全 文 ： 收稿日期 }t||| p s| p uz ∀
3 本研究属于中国林业科学研究院与意大利国家研究委员会合作研究项目/中国主要针叶树的分子生物学研究0的部分内容 ∀
第 vy卷 第 v期u s s s年 x 月
林 业 科 学
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杉木和秃杉群体的叶绿体微卫星分析 3
陈伯望 洪菊生 施行博
k中国林业科学研究院林业研究所 北京 tsss|tl
摘 要 } 对 x个杉木和 z个秃杉天然群体进行胚的叶绿体微卫星分析 o每个群体分析了 tu ∗ vy粒种子 ∀
试用了两种 ⁄‘„提取方法 o这两种方法获得的 ⁄‘„数量和质量相仿 o可以采用较为经济的方法 ∀研究了各
种 ⁄‘„扩增条件并获得了合适的条件组合 ∀应用 „µ¯¨ ∏´¬±和 °‹ ≠Œ°软件分析了群体分子变异模式及群
体遗传关系 o结果表明叶绿体微卫星方法能够有效地分析出杉木和秃杉的群体以及树种内的变异情况 o对于
研究针叶树种的进化历史 !基因保存策略和育种策略都具有特殊的意义 ∀
关键词 } 杉木 o秃杉 o群体 o叶绿体微卫星 o聚类分析
ΣΤΥ∆Ψ ΟΝ ΓΕΝΕΤΙΧ ∆Ις ΕΡΣΙΤΨ ΟΦ ΧΥΝΝΙΝΓ ΗΑΜΙΑ ΛΑΝΧΕΟΛΑΤΑ ΑΝ∆
ΤΑΙΩΑΝΙΑ ΦΛΟΥΣΙΑΝΑ ΒΨ ΥΣΙΝΓ ΧΗΛΟΡ ΟΠΛΑΣΤ ΜΙΧΡ ΟΣΑΤΕΛΛΙΤΕΣ
≤«¨ ± …²º¤±ª ‹²±ª∏¶«¨ ±ª ≥«¬÷¬±ª¥²
( Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Φορεστρψ, ΧΑΦ Βειϕινγtsss|t)
Αβστραχτ: ⁄‘„ º¤¶¬¶²¯¤·¨§ ©µ²° ª¨µ°¬±¤·¬±ª °¨¥µ¼²¶ ²© x ¤±§ z ±¤·∏µ¤¯ ³²³∏¯¤·¬²±¶ ²© Χυννινγηαµια
λανχεολατα ¤±§ Ταιωανια φλουσιαναo µ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ q × º² §¬©©¨ µ¨±··¨¦«±¬´∏¨¶ º µ¨¨ ∏¶¨§©²µ·«¨ ⁄‘„ ¬¶²¯¤·¬²±q
≥¬°¬¯¤µµ¨¶∏¯·¶¬± ·¨µ°¶²© ∏´¤±·¬·¼ ¤±§ ∏´¤¯¬·¼ ²© ⁄‘„ º µ¨¨ ²¥·¤¬±¨ §¤±§·«¨ ¦¨²±²°¬¦¤¯ ²±¨ º¤¶¶¨¯¨ ¦·¨§¤¶°¤¬±
° ·¨«²§q ׫¨ ¥¨¶·⁄‘„ ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±¦²±§¬·¬²± º¤¶²¥·¤¬±¨ §¤©·¨µ ¬¨³¨µ¬° ±¨·¶q„  ’ ∂ „ º¤¶¶·∏§¬¨§¥¼ ∏¶¬±ª·«¨
¶²©·º¤µ¨ ²© „µ¯¨ ∏´¬± ¤±§°‹ ≠Œ° q • ¶¨∏¯·¶¶«²º §¨·«¤··«¨ ¦³≥≥• º¤¶¶¨±¶¬·¬√¨¬± µ¨√ ¤¨¯¬±ª·«¨ ª¨ ±¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²±
