全 文 ：第 wu卷 第 |期
u s s y年 | 月
林 业 科 学
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≥ ³¨qou s s y
双抗虫基因对三倍体毛白杨的
转化和抗虫性表达
杨敏生t 李志兰u 王 颖v 王进茂t 梁海永t
kt1 河北农业大学 保定 sztsss ~u1 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 富阳 vttwss ~
v1中国热带农业科学院热带生物技术研究所 热带作物生物技术国家重点实验室 海口 xzttstl
摘 要 } 建立三倍体毛白杨叶片再生体系 o用部分改造 …·ΧρψtΑχ基因与慈菇蛋白酶抑制剂k ΑΠΙl基因构建的双抗
虫基因表达载体 o通过农杆菌介导法转化三倍体毛白杨无性系 o在含卡那霉素 xs °ª#pt的分化培养基上诱导产生
不定芽的叶片占 t{ h o在生根培养基上对转基因植株做进一步筛选 o获得 xs个转化再生株系 ∀ °≤• 检测表明 }{s h
的植株呈现阳性反应 o部分株系进行 ≥²∏·«¨µ± …¯²·检测 o证明外源基因已经插入杨树基因组中 ∀用 …·毒蛋白抗血清
进行 ∞≥„检测 o结果表明 }z 个转基因株系都有 …·杀虫蛋白表达 o表达量最高的株系约占叶总可溶性蛋白的
s1sty t h ∀用经分子生物学检测的 u{个转基因株系叶片进行舞毒蛾和杨扇舟蛾幼虫饲虫试验 o结果表明 }不同株
系幼虫杀死率明显不同 o有 v|1v h的株系对舞毒蛾和杨扇舟蛾幼虫的致死率在 {s h以上 ~ux1s h的株系对两种害
虫的幼虫死亡率均在 ys h ∗ {s h之间 ~另有 vx1z h的株系幼虫死亡率在 xs h以下 o有些株系基本未表现出抗虫性 ∀
同时具高抗虫性的转基因株系能够明显抑制存活幼虫的生长和发育 ∀
关键词 } 三倍体毛白杨 ~双抗虫基因 ~遗传转化 ~抗虫性
中图分类号 }≥zuu1vn y 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussyls| p ssyt p s{
收稿日期 }ussw p tt p us ∀
Τρανσφορµατιον ανδ Εξπρεσσιον οφ Τωο Ινσεχτ2Ρεσισταντ Γενεσ
το Ηψβριδ Τριπλοιδ οφ Χηινεσε Ωηιτε Ποπλαρ
≠¤±ª ¬±¶«¨ ±ªt ¬«¬¯¤±u • ¤±ª ≠¬±ªv • ¤±ª¬±°¤²t ¬¤±ª ‹¤¬¼²±ªt
kt q Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψοφ Ηεβει Βαοδινγ sztsss ~u q Συβτροπιχαλ ΦορεστρψΙνστιτυτε o ΧΑΦ Φυψανγ vttwss ~
v q Ινστιτυε οφ Τροπιχαλ Βιοσχιενχε ανδ Βιοτεχηνολογψo Στατε ΚεψΛαβορατορψοφ Τροπιχαλ Χροπσ
Βιοτεχηνολογψo Χηινεσε Αχαδεµψοφ ΤροπιχαλΑγριχυλτυραλΣχιενχεσ Ηαικου xzttstl
Αβστραχτ} ׫¨ µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²±¶¼¶·¨° ²©·«¨ «¼¥µ¬§·µ¬³¯²¬§²©≤«¬±¨ ¶¨ • «¬·¨ °²³¯¤µº¤¶ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨§¤±§·«¨ ³¤µ·¯¼ °²§¬©¬¨§·º²
¬±¶¨¦·2µ¨¶¬¶·¤±·ª¨ ±¨ ¶≈…·ΧρψtΑχ ª¨ ±¨ ¤±§¤µµ²º«¨¤§³µ²·¨¬±¤¶¨ ¬±«¬¥¬·²µk ΑΠΙl ª¨ ±¨   º¨ µ¨ ·µ¤±¶©²µ°¨ §·²·«¨ «¼¥µ¬§³²³¯¤µ
¦¯²±¨ q„©·¨µ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±ot{ h ¯¨ ¤√¨ ¶¦²∏¯§¥¨ ¬±§∏¦¨§¶«²²·¶¬± ¶³¨¦¬©¬¦ °¨ §¬∏° ¦²±·¤¬±¨ §xs °ª#pt ®¤±¤°¼¦¬±q ׫¨
·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶ º¨ µ¨ ¶¨¯¨ ¦·¨§©∏µ·«¨µ²± ·«¨ ≥ °¨ §¬∏° ∏¶¨§©²µµ²²·¬±§∏¦·¬²± ¤§§¨§ xs °ª#pt Ž¤±¤°¼¦¬± ¤±§ xs
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³²¶¬·¬√¨ µ¨¤¦·¬²±q≥²°¨ ¶∏¥¦¯²±¨ ¶º¨ µ¨ ·¨¶·¨§¥¼¶²∏·«¨µ± ¥¯²·¤±§³µ²√¨ §·«¨ ¬¨²ª¨ ±²∏¶ª¨ ±¨ «¤¶¬±¶¨µ·¨§¬±·«¨ ³²³¯¤µª¨±²°¨ q
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Κεψ ωορδσ} «¼¥µ¬§·µ¬³¯²¬§²©≤«¬±¨ ¶¨ • «¬·¨ °²³¯¤µ~·º²¬±¶¨¦·pµ¨¶¬¶·¤±·ª¨ ±¨ ¶~ª¨ ±¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±~µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ·²¬±¶¨¦·¶
杨树是中国东北 !华北 !西北广泛栽种的主要速生造林树种之一 o也是世界上重要造林树种 ∀近年来 o随
着杨树人工造林面积的不断扩大 o杨树的虫害问题越来越突出 ∀由于害虫危害 o大量的杨树生长不良 o丧失
绿化 !美化和防护效果 o甚至大面积死亡 ∀因此 o培育抗虫杨树新品种已成为当务之急的重要任务 ∀随着基
因工程技术的发展 o植物抗虫基因工程育种受到世界各国的高度重视 ∀国内外已有在杨树k Ποπυλυ󶳳ql !
