗虫性 ∀
表 6 转双抗虫基因 741 杨抗虫性年度变化 ≠
Ταβ . 6 ς αριατιον οφινσεχτ−ρεσιστανχε οφ τηρεε τρανσγενιχ χλονεσ οφ Ποπλαρ 741 εξπρεσσεδ ασ αϖεραγε µ ορταλιτψ
供试虫种
Ž¬±§²©¬±¶¨¦·
检测日期
× ¶¨·§¤·¨
无性系 ≤¯ ²±¨
‘²qv ‘²qtt ‘²qu| ≤Ž
t||{ p s{ p st ) t||{ p s{ p us {|1y ? x qu±¶ |w1v ? x q{¤ |s1{ ? u qv¥ t1z ? t qz±¶
杨扇舟蛾 t||| p sz p ux ) t||| p s{ p ux |u1s ? w q{±¶ zy1z ? tv qw¥ {w1u ? v qs¦ v1v ? u qz±¶
Χq αναχηορετα usss p s{ p tx ) usss p s{ p ux {x1z ? x qs±¶ |v1w ? y qz¤ ||1| ? s qu¤ y1t ? x qy±¶
usst p s{ p st ) usst p s{ p us |{1{ ? v qu±¶ {{1z ? x qs¤¥ ||1y ? w qu¤ s1s ? s qs±¶
t||{ p sv p ts ) t||{ p sy p us |t1{ ? tt qz±¶ zz1{ ? x q|¤¥ {w1w ? t qy¥ {1t ? tt qx±¶
舞毒蛾 t||| p sw p vs ) t||| p sx p vs |u1x ? x qs±¶ {y1s ? w qt¤ ys1y ? z qy¦ s1s ? s qs±¶
Λq δισπαρ usss p sw p vs ) usss p sx p vs |u1s ? { qt±¶ zs1z ? z qw¥ yw1w ? x qy¦ y1s ? y qs±¶
ussu p sw p ts ) ussu p sx p vs |w1s ? s±¶ {x1x ? u qx¤ |w1x ? s qx¤ u1z ? s qy±¶
≠同一列每一虫种不同年份间字母相同为无显著差异k Π€ s1sxl o下同 ∀ ׫¨ ¶¤°¨¯¨·¨µº¬·«¬± ¤¨¦«¦²¯∏°± °¨ ¤°¶±²·¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ §¬©©¨µ¨±·k Π€
s1sxl q׫¨ ¶¤°¨¥¨ ²¯º q
u1u1v 对害虫发育的影响 经过转基因植株叶片饲养后的幸存者 o其生长发育受到极大影响k图 tl ∀随着
时间的增长 o用转基因杨树叶片饲养的害虫和正常饲养的害虫体重增长差距越来越大 ∀杨扇舟蛾在发育到
tw §时 o转基因叶片饲养的害虫体重仅为 s1tyu ∗ s1t{x ªo而对照为 s1wy{ ªo约为其 v倍 o绝大多数昆虫不能
完成整个幼虫期发育 ∀u个高抗转基因株系之间没有明显差异 ∀
图 t 杨扇舟蛾幼虫体重增长曲线
ƒ¬ªqt „√²¬µ§∏³²¬¶ªµ²º·«¦∏µ√¨²© Χq αναχηορετα ¤¯µ√¤
213 741杨的适应性
为研究 zwt杨生长的稳定性 o在河北省内 y个试验点
设置无性系对比试验林 ∀根据 x个试验点 y年生生长数
据进行联合方差分析 o证明无性系间在树高 !胸径 !材积 v
个性状上的地点效应 !无性系效应及无性系与地点的互
作效应均存在显著差异 ∀zwt杨生长表现突出 o在各试验
点胸径和材积生长量均显著优于对照易县毛白杨 o单株