¥¨·º¨¨ ± u ·µ¨¨¶³¨¦¬¨¶¤±§¤°²±ª·«¨ ³²³∏¯¤·¬²±¶¬±¶¬§¨ ¶³¨¦¬¨¶o¬·¬¶²©¶³¨¦¬¤¯ ¬°³²µ·¤±¦¨ ¬±¶·∏§¬±ª·«¨ √¨²¯∏·¬²±
«¬¶·²µ¼ ²©¦²±¬©¨µ²∏¶·µ¨¨¶³¨¦¬¨¶oª¨ ±¨ µ¨¶²∏µ¦¨¶¦²±¶¨µ√¤·¬²±¶·µ¤·¨ª¼ ¤±§·µ¨¨¥µ¨ §¨¬±ª¶·µ¤·¨ª¼q
Κεψ ωορδσ: Χυννινγηαµια λανχεολαταo Ταιωανια φλουσιαναo °²³∏¯¤·¬²±o ≤«¯²µ²³¯¤¶·°¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨ o ≤ ∏¯¶·¨µ
¤±¤¯¼¶¬¶
与核基因组 ⁄‘„相比 o叶绿体基因组 ⁄‘„具有分子量小 !多拷贝和结构简单等特点 o这些都有利
于对叶绿体基因组进行分析k包括物理图谱的构件及特定基因的分离 !鉴定和序列测定等l ∀一般来
说 o动植物的大多数核基因 o包括曾经一度被认为是单拷贝的基因 o其实都是一些小的重复基因家族 o
基因的重叠和缺失及假基因的形成 o都和这些重复基因家族有关 ∀所有这些过程都会干扰与生物进化
历史密切相关的 ⁄‘„进化史 ∀而在叶绿体基因家族中 o仅有两个作为一个遗传单位的反向重复区 o因
此叶绿体微卫星k¦«²¯²µ²³¯¤¶·°¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨l具有自己独立的未被干扰的进化历史 o这一特点无疑对查
明植物的进化历史具有无比的优越性 ∀
叶绿体微卫星是近年来发展起来的一种新的分子标记技术 ∀由于叶绿体基因不参加基因重组 o而
是直接来自父本的花粉 o所以对于研究针叶树种有着特殊的意义 ∀
在目前使用的绝大多数多态性分子标记系统中 o微卫星是变异率最高的k⁄¤¯ ¤¯¶ot||u ~• ¥¨¨µ ετ
αλ. , t||v ~⁄¬•¬¨±½² ετ αλ. ,t||w ~∞¯¯¨ ªµ¨± ot||xl ∀美加红松k Πινυσ ρεσινοσα „¬·ql在等位酶分析中没
有显示多态性kƒ²º µ¨ετ αλ. ,t|zz ; „¯¯ ±¨§²µ© ετ αλ. ot|{u ~≥¬°²± ετ αλ. ot|{y ~ ²¶¶¨¯¨ µετ αλ. ot||tl ∀
• „°⁄通常在针叶树中具有很高的多态性 o但是在美加红松中只表现出有限的遗传多样性k ²¶¶¨¯¨ µετ
¤¯ qot||u ~ ⁄¨ ∂ µ¨±² ετ αλ. ot||zl o通过微卫星发现了群体间的遗传多样性k∞¦«·ετ αλ. ot||{l ∀美加
红松的叶绿体基因多样性明显高于多数纯合的核基因 ∀而且通过叶绿体微卫星的研究认识到群体间
阶梯状单模式k«¤³¯²·¼³¨ ltl的变异分布 o有助于对物种进化历史的理解并据此制定出群体保存策略 ∀
tl关于 «¤³¯²·¼³¨ 的含义 }通过 °≤ • 对叶绿体 ⁄‘„扩增后得到的产物 o在 |x度下 v°¬±使双链打开k变性l o迅速放入冰屑盒中使双