落叶松kΛαριξ ¶³³ql !白云杉k Πιχεα γλαυχαl !枫香树kΛιθυιδαµβαρφορµοσαναl等转入抗虫基因的报道 o特别是杨
树转基因研究取得了较大进展k王瑶等 ot||| ~李志兰等 oussul ∀t|{{年美国依阿华大学林学系 ¦‘¤¥¥等利
用根癌农杆菌的 ׬质粒为载体 o将马铃薯胰蛋白酶抑制剂k Πιν2 µl基因成功地导入杨树 ‘≤xvv|无性系 o转
化获得的抗虫杨已进入田间抗虫试验阶段 ∀我国也在 t||v年获得了一批转 …·ΧρψtΑχ基因的欧洲黑杨k Πq
νιγραl o对舞毒蛾kΛψµαντρια δισπαρl和杨尺蠖k Αποχηειµα χινεραριυσl 毒杀死亡率可达到 {s h ∗ |s h k田颖川
等 ot||vl ∀田颖川等kusssl和郑均宝等kusssl对 …·ΧρψtΑχ基因部分片断的核苷酸序列进行了改造与慈菇蛋
白酶抑制剂kΑΠΙl基因构建了具有不同杀虫机制的双抗虫基因载体 o并成功的转化了白杨杂种 ) ) ) zwt毛白
杨 ∀在杨树方面进行转基因研究的还有 ¦≤²º±等kt||tl !Ž¯²³¨ ±¶·¨¬±等kt||vl !‹²º¨ 等kt||wl !¨³¯¨等
kt||ul !≤²±©¤¯²±¬¨µ¬等kt||{l !郝贵霞等kt|||l !饶红宇等kusssl !杨敏生等kussxl ∀这些研究均获得了转化植
株 o并表达出一定的抗虫性 ∀
三倍体毛白杨是我国目前应用广泛的纸浆林工业用材树种k朱之悌 ot||xl ∀为提高其抗虫性 o笔者将部
分改造的 …·基因和慈菇蛋白酶抑制剂kΑΠΙl基因构建在一个植物表达载体上 o通过根癌农杆菌介导将此表
达载体上的双基因转入三倍体毛白杨中 o获得了一批对杨扇舟蛾等鳞翅目害虫具高抗性的植株 ∀
t 材料与方法
111 材料
t1t1t 菌种和质粒 含部分改造的 …·ΧρψtΑχ基因k简称 …·基因l及慈姑蛋白酶抑制剂k ΑΠΙl基因的植物表
达质粒载体为 ³…·¬„ o所含的抗性筛选标记基因为卡那霉素抗性基因 Νπτµk新霉素磷酸转移酶基因l ∀土壤
农杆菌 …„wwsw及以上载体由中国科学院微生物研究所构建并提供k田颖川等 ousssl ∀
t1t1u 植物材料 采用北京林业大学培育的三倍体毛白杨无性系 zv作为试验植物材料 ∀
t1t1v 测试昆虫 测试昆虫为杨扇舟蛾k Χλοστερα αναχηορεταl和舞毒蛾 ∀杨扇舟蛾新鲜卵块采自深州市北四
王庄村苗圃 o舞毒蛾的卵块每年春季采自秦皇岛市 ∀室内孵化幼虫 o人工饲养 o用于害虫检测 ∀
112 方法
t1u1t 双抗虫基因的构建和改造 将部分改造后的 …·ΧρψtΑχ杀虫蛋白基因和慈菇蛋白酶抑制剂k ΑΠΙ2Αl
基因构建在一个植物表达载体 ³…·¬„上k田颖川等 ousssl ∀对 …·ΧψρtΑχ基因的两端进行改造 o在 t ) uzv ¥³
这个区域共改变了 tu个碱基 o涉及到 tt个密码子的改变 o一般是将第 v位的 „×改变为 Š≤ ∀还改变了 u个
潜在的 °• ‘„转录终止信号 „„×ׄ„ 和 „„≤≤„„ ∀这一区域对提高基因表达是非常重要的 ∀在 t vwu ) t
{vy区域通过 |对引物共改变了 yv个碱基 o涉及 ys个密码子的改变 o同时改变了 v个可能引起 °• ‘„不稳
定的 „××ׄ基序和 {个 „×富集区序 ∀
t1u1u 双抗虫基因对三倍体毛白杨的转化 诱导叶片不定芽分化和诱导芽增殖培养基为 ≥ n yp…„s1y
°ª#pt n ‘„„s1t °ª#pt o诱导嫩茎生根培养基为 tru≥ n Œ…„s1w °ª#pt ∀采用农杆菌介导法进行基因转
化 o卡那霉素筛选培养基附加 xs °ª#pt卡那霉素 ovss °ª#pt羧苄青霉素 ∀选择生根培养基附加 xs °ª#pt
卡那霉素和羧苄青霉素 uss °ª#pt ∀
t1u1v 转化植株的分子生物学检测 杨树 ⁄‘„ 提取采用 ≤ׄ… 法进行 ∀ …·ΧρψtΑχ 基因引物序列 }
xχ≤׊„≤Š×„„ŠŠ„׊„≤Š≤„≤ vχ oxχ„≤ׄ×׊„ׄŠ×≤Š≤ŠŠ≤„×≤ vχ ∀°≤• 扩增条件 }|w ε xs ¶oxx ε ys ¶ozu
ε tss ¶o共 vs 个循环 ∀ ΑΠΙ 基因引物序列 }xχ Š≤׊„„××≤Š„≤≤„׊Š≤ŠŠ≤≤×≤≤„„≤Š≤× vχ oxχ ≤Š„׊
≤≤≤„Š≤„„ŠŠ×××× vχ ∀°≤• 扩增条件 }|w ε xs ¶oxz ε xs ¶ozu ε xs ¶o共 vs个循环 ∀
采用地高辛试剂盒进行 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·检测 o试剂盒购自美国 •²¦«¨ ⁄¬¤ª±²¶·¬¦¶公司 ∀用 Βαµ ‹Œ对所提取
⁄‘„进行酶切 o置于 vz ε 恒温箱中过夜 ∀酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后 o≥²∏·«¨µ±吸印转至尼龙膜上 o以
⁄¬ª²¬¬ª¨±¬±标记的 …·ΧρψtΑχ基因片段为探针 o与转至尼龙膜上 °≤• 产物进行 ≥²∏·«¨µ±杂交 o杂交后洗膜 o检
测杂交信号 ∀
蛋白质的提取按照 °¨ µ¯¤®等kt||tl所述的方法进行 ∀在 ∞≥„分析中 o首先用 tΒu xss稀释的 …·蛋白鸡