材积生长量平均超出 ws h ∀根据 ∞¥¨«¤µ·和 • ∏¶¨¯¯ 模型 o
对参试无性系的稳定性作进一步评估 o估算出无性系对
环境反应参数 βk回归系数l和稳定性参数 Σ§uk离线性回
归方差l o结果列于表 z ∀
∞¥¨«¤µ·定义一个相对稳定的品种应为 β € t oΣ§u € s ∀
由表 t可知 ozwt杨在树高胸径 !材积上 β值与平均回归系数k β € tl均无显著差异 oΣ§u 值与 s不显著 o且 v
个性状平均值高于群体平均值 ∀可见 zwt是一个适应性广 !稳定性强 !生长量高的理想无性系 o适宜在试区
内大范围推广 ∀易县毛白杨生长性状稳定性强 o但生长量低 o属于稳定慢生类型 ∀
近年来 ozwt杨已在河南 !陕西 !天津 !北京 !山东 !甘肃等毛白杨适生区推广 o均能正常生长 o并表现出不
同程度的速生特性 o证明毛白杨具有较强的适应特性 o可在毛白杨适生区推广应用 ∀
x| 第 t期 杨敏生等 }转双抗虫基因 zwt杨基本特性分析
表 7 741 杨在 5 个试验点 6 年生生长性状的平均表现和稳定性参数
Ταβ . 7 Γροωτη χηαραχτερσ ανδ σταβιλιτψ παραµετερσ οφ Ποπλαρ 741 ατ 6 ψεαρσ ολδ ιν 5 τραιλσιτεσ
无性系
≤¯ ²±¨
树高 ×µ¨¨«¨¬ª«· 胸径 ⁄…‹ 材积 ∂²¯∏°¨ ²© º²²§
hΞΠ° β Σu§ hΞΠ¦° β Σu§ hΞΠ°v β Σu§
zwt |1ww¤¥ t1uuz s1stt tu1x{¤ s1|tw s1vvw s1sys¤ t1u{u y1uy ≅ tsp x
vsv |1|s¤ s1xvv 3 3 s1suw tt1xv¤¥ t1uw| s1yzx s1sxw¤¥ s1|s{ t1v| ≅ tsp w 3 3
tsy {1|v¥ s1|s| s1tty tt1tw¥ s1zs{ s1{z| 3 s1swy¥ s1y|v {1vz ≅ tsp x 3
易县毛白杨 Πq τοµεντοσα ¦√ q≠¬¬¬¤± {1z{¥ t1vvz 3 s1tst ts1|t¥ t1tu| s1xu| s1swv¥ t1sys w1zy ≅ tsp x
214 转双抗虫基因 741杨遗传变异性
将外源基因导入受体 zwt杨 o由于外源基因的切入具有偶然性 o随机插入的外源 ⁄‘„可能影响到受体
本身基因组及性状表达 ∀usst年在河北深县建立了转基因 zwt杨无性系对比试验林 o随机区组 ow次重复 ou
株小区 ∀u年生生长情况见表 { ∀
从表 {可以看出 o转基因和未转基因 zwt杨在胸径和树高上均显著优于毛白杨 o对照 zwt杨与转基因株
系间均未达到显著差异 ∀不同转基因株系间在胸径上存在一定差异 o由于试验林仅有 u年生 o还不能确切说
明转基因株系间存在遗传差异 o还有待于作进一步测定 ∀
表 8 转基因 741 杨不同株系生长情况对比
Ταβ . 8 Γροωτη οφ διφφερεντ χλονεσ οφ Ποπλαρ 741
无性系 ≤¯ ²±¨ 胸径 ⁄…‹Π¦° 树高 ×µ¨¨«¨¬ª«·Π°
毛白杨 Πqτοµεντοσα v1xx¦ w1{v¥
‘²qv x1s{¥ x1yx¤
‘²qu| x1ts¥ x1{u¤
对照 zwt杨 ≤Ž°²³¯¤µzwt x1ux¤¥ x1zs¤
‘²qtt x1vv¤¥ x1|x¤
‘²qtz x1x{¤¥ x1|s¤
‘²qtu x1y{¤¥ x1zs¤
‘²qt x1|s¤ x1|s¤