链暂时不能结合k退火l o然后将这种打开了双链的叶绿体 ⁄‘„片段k微卫星l中分别加入标准大小的标记kxs otss otxs o和r或 uss¥³l o
加在 y h的变性 z  聚丙烯胶k°«¤µ°¤¦¬¤l上 o在 „ƒ ¤∏·²°¤·¬¦¶¨ ∏´¨ ±¦¨µk°«¤µ°¤¦¬¤l仪器上以 vx • 功率跑 {s °¬±o最后使用 ƒµ¤ª° ±¨·
¤±¤ª¨µ¶²©·º¤µ¨ √ µ¨¶¬²± t quk°«¤µ°¤¦¬¤l软件来分析产物片断的大小 ∀由于 «¤³¯²·¼³¨ 未见到国内权威的中文译名 o所以本文暂译为阶
梯状单模式k参见图 u和图 vl ∀
在杉木k Χυννινγηαµια λανχεολαταl的遗传变异研究中 o曾有学者做过部分群体的同工酶和 • „°⁄
方面的研究 ∀秃杉k Ταιωανια φλουσιαναl在分子标记方面的研究尚为空白 ∀本文的研究目的是应用叶
绿体微卫星这一新的分子标记技术来研究杉木和秃杉的遗传变异规律 ∀
t 材料与方法
111 ∆ΝΑ提取
分别从 x个杉木种源和 z个秃杉的天然群体中取 ⁄‘„ o每个群体分析了 tu ∗ vy粒种子 ∀采用了两种
⁄‘„提取方法 }¤l± ˜Œ„Š∞‘⁄‘„ ¤¨¶¼ °¯¤±·®¬·~¥l·«¨ ³µ²·²¦²¯ §¨√¨ ²¯³¨§¥¼ ⁄²¼¯¨¤±§⁄²¼¯¨kt||sl∀结
果证明两种方法获得相似数量和质量的 ⁄‘„ ∀由于后者较为经济而被采纳为主要方法 ∀
112 ∆ΝΑ的浓度测定
用 ‹²¨ ©¨µ⁄¼‘„ ±∏¤±·usss测定 ⁄‘„浓度 ∀从胚中提取的 ⁄‘„浓度在 s1x ∗ v1s Λª∀
113 ∆ΝΑ扩增
图 t 叶绿体微卫星的标准标记
ƒ¬ªqt ¦³≥≥• ¤®¨ µ∂
所有的 ⁄‘„都使用叶绿体微卫星 ⁄‘„进行扩增 ∀所有微卫星区
域都用单链核苷酸k„r×l来表示 ∀试验了各种不同的扩增条件k包括
温度 !循环次数和药品等l ∀通过试验获得的最佳扩增反应步骤k杉木
与秃杉相同l }x °¬± |x ε 变性 ~x °¬± {s ε 加入 פ´ 酶 ~ux次循环 o每次
循环包括 }t °¬± |w ε 变性 ot °¬± xs ε 退火 ot °¬± zu ε 适温延伸 ∀最
后在 zu ε 下延伸 { °¬±o使用了 ty种引物k∂ ±¨§µ¤°¬± ετ αλ. ,t||yl对
两个树种的 ⁄‘„ 进行扩增 o反应使用了如下药品k最终总体积为 ux
ˏl }
w种 §‘×°k每种 s qu ː l ~u1x °   ª≤ u¯ ~s1u ː 引物对 ~ts÷ 缓
冲液k°«¤µ°¤¦¬¤l ~ux±ª模板 ⁄‘„ ~t˜ ²© פ´ 聚合酶k°«¤µ°¤¦¬¤l ∀所
有的反应混和液的准备都是由 …¬²° ®¨ • ²µ®¶·¤·¬²± usss机器人自动完
成 o在 ׫¨ µ°¤¯ ¦¼¦¯ µ¨¶° µ¨®¬± ∞¯ ° µ¨°²§q|yss °≤ • 仪上完成扩增 ∀
114 扩增产物的鉴定
扩增产物的鉴定是通过 t h的琼脂糖电泳 o用溴化乙锭染色 o紫外
