全 文 ：园艺学报，2015，42 (4)：791–798.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0975；http：//www. ahs. ac. cn 791
收稿日期：2014–12–18；修回日期：2015–03–24
基金项目：中央高校基本科研业务费专项基金项目（DL13CA13）；国家基础科学人才培养基金项目（J1210053）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lanxingguo@126.com）
羽衣甘蓝 ARC1 与 Exo70A1 蛋白相互作用结构
域的分析与鉴定
曹明明，杨 佳，李晓屿，李玉花，蓝兴国*
（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）
摘 要：为阐明羽衣甘蓝自交不亲和信号传递因子 ARC1 与下游底物 Exo70A1 相互作用的结构域，
利用酵母双杂交系统进行检测与分析。将羽衣甘蓝 BoARC1、BoARC1-N 端（1 ~ 279 aa，含有 UND 结构
域）及 BoARC1-C 端（280 ~ 663 aa，含有 U-box 结构域和 Arm repeat 结构域）的序列分别构建到 pGBKT7
载体中，获得 BD-ARC1、BD-ARC1-N 和 BD-ARC1-C 重组质粒。将羽衣甘蓝 BoExo70A1、BoExo70A1-Δ1
（1 ~ 85 aa）、Exo70A1-Δ2（1 ~ 270 aa）及 Exo70A1-Δ3（271 ~ 638 aa，含有 Exo70 结构域）的序列分别
构建到 pGADT7 载体中，获得 AD-Exo70A1、AD-Exo70A1-Δ1、AD-Exo70A1-Δ2 和 AD-Exo70A1-Δ3 重
组质粒。将获得的重组质粒分别共转化到酵母 Y187 菌株中，在双缺陷（-Leu-Trp）酵母培养基中培养与
生长。β-gal 显色检测结果表明，共转 BD-ARC1-N/BoExo70A1-Δ1 或 BD-ARC1-N/BoExo70A1-Δ2 的酵母
在滤纸上显示蓝色，这说明 BoARC1 的 N 端与 BoExo70A1 的 N 端介导了两者的相互作用。
关键词：羽衣甘蓝；自交不亲和性；ARC1；Exo70A1；结构域
中图分类号：S 681.9 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）04-0791-08

Analysis and Characterization of Interaction Domain Between ARC1 and
Exo70A1 from Ornamental Kale（Brassica oleracea var. acephala）
CAO Ming-ming，YANG Jia，LI Xiao-yu，LI Yu-hua，and LAN Xing-guo*
（College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）
Abstract：The yeast-two hybrid system was used to detect the interaction between ARC1 and
Exo70A1 from ornamental kale（Brassica oleracea var. acephala）. The nucleotide sequences of full-length
BoARC1，N terminal of BoARC1（1–279 aa，UND domain），C terminal of BoARC1（280–663 aa，
U-box domain and Arm repeat domain）were constructed into the vector pGBKT7，respectively. Thus，the
plasmids BD-ARC1，BD-ARC1-N or BD-ARC1-C were obtained and confirmed. On the other hand，the
nucleotide sequences of full-length BoExo70A1，BoExo70A1-Δ1（1–85 aa），Exo70A1-Δ2（1–270 aa），
Exo70A1-Δ3（271–638 aa，Exo70 domain）were constructed into the vector pGADT7，respectively. And
the plasmids AD-Exo70A1，AD-Exo70A1-Δ1，AD-Exo70A1-Δ2 or AD-Exo70A1-Δ3 were also obtained
and confirmed. These plasmids were used to co-transform yeast strain Y187，which were then plated onto
SD/-Leu-Trp（synthetic dropout glucose agar plates lacking leucine and tryptophan）. The β-galactosidase

Cao Ming-ming，Yang Jia，Li Xiao-yu，Li Yu-hua，Lan Xing-guo.
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assays showed that yeast cells co-transformed with the BoARC1-N/AD-Exo70A1-Δ1 plasmids or
BoARC1-N/BD-Exo70A1-Δ2 plasmids turned blue. These results indicated that N terminal of BoARC1
and BoExo70A1 mediated interaction between BoARC1 and BoExo70A1.