抗 w ε 包被过夜 o然后加已知浓度的标准抗原或植物蛋白溶液 vz ε 反应 v «o再加入 tΒt sss稀释的 …·蛋白
鼠抗 vz ε 反应 u «o最后加入羊抗鼠酶标二抗 vz ε 反应 u «o每步均用 °≥×洗板 v次 ∀最后加入底物避光反
uy 林 业 科 学 wu卷
应 vs °¬±o用 …¬²•¤§xxs型酶标仪测定结果 ∀∞Œ≥„试剂盒购自美国 „ª§¬¤公司 ∀
t1u1w 转基因植株的饲虫试验 饲虫材料为苗圃试验地上的转基因和未转基因k≤Žl的三倍体毛白杨各株
系 t年生苗木新鲜叶片 o进行室内饲养 ∀饲养瓶为高 tu ¦°直径 {1x ¦°的罐头瓶 o用塑料薄膜扎紧瓶口 o细
针扎孔通气 ∀选取孵化 t ∗ u §的 t龄杨扇舟蛾和舞毒蛾开始饲养 o每瓶 vs头幼虫 o每 u §换 t次新鲜叶片 o
直到化蛹为止 o记载昆虫死亡数 ∀试验结束时昆虫死亡数占参试总昆虫数百分比为害虫总死亡率 ∀饲养
ut §时对各系号的幼虫质量 !平均体长和虫粪进行称量 ∀
总死亡率 €饲养末期的死亡总数r初期的饲养总数 ≅ tss h ~死亡指数 € k Ε天数 ≅当天死亡数lΠk总死
亡数 ≅试验总天数l ∀
u 结果与分析
211 三倍体毛白杨叶片再生体系的建立
要确定完整而有效的转化系统 o分化和生根培养基的选择至关重要 ∀通过对多个培养基比较分析 o培养
基 ≥ n yp…„ s1y °ª#pt n ‘„„ s1t °ª#pt附加 tx ª#pt蔗糖和 y ª#pt琼脂较适合三倍体毛白杨叶片再生
培养 o诱导率达到 {{1z h o继代 ws §左右平均芽高可达到 t1u ¦°o且诱导出的芽健壮 ∀在生根培养中 o采用
tru≥ nŒ…„s1v °ª#pt效果较好 ∀接种后 v §就有生根现象 ots §时生根率达到 {{1v h otx §后全部生根 o每
个嫩茎小植株的主侧根数为 {条 o平均根长达到 v1v ¦°∀
212 农杆菌介导的基因转化
以试管内无菌叶片为外植体 o采用农杆菌介导法进行基因转化 ∀由于所用菌种带有抗卡那霉素基因
k ΝΠΤµ o新霉素磷酸转移酶标志基因l o因此在诱导和生根培养基中加入一定卡那霉素 o进行转基因植株的
初步筛选 ∀叶片经过浸菌和共培养后 o放置于附加 xs °ª#pt卡那霉素 ovss °ª#pt羧苄青霉素的诱导不定
芽分化的 ≥培养基中 o大约培养 us ∗ vs §o叶片开始大部分坏死 o呈水渍状但在切口部位及叶柄剪口处出现
米粒状愈伤组织 o经进一步培养 o诱导出不定芽 o约 ws ∗ xs §形成丛状芽丛 ∀能够诱导产生不定芽的叶片仅
占培养叶片总数的 t{ h左右 ∀
在含有卡那霉素 xs °ª#pt的生根培养基上对转基因植株作进一步筛选 ∀结果表明 }不同株系的三倍体
毛白杨生根率和生根天数明显不同 ∀最快的 x §即可生根 o最慢的 ty §生根 ∀生根率高的可以达到 tss h o
低的仅为 w{1w h ∀两周后统计根的生长状况 o最长的根长为 tv °° o最短的仅为 t °°∀同时发现 o生根快的
植株茎上部分生长也很快 o而且植株健壮 ∀生根慢的植株前期常有蹲苗现象 o生长缓慢 ∀所以 o一般根据嫩
茎小植株在 xs °ª#pt卡那酶素培养基上生根状况 o即可初步断定基因的转化成功与否 ∀对照未转基因三倍
体毛白杨在含 xs °ª#pt卡那霉素的生根培养基中不能生根 o大部分植株黄化死亡 ∀
213 转基因植株的 ∆ΝΑ水平检测
u1v1t …·ΧρψtΑχ基因和 ΑΠΙ基因的 °≤• 检测 提取抗卡那霉素株系基因组 ⁄‘„ o以质粒 ³…·¬„ 作阳性对
照 o以未转基因三倍体毛白杨作为阴性对照 o进行 °≤• 扩增 ∀扩增产物的电泳图如图 t所示 ∀
图 t 转基因再生三倍体毛白杨 °≤• 检测 …·基因结果
ƒ¬ªqt °≤• §¨·¨¦·¬²± ²© …·ΧρψtΑχ ª¨ ±¨ ²©·«¨ ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦«¼¥µ¬§·µ¬³¯²¬§²© ≤«¬±¨ ¶¨ • «¬·¨ °²³¯¤µ
泳道 t ¤±¨ t }¤µ®¨µ~泳道 u ¤±¨ u }阳性对照 °²¶¬·¬√¨ ¦²±·µ²¯ ~泳道 v ¤±¨ v }阴性对照 ‘¨ª¤·¬√¨¦²±·µ²¯ ~
泳道 w ) ty ¤±¨ w p ty }转基因株系 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶~图 u同此 ∀ ׫¨ ¶¤°¨¤¶¬± ƒ¬ªqu q
电泳分析表明 }转双抗虫基因的三倍体毛白杨植株经 °≤• 扩增 o各转基因植株均得到一条与阳性质粒
vy 第 |期 杨敏生等 }双抗虫基因对三倍体毛白杨的转化和抗虫性表达
作模板 °≤• 扩增带大小相同的 zw| ¥³的条带 o而未转化三倍体毛白杨基因组未出现 °≤• 扩增特异条带 o初
步证明外源 Βτ基因已整合到杨树基因组中 ∀
对蛋白酶抑制剂基因的 °≤• 检测结果表明 o抗性植株均得到一条与阳性质粒作模板 °≤• 扩增带大小相
同的 wzx ¥³的条带 o而未转化三倍体毛白杨基因组未出现 °≤• 扩增特异条带 o初步证明外源蛋白酶抑制剂
基因已整合到杨树基因组中 ∀