光灯下显影 !成像和打印照片 ∀叶绿体微卫星的 °≤ • 产物分子量通常
在 {s ∗ uss ¥³之间k图 tl o在标准分子量的标记k∂ l中通常介于第 u和
第 v集团之间 ∀只有 w种引物未出现扩增产物 ∀在其余的 tu种引物
中 o选择了扩增产物质量最好的 y种 o它们的产物通过电泳得到鉴定
k明显的单一带l ∀y种引物k°·tszx o°·ttss o°·tuxs o°·txus o°·yvzx o°·|wss o其代码含义见 ∂ ±¨§µ¤°¬±
ετ αλ. ot||yl用来研究 x个杉木种源和 z个秃杉群体 ∀
115 扩增产物大小的鉴定
在y种微卫星中分别加入标准大小的标记kxsotssotxso¤±§t|y ¥³lo加在 yh的变性 z 聚丙烯胶
k°«¤µ°¤¦¬¤l上 o在 „ƒ ¤∏·²°¤·¬¦¶¨ ∏´¨±¦¨µk°«¤µ°¤¦¬¤l仪器上以 vx • 功率跑 {s °¬±∀每个胶可加样 u ∗ v次 ∀
zw 第 v期 陈伯望等 }杉木和秃杉群体的叶绿体微卫星分析
图 u ≥¬½¬±ª的原理
ƒ¬ªqu ≥¬½¬±ª ° ¦¨«¤±¬¶°
左右两峰分别为 xs ¥³和 uss ¥³的标准标记 o中峰为微卫星
¨©·¤±§µ¬ª«·³¨¤®¶} °¤µ®¨ µ¶²©xs ¥³¤±§uss ¥³o
¦¨±·µ¤¯ ³¨¤®} °¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨ q
图 v ≥¬½¬±ª的分析结果
ƒ¬ªqv ≥¬½¬±ªµ¨¶∏¯·
使用 ƒµ¤ª°¨ ±·¤±¤ª¨µ¶²©·º¤µ¨ √¨ µ¶¬²±t1uk°«¤µ°¤¦¬¤l软
件来分析产物片断的大小k图 t ∗ vl∀
116 统计分析方法
有统计分析中 o每种单型模式k«¤³¯²·¼³¨¶l都被
看成是一个等位基因 ∀有效单型模式数量 }
νε = t/ ( Ε πuι)
无偏单型模式多样性 }
Ηε = [ ν/ ( ν − t)] (t − Ε πuι)
遗传距离 }
m∆uση = t[ ν( ν − t)/ u] #
t
Λ # Ε
ν
ι = t
Ε
ν
ϕ= (ι+t)
Ε
Λ
κ= t
| αικ
− αϕκ |
u
群体内单型模式多样性 σω o群体间遗传分化度
Ρστ按照 ≥¯ ¤·®¬±kt||xl的公式 ∀
分子变异等级分析k„  ’ ∂ „ o∞¬¦²©©¬¨µ ετ αλ. o
t||ul使用 ∆σηu 来衡量单型模式对间的距离 ∀用
5 ΧΤ !5 ΣΧ和 5 ΣΤ来表示种间 !种源间和种源内的遗传
分化度k∞¬¦²©©¬¨µετ αλ. ot||ul q
群体内个体间的成对单型变异 }
Ξιϕ(ι < ϕ) = Ε
Λ
κ= t
αικ − αϕκ
其中 αικ和 αϕκ是第 ι个个体和第 ϕ个个体在第 κ个单
型位点上的等位基因大小 ∀
统计分析使用 „µ¯¨ ∏´¬± ∂ t qt和 °‹ ≠Œ° ∂ v qx
软件进行 ∀
{w 林 业 科 学 vy卷
u 结果与分析
211 各种引物的扩增效果及 Ταθ 酶浓度对扩增效
果的影响
在 y种引物中 o扩增效果以 °·tszx和 °·|wss最好 o°·ttss和 °·yvzx中等 o而 °·tuxs和 °·txus较