Key words：Brassica oleracea var. acephala；self-incompatibility；ARC1；Exo70A1；domain

自交不亲和性（Self-incompatibility，SI）是指正常可育的雌雄同株植物自交授粉之后，自我花
粉（花粉管）与雌蕊细胞（柱头、花柱或胚珠细胞）之间进行信号识别和传递，使显花植物能够识
别自我和非我的花粉（花粉管），导致自我花粉（花粉管）不能够正常萌发和生长的过程，最终导致
植株不能产生种子（de Nettancourt，2001；Franklin-Tong，2008）。
芸薹属自交不亲和植物是研究显花植物 SI 的模式植物（Zhang et al.，2009；Iwano & Takayama，
2012）。SI 的识别和反应的特异性是 S 位点富含半胱氨酸蛋白 SCR（S-locus cysteine-rich protein）/SP11
（S-locus protein 11）配体和 S 位点受体激酶 SRK（S-receptor kinase）受体特异性相互作用引起的
（Kachroo et al.，2001；Takayama et al.，2001）。SCR/SP11 配体是一个低分子量并富含半胱氨酸的
分泌蛋白，决定花粉的 SI（Schopfer et al.，1999；Takayama et al.，2000）。SRK 受体具有 3 个结构
域：胞外域、跨膜结构域和胞内激酶域，控制柱头乳突细胞的 SI（Goring et al.，1992；Takasaki et al.，
2000）。当花粉落到柱头表面之后，花粉中的 SI 信号分子 SCR/SP11 转运到柱头乳突细胞的表面，
被受体 SRK 的胞外域识别，并引起 SRK 胞内域的磷酸化，通过下游的信号传递来完成 SI 反应
（Cabrillac et al.，2001；Ivanov et al.，2010；Indriolo & Goring，2014）。
目前，ARC1（Arm repeat containing 1）和 M 位点蛋白激酶（M locus protein kinase，MLPK）
被认为是 SRK 下游传递因子（Indriolo & Goring，2014）。MLPK 是一个只含有胞内丝氨酸/苏氨酸
蛋白激酶结构域的蛋白，属于类受体胞质蛋白激酶（Receptor-like cytoplasmic kinase，RLCK）家族
中的成员（Murase et al.，2004；Kakita et al.，2007）。芜菁（Brassica rapa）隐性突变体（mlpk/mlpk）
具有彻底打破柱头 SI 的现象（Murase et al.，2004）。MLPK 能够与 SRK 相互作用，并且 SRK 能够
磷酸化 MLPK（Kakita et al.，2007）。因此认为，类受体胞质蛋白激酶 MLPK 与受体蛋白激酶 SRK
形成 SI 信号复合体。ARC1 是含有 U-box 结构域和 ARM 结构域一类的蛋白质，被认为是 SI 信号复
合体下游的传递因子（Stone et al.，2003）。ARC1 与 SRK 激酶域相互作用，并且能够被 SRK 激酶
域磷酸化（Gu et al.，1998；蓝兴国 等，2011）。ARC1 具有依赖 U-box 功能域的 E3 连接酶活性，
而且在不亲和授粉的柱头蛋白质泛素化水平有特异性地增加（Stone et al.，2003）。在转基因试验中，
油菜（Brassica napus）BnARC1 反义基因的植株有部分打破 SI 的现象（Stone et al.，1999；Indriolo et
al.，2012），而且在拟南芥植株中转入油菜 BnARC1 或琴叶拟南芥（Arabidopsis lyrata）AlARC1 能够
恢复 SI（Indriolo et al.，2014）。
Exo70A1是以ARC1为诱饵筛选油菜柱头 cDNA文库，得到一个与ARC1相互作用的蛋白（Samuel
et al.，2009）。在体外泛素化研究中，Exo70A1 能够被 ARC1 泛素化，这说明 Exo70A1 可能是 SI 信号
传递过程中被降解的底物（Samuel et al.，2009）。过量表达 Exo70A1 的植株具有部分打破 SI 的现象；
并且 Exo70A1 功能丧失的植株干扰了亲和花粉管的生长，这表明 Exo70A1 在 SI 反应及促进亲和花粉
的水和、萌发和花粉管延伸的过程中起到重要作用（Samuel et al.，2009；Safavian & Goring，2013）。
作者已从羽衣甘蓝自交不亲和系（S13-bS13-b）中分离出了 BoARC1 与 BoExo70A1 基因，并进行
了序列与表达分析（蓝兴国 等，2011；杨佳 等，2012）。在本研究中，拟利用酵母双杂交系统分析
BoARC1 与 BoExo70A1 相互作用的结构域，为进一步探讨二者在 SI 上的作用提供更多的线索。
曹明明，杨 佳，李晓屿，李玉花，蓝兴国.