对 tz个转基因株系的可溶性蛋白 !参与重要
生理代谢的等位酶进行电泳分析 o测定了谷氨酸
脱氢酶kª¯∏·¤°¤·¨ §¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨l !异柠檬酸脱氢酶
k¬¶²¦¬·µ¤·¨ §¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨l !y p 磷酸葡萄糖脱氢酶
kŠ¯ ∏¦²¶¨ p y p ³«²¶³«¤·¨ §¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨l !草莽酸脱
氢酶 k¶«¬®¬°¤·¨ §¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨ l !苹果酸脱氢酶
k¤¯¤·¨ §¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨ l !谷氨酸脱氢酶kª¯∏·¤°¤·¨
§¨«¼§µ²ª¨±¤¶¨ l荧光酯酶 k ¶¨·¨µ¤¶¨l !天冬氨酸转氢
酶k¤¶³¤µ·¤·¨ ¤°¬±²·µ¤±¶©¨µ¤¶¨l !磷酸葡萄糖异构酶
k³«²¶³«²ª¯∏¦²¬¶²°¨ µ¤¶¨l !苹果酸酶k°¤¯¬¦ ±¨½¼°¨ l
和磷酸葡萄糖变位酶k³«²¶³«²ª¯∏¦²°∏·¤¶¨ltt种等
位酶 o均未发现转基因植株发生变异 ∀进一步采用 ts条随机引物对 tz个转基因植株 ⁄‘„进行随机 • „°⁄
扩增k见图 ul o未发现转基因植株 ⁄‘„发生变异 ∀表明外源基因转入后对测定的无性系生长等重要性状未
产生明显影响 ∀
图 u tz个转基因 zwt杨无性系用随机
引物 ’°∞ty进行随机 • „°⁄扩增结果
ƒ¬ªqu • „°⁄µ¨¶∏¯·²©tz·µ¤±¶ª¨ ±¨ ·¬¦³²³¯¤µzwt
¦¯²±¨ ¶º¬·«³µ¬° µ¨’°∞ty
泳道 t }¤µ®¨µ~泳道 u ∗ t{ }为转基因株系 ~泳道 t| }对照毛白杨 ∀
¤±¨ t } °¤µ®¨µ~¤±¨ u ∗ t{ }·µ¤±¶ª¨ ±¨ ·¬¦¦¯²±¨ ¶~¤±¨ t| }≤Ž³²³¯¤µq
v 讨论与建议
zwt杨具有明显的杂种优势 o在生长速度 !木材品
质 !结实特性 !适应性等方面均优于对照毛白杨 o表现
出适应性广 !稳定性强 !生长量高的优良特性 ∀经过
uu ¤的无性系对比试验 o证明与对照易县毛白杨相
比 ozwt杨在胸径生长具有明显优势 o且随着年龄的增
加 o这种优势更加明显 ∀在 uu年生时胸径生长量达
到了 wv1tz ¦°o超出易县毛白杨 u| h ∀由于在胸径方
面的生长优势 o使得其材积生长量在 uu年生时超出
易县毛白杨 y| h ∀双抗虫基因转入 zwt杨中 o通过初
步的田间试验和实验室检测表明 o选育出的具高抗虫
性的株系 o在生长发育 !叶部形态等方面并未受到明
显的影响 ∀
虽然 zwt杨生长速度比较快 o但木材的品质并没
有降低 o与毛白杨和北京杨对比 o在木材密度和多种木材力学性质上均表现优良 ∀这可能是由于 zwt杨树冠
y| 林 业 科 学 wt卷
比较大 o枝叶茂盛 o光合同化面积较大 o光合速率较高有关 ∀对 zwt杨苗期叶片光合分析表明 ozwt杨在不同
季节 !不同叶龄的叶片特别是成熟以后的叶片 o净光合速率和单叶同化率均明显高于对照易县毛白杨k杨敏
生等 ot||tl ∀zwt杨木材洁白 o尚未见其空心及腐心现象 ~连续 v年观测表明 ozwt杨为高度败育雌株 o果穗