弱k见图 w和图 xl ∀对 °·tuxs和 °·txus使用 u˜的 פ´ 酶可以显著地提高扩增效果k见表 tl ∀
表 1 Ταθ酶浓度对扩增效果的影响
Ταβ .1 Τηε ΠΧΡ εφφεχτ οφ Ταθ χονχεντρατιον
212 假象的排除
在 y个微卫星中 °·|wss因在多次试验中未检测到分子量大小而被排除 o初步认定其在电泳中显
示的亮带是由于引物片断引起的 ∀其余的 x个微卫星至少在种内群体间显示出了变异性 ∀
213 分子变异的层次分析(ΑΜΟς Α)结果
在 „µ¯¨ ∏´¬± t qt中设定杉木和秃杉为 u 个树种 o并构造树种 ) 种源 ) 种源内的层次结构进行
„  ’ ∂ „分析 o结果列于表 u ∀
表 2 分子变异的层次分析k„  ’ ∂ „l结果 ≠
Ταβ .2 Ηιεραρχηιχαλ αναλψσισ οφ µολεχυλαρ ϖαριανχε (ΑΜΟς Α)
变异来源
≥²∏µ¦¨ ²©√¤µ¬¤·¬²±
自由度
δ . φ .
总平方和
≥∏° ²©¶´∏¤µ¨¶
方差成份
∂¤µ¬¤±¦¨ ¦²°³²±¨ ±·¶
变异百分数
° µ¨¦¨±·¤ª¨ ²©√¤µ¬¤·¬²±
树种间 „ °²±ªªµ²∏³¶ t tvt{s q|{t txy q|yzwx ∂¤ ww qyw
树种内种源间
„ °²±ª³²³∏¯¤·¬²±¶º¬·«¬± ªµ²∏³¶ ts ut|vu qx|x t{t qy{|zt ∂ ¥ xt qyz
种源内 • ¬·«¬± ³²³∏¯¤·¬²±¶ tvu tztv qzxs tu q|{u|x ∂¦ v qy|
总计 ײ·¤¯ twv vy{uz qvuy vxt qywstu
≠修正指数 ƒ¬¬¤·¬²± Œ±§¬¦¨¶o 5 ΣΧ€ s .|vvvt , 5 ΣΤ € s .|yvs{ , 5 ΧΤ € s .wwyv| q
在 „  ’ ∂ „分析中 o方差变量的 ww1yw h来源于种间 oxt1yz h来源于树种内 o只有 v1y{ h来源于
种源内 ∀可见 o杉木和秃杉在种一级上的遗传变异用微卫星分析是很容易区分出来的 o同时 o在树种内
种源间存在着最大的变异来源 o而种源内部的遗传分化则相对很小 ∀
214 种间聚类分析
用 „µ¯¨ ∏´¬± t qt计算群体间的遗传距离k离差平方和法l o用 °‹ ≠Œ°v1x的 ‘∞ŒŠ‹…’ • 程序作
˜°Š  „聚类分析 o用 ⁄• „ • × • ∞∞作无根型系统聚类树k∏±µ²²·¨§³«¼¯ ²ª¨ ±¬¨¶l获得杉木与秃杉群体
的聚类分析图k图 yl ∀在图 y 中 o杉木k下半部的屏边 °¬±¥¬¤± !黎平 ¬³¬±ª!商城 ≥«¤±ª¦«¨ ±ª!江华
¬¤±ª«∏¤和全南 ±∏¤±±¤±l和秃杉kŠ„x !≠ ‘v !Š„t !⁄!⁄„x !± ±x和 ± ±zl的群体明显地被区分开来 ∀
其中 o杉木中的黎平种源在聚类树上有独特的位置 o与其优良种源的位置相合k全国杉木种源试验协作
组 ot||wl o而云南屏边种源与秃杉种源k多采自云南l最接近 o而其余 v个种源江西全南 !湖南江华和河