羽衣甘蓝 ARC1 与 Exo70A1 蛋白相互作用结构域的分析与鉴定.
园艺学报，2015，42 (4)：791–798. 793

1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2012 年 9 月至 2013 年 12 月在东北林业大学生命科学学院发育生物学实验室完成。羽
衣甘蓝自交不亲和系（S13-bS13-b）由东北林业大学花卉生物工程研究所提供。
KOD-plus Taq DNA 聚合酶、Blend Taq DNA 聚合酶、dNTP、T4 DNA 连接酶、rATP 购自东洋
纺（Toyobo）生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker、EcoRⅠ、NdeⅠ、XhoⅠ限制性内切酶购于
大连宝生物（TaKaRa）公司；Top10 感受态细胞、普通质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司。
载体：pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-T；Y187 酵母菌株；YPD
培养基、YPD agar 培养基、Minimal SD agar base、-Leu/-Trp DO supplement、鲑精 DNA 购于 Clontech
公司；β–巯基乙醇（β-ME）、PEG3350、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、LiAC 购于
Sigma 公司；X-β-gal 购于 Amresco 公司；硫酸腺（adenine hemisulfate）购于 Fluka 公司。
1.2 BoARC1 与 BoExo70A1 蛋白结构域的分析
BoARC1 与 BoExo70A1 的氨基酸序列递交到 NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）保守结
构域数据库 CDD（Conserved Domain Database）进行检索和分析（Marchler-Bauer et al.，2011）。
1.3 BoARC1 酵母表达质粒的构建
以 pGEM-BoARC1 质粒为模板（蓝兴国 等，2011），以 BD-ARC1-F1/BD-ARC1-R1、BD-ARC1-F1/
BD-ARC1-R279、BD-ARC1-F280/BD-ARC1-R1 为引物对（表 1），分别扩增编码 BoARC1、BoARC1-N
端（1 ~ 279 aa，含有 UND 结构域）及 BoARC1-C 端（280 ~ 663 aa，含有 U-box 结构域和 ARM 结
构域）的编码区序列。PCR 反应采用 KOD-plus Taq DNA 聚合酶，扩增条件为 94 ℃变性 15 s，55 ℃
退火 30 s，68 ℃延伸 1 ~ 2 min，共 30 个循环后，72 ℃延伸 7 min。PCR 产物回收、NdeⅠ和 EcoRⅠ
双酶切后，构建到 pGBKT7 载体中。连接产物转化大肠杆菌 Top10。质粒经 PCR 和双酶切鉴定正确
后，进行 DNA 序列分析，获得 BD-ARC1、BD-ARC1-N 和 BD-ARC1-C 重组质粒。

表 1 羽衣甘蓝 BoARC1 和 BoExo70A1 克隆所用引物
Table 1 Primers used to clone analysis of BoARC1 and BoExo70A1 from ornamental kale
引物名称
Primer name
引物序列（5′–3′）
Primer sequences
限制性内切酶
Restriction enzymes
重组质粒
Plasmids
BD-ARC1-F1 GGAATTCCATATGGCCACTGATTCAGCAATGTTC NdeⅠ
BD-ARC1-R1 CAGAATTCTTATCTCTGTGTTTTCTGGTCGC EcoRⅠ
BD-ARC1