小 !数量少 o成熟开裂前 zs h ∗ |s h脱落 o基本不飞絮 ∀
区域试验和稳定性分析表明 ozwt杨在许多试验点均表现出明显的生长优势 o单株材积在部分试验点平
均超出易县毛白杨 ws h o是一个适应性广 !稳定性强 !生长量高的理想无性系 o适宜在试区内大范围推广 ∀
经过十几年的推广应用证明 ozwt杨可在毛白杨适生区推广 ∀具体可在我国北纬 vsβ ∗ wsβ o东经 tsxβ ∗ tuxβ的
范围内应用 }河南 !山东全省 o京 !津两市 o河北长城以南及坝下地区 o陕西关中一带 o山西晋南各条河流流域 o
安徽北部淮北平原 o江苏东北部 o辽宁南部 o甘肃天水 !兰州以东等 ~还可往北扩展到内蒙古河套平原区 o往西
扩展到宁夏黄河冲积平原以及山西大同盆地 ~可试栽到我国西部河北杨 !新疆杨的分布区内 ∀要求比较深厚
的土壤 o对土壤质地适应性强 ~适栽于地下水位较高kt1x ∗ w °l的土地 ∀降水量少的立地需有灌水条件 o土
壤 ³‹y1x ∗ ³‹{1x o耐土壤含盐量 s1v h以下 ∀
zwt杨转入外源基因后 o其抗虫性得到提升 o对杨扇舟蛾 !舞毒蛾 !美国白蛾等多种鳞翅目害虫具有高抗
虫性 ov个高抗株系的幼虫杀死率平均在 {s h以上 o并能抑制存活的昆虫幼虫发育 o使其发育龄期的历期延
长 o发育速率减缓 o不能正常结茧 ∀转双抗虫基因 zwt杨是在一个植物表达载体上构建了 u种不同杀虫机制
的 …·ΧρψtΑχ基因和慈菇蛋白酶抑制剂基因k„°Œl ∀已报道的抗虫转基因植物多是转单一基因的 o虽然这些
植物对特定目标昆虫具有效毒杀或抑制生长发育作用 o但长期使用这种植物必将使目的昆虫产生抗性 ∀将
u个或 u个以上的不同抗虫基因转入植物 o可获得同时表达多种抗虫基因的工程植株 ∀由于不同抗虫蛋白
在昆虫肠内的受体不同 o或抗虫机制不同 o这类抗虫植物可以达到提高杀虫效力 !延缓害虫抗性产生的目的 ∀
试验证明 o经过连续 w年的抗虫性检测 o未发现转基因 zwt杨抗虫性随年代变化发生规律性下降的趋势 ∀
转抗虫基因植株的应用可以产生巨大的抗虫效果 o但存在的一些潜在问题也是明显的 ∀除了环境安全
上的问题外 o害虫的耐受性是一个不容忽视的问题 ∀广泛采用这种转抗虫基因杨树后是否会使害虫产生抗
性演化 ∀在转基因树木应用中 o应采取措施将昆虫的抗性演化控制在一定程度 ∀建议在转基因 zwt杨的种
植模式上 o应采用多个转基因株系混合应用 o包括具高抗虫性的株系和中等抗虫性的株系 o同时还应栽种一
些未转基因的 zwt杨 o从而保持转基因 zwt杨林分多样性和稳定性 o提高其对于环境的变化或来自群落内部
种群波动的缓冲能力 o降低抗性基因在昆虫种群内产生的几率 o防止害虫产生抗性 ∀
参 考 文 献
陈 颖 o韩一凡 o李 玲 o等 qt||x1 苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因转化美洲黑杨的研究 q林业科学 ovtkul }|z p tsv
郝贵霞 o朱 祯 o朱之悌 qusss q转 ΧπΤΙ基因毛白杨的获得 q林业科学 ovyktl }tty p tt|
郝贵霞 o朱 祯 o朱之悌 o等 q豇豆蛋白酶抑制剂基因转化毛白杨的研究 q植物学报 ot||| owtktul }tuzy p tu{u
李志兰 o杨敏生 q杨树基因工程育种研究进展 q河北农业大学学报 qussu ouxk¶∏³³qtl }twx p tx{