图 u 转基因再生三倍体毛白杨 °≤• 检测 ΑΠΙ基因结果
ƒ¬ªqu °≤• §¨·¨¦·¬²± ²© ΑΠΙ ª¨ ±¨ ²©·«¨ ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦«¼¥µ¬§·µ¬³¯²¬§²© ≤«¬±¨ ¶¨ • «¬·¨ °²³¯¤µ
经过含卡那霉素培养基的生根及叶片再生多次筛选后得到的转化三倍体毛白杨株系 o°≤• 检测表明
{s h的植株呈现阳性反应 o即在参加检测的 vy个转基因株系中 ou{个株系 °≤• 呈阳性反应 ∀
u1v1u …·ΧρψtΑχ基因的 ≥²∏·«¨µ± …¯²·检测 ≥²∏·«¨µ±杂交结果如图 v所示 ∀转基因三倍体毛白杨各系号基
图 v 转基因三倍体毛白杨基因组 ⁄‘„的 ≥²∏·«¨µ±杂交结果
ƒ¬ªqv ‹¼¥µ¬§¬½¤·¬²±©µ¤ª°¨ ±·²©ª¨ ±²°¬¦⁄‘„ ²©·«¨ ·µ¤±¶ª¨ ±¬¦
«¼¥µ¬§·µ¬³¯²¬§²© ≤«¬±¨ ¶¨ • «¬·¨ °²³¯¤µ¥¼ ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ª
因组 ⁄‘„的 Βαµ ‹Œ酶切产物与 …·基
因的探针杂交可产生一条大于 u1v ®¥
的杂交带 o其中 ts号所产生的杂交带
分子量较接近 u1v ®¥o而 tt号 !ut号 !
z号所产生的杂交带分子量在 x1s ®¥o
未转基因植株没有产生任何杂交带 ∀
这一结果说明 …·基因已整合到三倍
体毛白杨基因组 ⁄‘„中 o由于采用单
酶切 o每个转基因株系只出现 t条杂
交带 o初步证明是单拷贝整合 ∀
表 1 转基因三倍体毛白杨的 Βτ毒蛋白表达量
Ταβ .1 Βτ τοξοπροτειν οφ τηε τρανσγενιχ ηψβριδ τριπλοιδ
οφ Χηινεσε Ωηιτε Ποπλαρ
系号
≥∏¥¦¯²±¨
…·毒蛋白浓度
≤²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©
·«¨ …··²¬²³µ²·¨¬±Π
≈±ª#ktss ˏlpt 
总蛋白浓度
≤²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©
¤¯¯·«¨ ©∏¶¬¥¯¨³µ²·¨¬±Π
≈Λª#ktss ˏlpt 
…·毒蛋白Π总蛋白
…··²¬²³µ²·¨¬±Π·²·¤¯
³µ²·¨¬±Πh
uz uy1|| tyz1tz s1sty t
uw uw1ts t{t1wz s1stv v
y uv1sz t{t1yu s1stu z
wz t{1y{ t{{1{z s1ss| |
x |1{s tz|1tz s1ssx x
| u1tz twz1|u s1sst x
vs t1|{ tzw1|u s1sst t
≤Ž t1sx t{t1wz s1sss y
214 转基因植株的蛋白质水平检测
用抗 …·杀虫蛋白 ‘端 y{ ®∏的抗
血清对部分转基因杨树叶片蛋白提取物进行 ∞Œ≥„免疫测定 ∀测定结果证明k表 tl o在 z个转基因株系中有
均有 …·杀虫蛋白的合成 o毒蛋白表达量为 s1sst t h ∗ s1sty t h o均显著高于对照 ∀未转基因的对照毒蛋白
表达量仅为 s1sss y h ∀
215 抗虫性初步检测
u1x1t 转基因株系对舞毒蛾幼虫的致死
效应 用不同系号的叶片饲养舞毒蛾幼
虫 o以未转基因三倍体毛白杨作对照 o饲养
ut §时幼虫死亡率和死亡指数列于表 u ∀
从表 u可以看出 }不同系号转基因三倍体
毛白杨对舞毒蛾幼虫均有毒杀作用 o但死
亡率不同 ∀在处理 ut天时 o取食对照的幼
虫死亡率为 t{1t h o有 ut个系号幼虫死亡
率在 |s h以上 o有 w个系号幼虫死亡率为
xs h ∗ yx h ovs和 vy号株系的幼虫死亡率
仅为 t|1u h和 tw1x h o与对照未表现出明
显差异 o基本未表现出抗虫性 ∀死亡指数
wy 林 业 科 学 wu卷
是幼虫死亡率和死亡速度的综合反映 o死亡指数越小 o表明前期死亡比例越大 o毒力越大 ~死亡指数越大 o后
期死亡比例越大 o毒力越小 ∀死亡指数与死亡率紧密相关 o相关系数达到 p s1|tx o说明幼虫死亡率高的系
号 o其死亡速度也较快 ∀
表 2 转基因三倍体毛白杨毒杀舞毒蛾幼虫的死亡率及死亡指数
Ταβ .2 Λαρϖαε µορταλιτψ ανδ δεατη ινδεξ οφ Λ . δισπαρ φεδ ον τρανσγενιχ ηψβριδ τριπλοιδ οφ Χηινεσε Ωηιτε Ποπλαρ
系号
≥∏¥¦¯²±¨
试虫数量
‘∏°¥¨µ¶
死亡指数
⁄¨ ¤·«¬±§¨¬
死亡率
²µ·¤¯¬·¼Πh
系号
≥∏¥¦¯²±¨
试虫数量
‘∏°¥¨µ¶
死亡指数
⁄¨ ¤·«¬±§¨¬
死亡率
²µ·¤¯¬·¼Πh
tt u| s1vt tss1s vu vs s1vs tss1s
y vs s1u| tss1s wz vs s1vx tss1s
t vs s1vu tss1s wy |s s1v{ tss1s
uz vs s1ws tss1s uu vs s1u{ tss1s
{ vs s1vw |y1z t| vs s1vt tss1s