BD-ARC1-F1 GGAATTCCATATGGCCACTGATTCAGCAATGTTC NdeⅠ
BD-ARC1-R279 CAGAATTCTTAAAGCGTTGTAAACGTGTTC EcoRⅠ
BD-ARC1-N
BD-ARC1-F280 GGAATTCCATATGCCAAAGGATTTCATCTGC NdeⅠ
BD-ARC1-R1 CAGAATTCTTATCTCTGTGTTTTCTGGTCGC EcoRⅠ
BD-ARC1-C
AD-Exo70-F1 GGAATTCCATATGGCCGTCGATAGCGGAATG NdeⅠ
AD-Exo70-R1 GCGCTCGAGTTACCGTCGTGGTTCATTCATA XhoⅠ
AD-Exo70A1
AD-Exo70-F1 GGAATTCCATATGGCCGTCGATAGCGGAATG NdeⅠ
AD-Exo70-R85 GCGCTCGAGTTACTGACGGAGGAGATCAAACTGA XhoⅠ
AD-Exo70A1-Δ1
AD-Exo70-F1 GGAATTCCATATGGCCGTCGATAGCGGAATG NdeⅠ
AD-Exo70-R270 GCGCTCGAGTTACCAATTTCCAATTTTGGCC XhoⅠ
AD-Exo70A1-Δ2
AD-Exo70-F271 GGAATTCCATATGATCCATTTCATGCGCATTGC NdeⅠ AD-Exo70A1-Δ3
AD-Exo70-R1 GCGCTCGAGTTACCGTCGTGGTTCATTCATA XhoⅠ

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1.4 BoExo70A1 酵母表达质粒的构建
以 pGEM-BoExo70A1 质粒为模板（杨佳 等，2012），以 AD-Exo70-F1/AD-Exo70-R1、AD-Exo70-
F1/AD-Exo70-R85、AD-Exo70-F1/AD-Exo70-R270、AD-Exo70-F271/AD-Exo70-R1 为引物（表 1），分
别扩增编码 BoExo70A1、BoExo70A1-Δ1（1 ~ 85 aa）、Exo70A1-Δ2（1 ~ 270 aa）及 Exo70A1-Δ3（271 ~
638 aa）的编码区序列。PCR 反应采用 KOD-plus Taq DNA 聚合酶，扩增条件为 94 ℃变性 15 s，55 ℃
退火 30 s，68 ℃延伸 1 ~ 2 min，30 个循环；72 ℃延伸 7 min。PCR 产物回收、NdeⅠ和 XhoⅠ双酶切
后构建到 pGADT7 载体中。连接产物转化大肠杆菌 Top10。质粒经 PCR 和双酶切鉴定正确后，进行
DNA 序列分析，获得 AD-Exo70A1、AD-Exo70A1-Δ1、AD-Exo70A1-Δ2 和 AD-Exo70A1-Δ3 重组质粒。
1.5 酵母感受态的制备及质粒共转
参考 Clontech 公司的 GAL4 Two-Hybrid System 3 系统的说明书。主要的步骤如下：在 YPDA
平板上划线 Y187 酵母菌种，30 ℃培养 3 ~ 4 d，直至出现克隆。挑取直径约 2 ~ 3 mm 的酵母克隆接
种到 1 mL YPDA 液体培养基中，剧烈振荡使细胞凝块均匀分散。将细胞转移到含有 50 mL YPDA
液体培养基的锥形瓶中，30 ℃，250 r · min-1，振荡孵育 16 ~ 18 h，直到稳定期（OD600 > 1.5）。将
适当培养物转移到含有 300 mL YPDA 液体培养基的椎形瓶中，使其 OD600 到达 0.2 ~ 0.3。30 ℃，
230 r · min-1，振荡孵育 3 h，使其 OD600 达到 0.4 ~ 0.6。将细胞转移到数个 50 mL 离心管中，室温离
心，1 000 × g，离心 5 min。弃去上清液，用消毒 H2O 重悬、清洗细胞，并收集细胞至一个管中。
室温，1000 × g，离心 5 min，弃上清液。加入 1.5 mL 新鲜配置的无菌的 1× TE/1× LiAc 重悬细胞。