|w 第 v期 陈伯望等 }杉木和秃杉群体的叶绿体微卫星分析
sx 林 业 科 学 vy卷
图 y 杉木和秃杉微卫星的无根型聚类树
ƒ¬ªqy ˜±µ²²·¨§ ˜° Š„ ·µ¨¨²© Χυννινγηαµια
¤±§ Ταιωανια ³²³∏¯¤·¬²± ¥¤¶¨§²±¦³≥≥• §¬¶·¤±¦¨
南商城聚在另一边 ∀在秃杉群体中 o丹江林分
k⁄l因其为混合群体而单独为一枝 o而其余的群
体均为一个家系 o其中剑河种源k± ±x !± ±z !⁄„x
和 ⁄l聚在右边 o而雷山和其它 u 个云南种源
kŠ„t !Š„x和 ≠ ‘vl聚在左边 ∀
v 讨论与结论
ktl关于可用的引物种类 o本研究试验了 ty种 o其
中 y种有扩增反应 o在这 y种中 °·|wss在一般琼
脂糖电泳中显示了较强的扩增效果 o但在进一步
的产物分子量大小测定中却未能检测到 o初步认
定是由于引物的大小也正好和叶绿体微卫星大小
相同 o在琼脂糖电泳中被误认为是扩增产物 o而在
聚丙烯胶的在 „ƒ ¤∏·²°¤·¬¦¶¨ ∏´¨ ±¦¨µ上却未能
显现 ∀这种情况在杉木和秃杉的群体中都同时存
在 o但在本研究中每个群体一般只做了 tu 粒种
子 o应加大重复以作进一步的证实 ∀另外 o在这 ty
种引物中 o除了 y种有明显扩增现象外 o°·vyxx在 u˜浓度的 פ´ 酶条件下 o在部分群体也有部分扩增
效果 o可作进一步研究 ∀kul叶绿体微卫星比同工酶和 • „°⁄的变异性更大 ∀但这并不表明它们的进
化速度就更快 o而是因为它们来自于父本 o比核基因保存了更多的进化信息 ∀杉木和秃杉都是进化历
史悠久的树种 o将分子生物学的研究结果与常规田间试验研究的结果结合起来分析 o将有助于我们对
树种的进化历史有更全面的了解 o有利于制定合理的基因资源保存策略和育种策略 ∀全国杉木种源试
验研究对杉木种源的遗传变异已有较多的研究 o如黎平种源在全国的种源试验中属于优良种源k全国
杉木种源试验协作组 ot||wl o它在微卫星的聚类树中处于较独特的位置 o而云南屏边种源在聚类树上
与秃杉种源距离很近k秃杉种源多采自云南省和贵州省 o杉木和秃杉同属杉科 o自然地理分布基本相
同l o但是秃杉这一珍贵的孓遗濒危树种的种源试验才刚刚开始 o利用叶绿体微卫星的特性研究其遗传
变异中心k¥²··¯¨ ±¨ ¦®l对于群体保存和利用有着重要的意义 ∀本研究作为初步探索性研究 o获得了满意
的结果 ∀但是本次研究只分析了 x个杉木群种源和 z个秃杉群体 o最小的群体分析的样本数量为 tu
个 o获得的信息尚不足以对树种群体变异中心提出可靠的结论 ∀建议下一步的研究应加大研究群体数
量和每个群体的样本数量 o并将实验室分析与田间试验结果结合起来 o获得更加完善的研究结果 ∀
参 考 文 献
全国杉木种源试验协作组 q全国杉木地理种源试验专刊 q林业科学研究k专刊l ot||w }zk°¨°l
…∏¦¦¬Š o „±½¬§¨¬ o ¤§¤ª«¬¨¯¨ „ ετ αλ. ⁄¨ ·¨¦·¬²± ²©«¤³¯²·¼³¬¦√¤µ¬¤·¬²± ¤±§±¤·∏µ¤¯ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²±¬± ηαλεπενσισ2¦²°³¯ ¬¨ ³¬±¨ ¶³¨ ¦¬¨¶∏¶¬±ª