ut vs s1uz tss1s uw vs s1v{ |w1t
z vs s1u{ tss1s uy uz s1w{ |y1v
tz u{ s1uv tss1s | vs s1yv yt1x
wt vs s1vx |u1s u{ vs s1x{ yw1x
u vs s1uy tss1s v| vs s1xx yv1w
ts vs s1uy tss1s vs u{ s1{x t|1u
x uz s1vx tss1s ty u{ s1xz xs1y
wx vs s1vy tss1s vy vs s1yx tw1x
u| vs s1w{ tss1s ≤Ž vs s1{t t{1t
u1x1u 转基因株系对杨扇舟蛾幼虫的致死效应 用不同系号叶片饲养杨扇舟蛾 ut §o观察结果表明列于表
v ∀结果表明 }不同系号转基因三倍体毛白杨对杨扇舟蛾均有致死效应 o但不同系号对幼虫的抗性不同 ∀在
参加测试的 u{个株系中 o有 tt个株系对三倍体毛白杨具有较强的抗虫性 o杨扇舟蛾幼虫死亡率在 {s h ∗
tss h之间 o死亡指数较小 o介于 s1xv ∗ s1yz之间 ~有 z个株系抗性中等 o幼虫死亡率在 ys h ∗ {s h之间 o死亡
指数在 s1w{ ∗ s1zx之间 ~有 ts个系号抗虫性低 o幼虫死亡率在 s ∗ ys h之间 o死亡指数大都介于 s1zs ∗ s1|s
之间 ∀未转基因三倍体毛白杨叶片喂养的昆虫幼虫死亡率为 z1w h o且死亡指数较大为 s1zz ∀
表 3 不同转基因株系饲养杨扇舟蛾幼虫不同龄期死亡率
Ταβ .3 Αϖεραγε µ ορταλιτψ οφ διφφερεντ ινσταρ λαρϖαε οφ Χ . αναχηορετα φεδ ον διφφερεντ τρανσγενιχ συβχλονεσ
系号
≥∏¥¦¯²±¨
试虫数量
‘∏°¥¨µ¶²© ¤¯µ√¤¨
虫龄比例 °µ²³µ·¬²± ²©¬±¶·¤µ¶Πh
´ µ ¶ ·
死亡率
²µ·¤¯¬·¼Πh
死亡指数
⁄¨ ¤·«¬±§¨¬
y uz {{1| tt1t ) ) tss1s s1xz
{ uv {z1s tv1s ) ) tss1s s1xx
tt vs {s1s us1s ) ) tss1s s1xv
x ux zz1v ) ) ) zz1v s1w{
u vs yy1z tw1{ ) ) {t1x s1yx
tz uw yv1u ut1t ) ) {w1u s1xy
ut vs yv1s vv1v ) ) |y1v s1yz
wz u| yu1x {1v ) ) zs1{ s1x|
t vs x{1y wt1w ) ) tss1s s1ys
wy uz xy1x tv1s ) ) y|1y s1xu
z u{ xv1y v|1v ) ) |u1{ s1yx
ts uw xs1s vs1s ) ) {s1s s1yz
uw uz wu1v v1{ ) ) wy1u s1zs
uu vs vy1z uv1v ) ) ys1s s1x|
t| u{ ux1| vv1v ) ) x|1v s1ys
wx u| uv1t xv1{ ) ) zy1| s1yx
uz u| ut1w z{1y ) ) tss1s s1yw
wt vt ty1z yy1z ) ) {v1v s1xw
uy vs tv1v uy1z ) ) ws1s s1yx
vu u{ ) ) xv1y tz1| zt1w s1zx
u| vs ) ) wt1w vt1s zu1w s1zs
u{ vs ) ) us1{ ) us1{ s1{s
| u| ) z1t tw1v v1y ux1s s1zt
v| vs ) ) ts1s v1v tv1v s1zt
vt u| ) ) z1t v1y ts1z s1{s
vs u| ) ) v1y v1y z1t s1{{
ty vt ) v1v ) v1v y1z s1wx
vy u{ ) ) v1v u1y x1| s1wy
≤Ž u| ) ) v1z v1z z1w s1zz
xy 第 |期 杨敏生等 }双抗虫基因对三倍体毛白杨的转化和抗虫性表达
对杨扇舟蛾不同龄期死亡数进行调查 o计算各龄期死亡率k表 vl ∀结果表明 }同一系号不同龄期的死亡
率不同 o一般随着虫龄的增加幼虫死亡率降低 ∀未转基因三倍体毛白杨有较低的死亡率 o且主要集中在 v龄
和 w龄 o死亡率分别为 v1z h和 v1z h ~u{个转基因株系中 o有 tu个株系对杨扇舟蛾 t龄幼虫的致死率在
xs h以上 o而对 u龄幼虫的致死率明显降低 o大部分均在 ws h以下 o这 tu个系号的幼虫大多都死于 t龄和 u
龄 o进入 v龄的极少 ∀有 z个株系的 t龄幼虫致死率在 ts h ∗ xs h之间 o且大部分株系饲养的幼虫在 u龄时
死亡率高于 t龄时的死亡率 ∀未死亡且进入 v龄和 w龄的幼虫 o体质较弱 o且生长受到明显抑制 o与同龄对
照相比虫体偏小 ~有 |个株系除 u|号和 vu号幼虫致死率较高外 o其它系号幼虫致死率均较低 o且绝大部分
死于 v龄和 w龄 ∀由此可见 o高抗系号对杨扇舟蛾 t !u龄幼虫有很好毒杀效果 o进入 v龄的机率很小 ~中 !低
抗系号对杨扇舟蛾幼虫的毒杀效果依次减弱 o随着虫龄的升高幼虫本身抗性增强 o死亡率相对较低 ∀