在每个 1.5 mL 管中，加入各 0.1 μg 需要转染的质粒、0.1 mg 鲑精 DNA，分装 100 µL 新鲜配制的酵
母感受态细胞，轻柔混匀。在每个管中，加入 600 μL 的 1× PEG/1× LiAc，高速震荡混匀。30 ℃，
200 r · min-1，振荡孵育 30 min。在每个管中，加入 70 μL 的 DMSO，温和颠倒混匀，不振荡。42 ℃
热激 15 min。置于冰上 1 ~ 2 min。室温，14 000 r · min-1，离心 5 s，移去上清液，加入 100 μL 的 1×
TE 重悬细胞。涂布于 SD/glucose（-Leu-Trp）平板上，30 ℃倒置平板培养 3 ~ 4 d。
1.6 滤纸转移法检测 β–半乳糖苷酶的分泌
待酵母菌落长到直径 2 ~ 3 mm 大小时，取大小合适无菌的 Whatman 滤纸覆盖在酵母板上。待
滤纸被琼脂板上的水分基本浸湿后，揭下滤纸在液氮中速冻 13 s。将新配制 Z-buffer/X-β-gal 溶液滴
在另一无菌的 Whatman 滤纸上，并完全浸湿滤纸。将附着有酵母克隆的滤纸（有细胞的一面朝上）
放在浸有 Z-buffer/X-β-Gal 的滤纸上，注意不要产生气泡。在室温孵育 2 h 内，显蓝色为阳性结果。
2 结果与分析
2.1 BoARC1 结构域分析及酵母表达质粒的构建
BoARC1 是一个含有 663 氨基酸的蛋白。通过结构域（图 1）分析发现，BoARC1 含有 N 端 UND
结构域（1 ~ 279 aa）、中间 U-box 结构域（280 ~ 347 aa）和 C 端 ARM 结构域（380 ~ 488 aa）。



图 1 羽衣甘蓝 BoARC1 结构域示意图
Fig. 1 Domain structure diagram of BoARC1
曹明明，杨 佳，李晓屿，李玉花，蓝兴国.
羽衣甘蓝 ARC1 与 Exo70A1 蛋白相互作用结构域的分析与鉴定.
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图 2 羽衣甘蓝 BoARC1（a）、BoARC1-N（b）与
BoARC1-C（c）的 PCR 扩增产物
Fig. 2 PCR products of BoARC1（a），BoARC1-N（b）
and BoARC1-C（c）
图 4 羽衣甘蓝 BoExo70A1（a）、BoExo70A1-Δ1（b）、Exo70A1-Δ2
（c）与 Exo70A1-Δ3（d）的 PCR 扩增产物
Fig. 4 PCR products of BoExo70A1（a），BoExo70A1-Δ1（b），
Exo70A1-Δ2（c）and Exo70A1-Δ3（d）
为了进一步分析 BoARC1 的结构域功能，
分别以 BD-ARC1-F1/BD-ARC1-R1、BD-ARC1-
F1/BD-ARC1-R279、BD-ARC1-F280/BD-ARC1-R1
为引物对，扩增 BoARC1 全长、BoARC1-N 端
（1 ~ 279 aa）及 BoARC1-C 端（280 ~ 663 aa）
的编码区序列，大小分别为 1 989、837 和 1 152
bp（图 2）。将获得的 PCR 产物克隆到酵母质粒
pGBKT7，分别获得 BD-ARC1、BD-ARC1-N 和
BD-ARC1-C 重组质粒。
2.2 BoExo70A1 结构域分析及酵母表达质粒的构建
羽衣甘蓝 BoExo70A1 是一个含有 638 氨基酸的蛋白。通过结构域分析发现，BoExo70A1 蛋白
的 C 末端（271 ~ 627 aa）含有一个典型的 Exo70 结构域（图 3）。



图 3 羽衣甘蓝 BoExo70A1 结构域示意图
Fig. 3 Domain structure diagram of BoExo70A1

进一步分析 BoExo70A1 的结构域功能，分
别以 AD-Exo70-F1/AD-Exo70-R1、AD-Exo70-
F1/AD-Exo70-R85、AD-Exo70-F1/AD-Exo70-R270、