¦«¯²µ²³¯¤¶·¶¬°³¯¨¶¨ ∏´¨ ±¦¨ µ¨³¨ ¤·k≥≥• l ¤µ®¶o  ²¯ ¦¨∏¯¤µ∞¦²¯²ª¼ ot||{ oz }tyvv ∗ tywv
⁄¨ ∂ µ¨±² o  ²¶¶¨¯¨ µ„ qŠ ±¨¨ ·¬¦√¤µ¬¤·¬²±¬± µ¨§³¬±¨ k Πινυσρεσινοσα „¬·ql µ¨√ ¤¨¯ §¨¥¼ • „°⁄¤±§°„°⁄r• ƒ° ¤±¤¯¼¶¬¶q≤¤±¤§¬¤±²∏µ±¤¯ ²©
ƒ²µ¨¶·• ¶¨¨¤µ¦«qt||z ouz }tvty ∗ tvus
⁄²¼¯ ¨o⁄²¼¯ ¨qŒ¶²¯¤·¬²± ²© ³¯¤±·⁄‘„ ©µ²° ©µ¨¶«·¬¶¶∏¨ qƒ²¦∏¶ot||s otu }tv ∗ tx
∞¦«·≤ ≥ o ⁄¨ ∂ µ¨±² o „±½¬§¨¬  ετ αλ. ≤«¯²µ²³¯¤¶·°¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨¶µ¨√ ¤¨¯ ³²³∏¯¤·¬²± ª¨ ±¨ ·¬¦§¬√ µ¨¶¬·¼ ¬± µ¨§ ³¬±¨ q Πινυσ ρεσινοσα „¬·q
 ²¯ ¦¨∏¯¤µ∞¦²¯²ª¼ ot||{ oux }wx ∗ y|
±Œ„Š∞‘q⁄±¨ ¤¶¼ °¯ ¤±·¬±¬‹¤±§¥²²®©²µ⁄‘„ ¬¶²¯¤·¬²± ©µ²° ³¯¤±··¬¶¶∏¨ qt||z
∂ ±¨§µ¤°¬± Š Š o ¨¯¯¬o • ²¶¶¬° ετ αλ. „ ¶¨·²©³µ¬° µ¨¶©²µ·«¨ ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²©us ¦«¯²µ²³¯¤¶·°¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨¶¬± Πιναχεαε .  ²¯ ¦¨∏¯¤µ∞¦²¯²ª¼ o
t||y ox }x|x ∗ x|{
∂ ±¨§µ¤°¬± Š Š o¬¨ª¨ ±«¤ª¨ ± …q≤«¤µ¤¦·¨µ¬¶¤·¬²±¤±§¬±«¨µ¬·¤±¦¨ ²©³²¯¼°²µ³«¬¦³¯¤¶·¬§°¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨¶¬± Αβιεσ. Š ±¨²°¨ot||z ows }{xz ∗ {yw
∂ ±¨§µ¤°¬± Š Š o „±½¬§¨¬  o ¤§¤ª«¬¨¯¨ „ ετ αλ. ⁄¬¶·µ¬¥∏·¬²± ²© ª¨ ±¨ ·¬¦ §¬√ µ¨¶¬·¼ ¬± Πινυσ πιναστερ „¬·q ¤¶ µ¨√ ¤¨¯ §¨ ¥¼ ¦«¯²µ²³¯¤¶·
°¬¦µ²¶¤·¨¯ ¬¯·¨¶q ׫¨ µ² „³³¯ Š ±¨±·ot||{ o|z }wxy ∗ wyv
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