u1x1v 转基因株系对杨扇舟蛾幼虫发育的影响 在用转基因三倍体毛白杨饲养的第 ut天时 o有 uu个株系
仍有幼虫存活 o对存活的幼虫 o测量其体重 !体长及虫粪重 o计算平均值 o各系号的比较结果列于表 w ∀
用转基因植株叶片饲养的杨扇舟蛾第 ut天时 ott个转基因株系饲养的幼虫单体质量均在 us °ª以下 o
绝大部分平均体长 ts °°以下 o虫粪质量在每头 u1x °ª以下 o说明这 tt个系号饲养的幼虫虫体较小 o代谢
能力差 o且活虫数较少 o这些系号中多数为高抗或中抗株系 ∀其余 |个株系饲养的幼虫单体质量在 xx ∗ tys
°ª之间 o平均体长在 t| ∗ ux °°之间 o每头虫粪质量为 us ∗ |x °ªo说明这 |个系号饲养的幼虫虫体较大 o代
谢能力相对较强 o而且活虫数较多 o这些系号大多数为低抗株系 ∀
表 4 转基因植株对杨扇舟蛾幼虫发育的影响(第 21 天)
Ταβ .4 Ινφλυενχε ον τηε γροωτη δεϖελοπ µεντ οφ Χ . αναχηορετα
φεδ ον τηε τρανσγενιχ πλαντσ (ον τηε 21στ δαψ)
系号
≥∏¥¦¯²±¨
每头虫质量
¤¶¶³¨µ«¨¤§Π°ª
平均体长
„√¨ µ¤ª¨ ¥²§¼ ¯¨ ±ª·«Π°°
每头虫粪质量
⁄∏±ª °¤¶¶³¨µ«¨¤§Π°ª
z t1s y s1y
x t1z x u1w
wz u1t w s1w
wx u1z y s1x
u u1{ x s1u
ts u1{ x s1{
wy v1v z s1z
tz w1z y t1x
uw z1x { t1z
t| {1t | t1x
wt tz1v ty ty1v
u| x{1| us ut1v
vt x|1x us uu1|
uy yw1x uv uv1{
vu |x1s ux v{1z
vy ttv1v uw yu1v
u{ tut1v t| ws1s
uu tvy1x uv y{1|
ty txu1w uw |t1w
| tx{1{ ux xz1s
v| tzs1| uu wt1t
vs tzw1{ uu wx1w
≤Ž tyw1w ux yt1w
v 讨论
基因转化的效率与组织的培养效
率和基因的转化系统相关 o筛选方法
也是其中很重要的一环 ∀为促进转化
细胞的分裂和生长 o抑制非转化细胞 o
须对培养的细胞施加选择压 ∀由于农
杆菌介导法的转化率多在 ts h以下 ∀
转化率低的原因之一是卡那霉素对转
化细胞具有强烈的毒害作用 o致使大
量的受体于选择培养基培养约一周时
便死亡 o从而降低了转化细胞的再生
率 ∀为能减轻卡那霉素对芽再生的阻
碍作用 o获得更多的转化芽 o很多研究
者都采用推迟筛选的方法k  ·¨½ ετ
αλqot||x ~‘¤µ¤¶¬°«∏¯∏ ετ αλqot||yl ∀
郝贵霞等kt|||l认为 }虽然推迟选择
获得再生芽总数大大提高 o但获得真
正的转化芽的频率没有显著提高 o并
且对大量假阳性芽的筛选工作量巨
大 ∀所以又提出了分级分步筛选 o既
共培养后先在低浓度的 Ž¤±选择培养
基上诱导分化 o然后再移至含高浓度
Ž¤±的培养基上进行筛选 ∀但这种选择方法较繁琐 o试验所需时间长 o还易使非转化细胞对选择会产生耐
性 o增加假转化体和嵌合体出现的频率 ∀本试验结果表明 }叶片在共培养 u §后即用 xs °ª#pt Ž¤±进行持
续选择 o获得抗性芽后 o直接在含有 xs °ª#pt Ž¤±生根培养基上进行生根培养 ∀生根过程比诱导不定芽的
过程对卡那霉素更加敏感 o未转基因的不定芽在卡那霉素含量为 ts °ª#pt培养基上即不能生根 ∀在含卡那
霉素生根培养基上快速生根的不定芽 o再进行分化培养 o形成不同株系 ∀采用这种两步筛选的方法 o不仅简
单 !节约了试验时间 o而且试验最终的转化率也较高 o最终诱导再生率为 t{ h左右 ∀
yy 林 业 科 学 wu卷
很多文献中提出了抗性植株 °≤• 阳性率低的问题 ∀据张艳贞等kussul报道 o用 °≤• 方法检测其转化得
到的转化体 ttv株 o获得 °≤• 阳性植株仅为 tw株 ∀她认为可能是由于所选用的抗性芽筛选方法不太合理 o
导致 °≤• 阳性率低 ∀本研究采用卡那霉素进行诱导芽和生根筛选 o得到的抗性株系 o移植到苗圃中生长 t
年后 o进行 °≤• 检测 ∀在检测的 wu个株系中 ovv个株系为阳性 o阳性率达到 {s h ∀
°≤• 检测容易出现假阳性 o可能是由于操作要求较低 o造成样本之间的交叉感染 ∀而 ≥²∏·«¨µ±杂交具有
灵敏性高k可检出 ts ∗ tu o即 t ³ª⁄‘„样品l o特异性强k可鉴别出 us个碱基对左右的同源序列l的特点 o是
当前鉴定基因整合的权威方法 ∀为了进一步证实 °≤• 检测结果的准确性 o对转基因三倍体毛白杨 w个高抗
系号进行了 ≥²∏·«¨µ±杂交 ∀选用地高辛试剂盒进行 ≥²∏·«¨µ±杂交 o证明测试的 w个株系外源基因均以单拷贝
的形式整合到三倍体毛白杨基因组中 ∀
外源基因片段在植物 ⁄‘„中插入位置及各种原因引起外源基因失活会导致转基因植物表现出不同的
抗虫性 o因此转基因植物的目的基因的高效表达和稳定遗传尚不尽如人意 ∀所以经 °≤• 等分子生物学检测