李明亮 o张 辉 o胡建军 o等 q转 …·基因和蛋白酶抑制剂基因杨树抗虫性的研究 q林业科学 ousss ovykul }|v p |z
饶红宇 o伍宁丰 o陈 英 o等 q杨树 ‘p {stsy转 …·基因植株的获得及抗虫性 q植物资源与环境学报 ousss o|kul }t p x
田颖川 o郑均宝 o虞红梅 o等 q转双抗虫基因杂种 zwt毛白杨的研究 q植物学报 ousss owukvl }uyv p uy{
王学聘 o韩一凡 o田颖川 o等 q抗虫转基因欧美杨的培育 q林业科学 ot||z ovvktl }y| p zw
谢先芝 q抗虫转基因植物的研究进展及前景 q生物工程进展 ot||| ot|kyl }wz p xt
杨敏生 o姜会明 o吴秀云 q新育优良无性系 zwt杨光合特性的初步分析 q河北林学院学报 ot||t oykvl }tyu p tyx
郑均宝 o梁海永 o田颖川 o等 q转双抗虫基因 zwt毛白杨的选择及抗虫性 q林业科学 ousss ovykul }tv p t|
∞¥¨«¤µ·o≥ „ ¤±§ •∏¶¨¯¯ • „ q≥·¤¥¬¯¬·¼ ³¤µ¤° ·¨¨µ¶©²µ¦²°³¤µ¬±ª√¤µ¬¨·¬¨¶q≤µ²³≥¦¬t|yy oy }vy p ws
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Ž¤µ¯ • Žo ⁄¤√¬§ ⁄ ∞q ƒ¬¨ §¯ √¨¤¯∏¤·¬²± ²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³²³¯¤µ ¬¨³µ¨¶¶¬±ª ¤ …¤¦¬¯¯∏¶·«∏µ¬±ª¬¨±¶¬¶ ΧρψΙΑk αl §2∞±§²·²¬¬± ª¨ ±¨ ¤ª¤¬±¶·©²µ¨¶··¨±·¦¤·¨µ³¬¯¯¤µ
k¨³¬§²³·¨µ¤}¨¦¶¬²¦¤°³¬§¤¨ l ¤±§ª¼³¶¼ °²·«kq}¼°¤±·µ¬¬§¤¨ l ©²¯ ²¯º¬±ªº¬±·¨µ§²µ°¤±¦¼q∞±√¬µ²± ∞±·²°²¯ ot||x ouwkxl }tvx{ p tvyw
Ž¯²³¨ ±¨¶·¨± ‘…o ¦‘¤¥¥o≥ ‹ o ‹¤µ·∞q×µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²© Ποπυλυσ «¼¥µ¬§¶·²¶·∏§¼ ¤±§¬°³µ²√¨ ³¨¶·µ¨¶¬¶·¤±¦¨ q≥¬¯√¤¨ Š¨ ±¨ ·¬¦¤ot||v owuku p vl }{y p |s
Ž¯²³¨ ±¨¶·¨± ‘…o≥«¬‘± oŽ¨°¤± „ q×µ¤±¶ª¨ ±¬¦ Ποπυλυσ«¼¥µ¬§ ¬¨³µ¨¶¶¤º²∏±§p¬±§∏¦¬¥¯¨³²·¤·²³µ²·¨¬±¤¶¨ ¬±«¬¥¬·²µŒŒp ≤„× ©∏¶¬²±q≤¤±qƒ²µ¨¶·q• ¶¨o
t||t out }tvut p tvu{
¦≤²º± … ‹ o ¦≤¤¥¨ ⁄ ∞o •∏¶¶¨¯¯ ⁄ • oετ αλq≥·¤¥¯¨·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²© Ποπυλυ󤱧¬±¦²µ³²µ¤·¬²± ²©³¨¶·µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ¥¼ ¨¯ ¦¨·µ¬¦§¬¶¦«¤µª¨ ³¤µ·¬¦¯¨¤¦¦¨¯¨µ¤·¬²±q
°¯ ¤±·≤¨¯¯ • ³¨²µ·¶ot||t o| }x|s p x|w
z| 第 t期 杨敏生等 }转双抗虫基因 zwt杨基本特性分析