证明的转基因植株 o还需经过抗虫性生物测定试验以观察其实际抗性 ∀对转基因植株进行毒蛋白表达量测
定及进行实际饲虫试验 o是筛选具高抗虫性株系的必要环节 ∀本研究用经过分子生物学检测证明已转入 …·2
ΑΠΙ基因的三倍体毛白杨株系 t年生叶片进行了初步饲虫试验 o证明转基因株系对舞毒蛾和杨扇舟蛾均表
现出了杀虫效果 o不同株系对幼虫的致死率不同 ∀在参试的 u{个株系中 o有 tt个株系的植株叶片被舞毒蛾
和杨扇舟蛾取食后 o幼虫死亡率均在 {s h以上 o占总虫试系号的 v|1v h ~有 z个株系对 u种害虫的幼虫死亡
率均在 ys h ∗ {s h之间 o占总虫试系号的 ux1s h ~另有 ts个株系幼虫死亡率在 xs h以下 o有些株系基本未
表现出抗虫性 ∀这和其他文献报道一致 ∀田颖川等kt||vl年用含 …·基因的农杆菌 …„wwsw转化欧洲黑杨 o
共获得 xw株转基因植株 ∀tx h的转基因植株对杨尺蠖的校正死亡率为 {s h ∗ |y h o部分植株对舞毒蛾 x ∗ |
天内的校正死亡率高达 tss h o存活昆虫的生长和发育也明显受到抑制 ∀ ¨³¯¨等kt||xl发现一种半胱氨酸
蛋白酶抑制剂k’≤tl能抑制山杨叶甲k Χηρψσοµελα τρεµυλαεl的生长 ∀用含 ’≤t基因的农杆菌转化欧洲黑杨 ≅
美洲黑杨k Πqδελτοιδεσl o用转基因植株饲喂山杨叶甲 ux天后 o幼虫死亡率为 wv1x h o而对照只有 w1x h o同时
对幼虫的生长和发育也有抑制作用 ∀本研究获得的转基因三倍体毛白杨由于转入的是双价抗虫基因
…·ΧρψtΑχ和慈菇蛋白酶抑制剂kΑΠΙ2Αl基因 o因此转基因无性系除表现出杀虫活性外 o还应表现出抑制昆虫
生长和发育的作用 o抗虫谱相对较广 o而且害虫很难对其产生耐受性 o因此 o具有更为稳定的抗虫效果 ∀
研究结果表明 }转基因植株不能将害虫全部杀死 o而且随着害虫的发育 o杀虫效果降低 o害虫在幼龄对转
基因叶片最敏感 o死亡率较高 ∀但随着虫体的发育 o死亡率降低 o说明害虫的抗性逐渐提高 ∀转基因植株对
害虫的发育具有较大的影响 o可以明显降低害虫的体质量和体长 o说明虽然没有致死 o但严重影响其生长发
育 o有些个体不能完成其发育历期 o不能正常化蛹 o繁衍后代 o这可能是双基因共同作用的结果 ∀文献报道 o
…·基因对昆虫的生物学如生活 !生长 !发育和繁殖均发生显著影响 o常表现为幼虫存活率 !化蛹率及蛹羽化
率降低 o幼虫质量 !蛹质量变小 o幼虫发育减慢 o成虫产卵率降低 o严重的导致死亡 ~蛋白酶抑制剂基因可明显
抑制幼虫生长并推迟化蛹 o干扰昆虫蜕皮过程和免疫功能 o导致昆虫不能正常发育k俞志华 ousssl ∀由于 zwt
杨中转入的是双价抗虫基因 …·和慈姑蛋白酶抑制剂kΑΠΙl基因 o因此转基因株系除表现出杀虫活性外 o还应
表现出抑制昆虫生长和发育的作用 ∀但目前我们还不能证明这 u个基因在植物中都得到了有效表达 ∀
用美国 „ª§¬¤公司生产的 ΧρψtΑβΠΧρψtΑχ试剂盒 o对初步虫试筛选出的 {个株系进行了 ∞Œ≥„分析 o测
定结果与虫试结果基本一致 o相关系数达到 s1{uz的极显著水平 o说明 u种检测方法都比较可靠 ∀u种方法
结合 o可以准确 !快速地对大量转化植株进行抗虫性筛选 ∀
转基因植株的应用可以巨大的抗虫效果 o但其缺点也是明显的 ∀除了环境安全上的问题外 o害虫的耐受
性也是一个不容忽视的问题 ∀随着转抗虫基因杨树的田间释放 o…·的局限性正逐渐显示出来 o表现在杀虫
谱带窄 !毒力不够强 o更为令人关心的是 o广泛采用这种转抗虫基因杨树后是否会使害虫产生抗性演化 ∀由
于树木长期的生长过程中基因始终不变 o而昆虫经过许多世代演化后 o一旦对这种转基因树木产生抗性 o那
么转基因植株将失去其自身的价值 ∀对此 o许多学者指出要将昆虫的抗性演化控制在一定程度 ∀采用多种
基因转化植物 !将不同基因转化的植物混栽 !工程植株和非工程植株混栽等技术措施 o这些都将大大减缓昆
虫的抗性演化 o这是需要在今后进一步研究的工作 ∀
zy 第 |期 杨敏生等 }双抗虫基因对三倍体毛白杨的转化和抗虫性表达
参 考 文 献
郝贵霞 o朱 祯 o朱之悌 qt||| q豇豆蛋白酶抑制剂基因转化毛白杨的研究 q植物学报 owtktul }tuzy p tu{u
李志兰 o杨敏生 qussu q杨树基因工程育种研究进展 q河北农业大学学报 ouxk≥∏³ql }twx p tw{
饶红宇 o伍宁丰 o陈 英 o等 qusss q杨树 ‘p {stsy转 …·基因植株的获得及抗虫性 q植物资源与环境学报 o|kul }t p x
田颖川 o韩一凡 qt||v q抗虫转基因欧洲黑杨的培育 q生物工程学报 o|kwl }u|t p u|z
田颖川 o郑均宝 o虞红梅 o等 qusss q转双抗虫基因杂种 zwt毛白杨的研究 q植物学报 owukvl }uyv p uy{
王 瑶 o林木兰 o沈锡辉 o等 qt||| q农杆菌介导的木本植物遗传转化 q生物技术通报 oy }uv p uz
杨敏生 o高宝嘉 o王进茂 qussx q转双抗虫基因 zwt杨基本特性分析 q林业科学 owtktl }|t p |z
俞志华 qusss q抗虫基因的抗虫原理及其应用现状和展望 q生物学通报 ovxkzl }{ p ts
郑均宝 o梁海永 o田颖川 o等 qusss q转双抗虫基因 zwt毛白杨的选择及抗虫性 q林业科学 ovykul }xx p yu
朱之悌 o林惠斌 o康向阳 qt||x q毛白杨异源三倍体 …vst等无性系选育的研究 q林业科学 ovtkyl }w|| p xsx
张艳贞 o王 罡 o胡汉桥 o等 q农杆菌介导将 …·杀虫蛋白基因导入优良玉米自交系的研究 q遗传 oussu ouwktl }vx p v|
≤²±©¤¯²±¬¨µ¬ o „¯ ¯¨ ªµ² Š o…¤¯ ¶¨·µ¤½½¬„ qt||{ q • ª¨¨ ±¨ µ¤·¬²± ²© Ποπυλυσ νιγρα·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶ ¬¨³µ¨¶¶¬±ª¤ Ž∏±¬·½ ³µ²·¨¬±¤¶¨ ¬±«¬¥¬·²µkŽ·¬vl ª¨ ±¨ q ²¯
…µ¨ §¨¬±ªow }tvz p twx
‹²º¨ Š × oŠ²¯§©¤µ¥…qt||w q Αγροβαχτεριυµ2° §¨¬¤·¨§·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²©«¼¥µ¬§³²³¯¤µ¶∏¶³¨ ±¶¬²± ¦∏¯·∏µ¨¶¤±§µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²± ²©·µ¤±¶©²µ°¨ § ³¯¤±·¶q °¯¤±·≤¨¯¯o
׬¶¶∏¨ ¤±§ ’µª¤± ≤∏¯·∏µ¨ ovy }x| p zt
Ž¯²³¨ ±¶·¨± ‘…o ¦‘¤¥¥≥ ‹ o ‹¤µ·∞qt||v q×µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²© Ποπυλυσ «¼¥µ¬§¶·²¶·∏§¼ ¤±§¬°³µ²√¨³¨¶·µ¨¶¬¶·¤±¦¨ q≥¬¯√¤¨ Š¨ ±¨ ·¬¦¤owuku p vl }{y p |s
¨³¯¨≤ o…µ¤¶¬¯¨ ¬µ² „ ≤  qt||u q×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³²³¯¤µ¶} ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©¦«¬° µ¨¬¦ª¨ ±¨ ¶∏¶¬±ª©²∏µ§¬©©¨µ¨±·¦²±¶·µ∏¦·¶q°¯¤±·≤¨¯¯ • ³¨²µ·¶ott }tvz p twt
¦≤²º± … ‹ o ¦≤¤¥¨ ⁄ ∞o•∏¶¶¨¯¯ ⁄ • qt||t q≥·¤¥¯¨·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±²© Ποπυλυ󤱧¬±¦²µ³²µ¤·¬²±²©³¨¶·µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ¥¼ ¨¯ ¦¨·µ¬¦§¬¶¦«¤µª¨ ³¤µ·¬¦¯¨¤¦¦¨¯¨µ¤·¬²±q
°¯ ¤±·≤¨¯¯ • ³¨²µ·¶o| }x|s p x|w
¦‘¤¥¥ ‹ ≥ qt||t q„ ©¬¨ §¯·µ¬¤¯ ²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦«¼¥µ¬§³²³¯¤µ·µ¨ ¶¨}¨¶·¤¥¯¬¶«°¨ ±·¤±§ªµ²º·«·«µ²∏ª«·«¨ ¶¨¦²±§¶¨¤¶²±q„ªµ²¦∏¯·∏µ¨ • ¶¨¤µ¦«Œ±¶·¬·∏·¨o| }txx p tx|
 ·¨½ × ⁄o⁄¬¬¬·• o∞¤µ¯¨ ∞ ⁄qt||x q„ªµ²¥¤¦·¨µ¬∏°·∏°¨ ©¤¦¬¨±¶2 °¨ §¬¤·¨§·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²©¥µ²¦¦²¯¬¤±§¦¤¥¥¤ª¨ q°¯ ¤±·≤¨¯¯ • ³¨²µ·¶otx }u{z p u|u
‘¤µ¤¶¬°«∏¯∏o‹²§ª¨¶× Žqt||y q Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσ2 °¨ §¬¤·¨§·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²©­¤³²±¬¦¤¤±§¬±§¬¦¤µ¬¦¨ √¤µ¬¨·¬¨¶q°¯ ¤±·¤oy }tu p tz
°¨ µ¯¤® ƒ o ⁄¨ ¤·²± • • q „µ°¶·µ²±ª× „ o ετ αλqt||s qŒ±¶¨¦·µ¨¶¬¶·¤±·¦²·²± ³¯¤±·¶q…¬²·¨¦«±²¯²ª¼o{ }|v| p |wv
k责任编辑 朱乾坤l
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5中国学术期刊文摘k英文版l6刊号为 ≤‘tt p xwttΠ‘oŒ≥≥‘tyzv p ws{w oussz年改为月刊 o大 ty开 o国内
定价 tx qss元Π册 o全年定价 t{s元 o邮发代号 }{s p w{z ∀
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{y 林 业 科 学 wu卷