AD-Exo70-F271/AD-Exo70-R1 为引物对，扩增
编码 BoExo70A1、BoExo70A1-Δ1（1 ~ 85 aa）、
Exo70A1-Δ2（1 ~ 270 aa）及 Exo70A1-Δ3（271 ~
638 aa，含有 Exo70 结构域）的编码区序列，
大小为 1 914、265、810 和 1 104 bp（图 4）。
将获得的 PCR 产物，克隆到酵母质粒 pGADT7，分别获得 AD-Exo70A1、AD-Exo70A1-Δ1、
AD-Exo70A1-Δ2 和 AD-Exo70A1-Δ3 重组质粒。
2.3 BoARC1 与 BoExo70A1 相互作用结构域分析
为了分析 BoARC1 与 BoExo70A1 的相互作用，将获得的 BD-ARC1、BD-ARC1-N 和 BD-ARC1-C
质粒分别与 AD-Exo70A1、AD-Exo70A1-Δ1、AD-Exo70A1-Δ2 和 AD-Exo70A1-Δ3 质粒共转化到 Y187
酵母菌株。共转化的酵母在双缺陷（-Leu-Trp）培养基中培养和生长 3 ~ 4 d，通过-gal 显色进行检
验和分析。图 5 的结果表明，共转阳性对照质粒 pGBKT7-53/pGADT7-T 的酵母细胞，酵母在滤纸
上显示出蓝色；共转阴性对照质粒 pGBKT7-Lam/pGADT7-T 的酵母细胞没有变成蓝色。共转
BD-ARC1 或 BD-ARC1-C 与 BoExo70A1、BoExo70A1-Δ1、BoExo70A1-Δ2 和 BoExo70A1-Δ3 的酵
母在滤纸上没有显示蓝色。而共转 BD-ARC1-N/BoExo70A1-Δ1 或 BD-ARC1-N/BoExo70A1-Δ2 的酵
母在滤纸上显示出蓝色，其它与 BD-ARC1-N 的组合也没有显示出蓝色（图 5）。这说明 BoARC1 的
N 端与 BoExo70A1 的 N 端介导了两者的相互作用。
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图 5 利用酵母双杂交检测 BoARC1 与 BoExo70A1 的相互作用
pGBKT7-53/pGADT7-T 和 pGBKT7-Lam/pGADT7-T 质粒共转到酵母细胞中，分别作为阳性和阴性对照。
Fig. 5 Interaction analysis between BoARC1 and BoExo70A1 in the yeast two-hybrid system
Combinations of pGBKT7-53/pGADT7-T and pGBKT7-Lam/pGADT7-T were the positive and
negative controls，respectively.
3 讨论
本研究中通过对羽衣甘蓝 BoARC1 的结构域进行分析，发现 BoARC1 主要含有 UND 结构域、
U-box 结构域和 ARM 结构域。这与油菜 BnARC1 和琴叶拟南芥 AlARC1 有相似的蛋白质结构域组
成（Gu et al.，1998；Stone et al.，2003；Indriolo et al.，2014）。ARC1 的 ARM 结构域特异地与 SRK
的激酶域结合，介导 SI 信号的传递（Gu et al.，1998；Stone et al.，2003）。U-box 结构域是一类具
有 E3 泛素连接酶活性的结构域（Hatakeyama & Nakayama，2003）；并且在体外试验中表明，BnARC1
和 BoARC1 具有依赖 U-box 功能域的 E3 连接酶活性（Stone et al.，2003；蓝兴国 等，2013）。UND
结构域位于 BoARC1 的 N 端，被认为是与下游底物结合的区域。
Exo70A1 是植物 Exo70 蛋白家族的成员之一，参与调控细胞胞吐和囊泡转运，在导管发育、细
胞板形成、种皮粘液的形成及柱头—花粉间相互作用等方面具有重要的生物学作用（Synek et al.，
2006；Kulich et al.，2010；Samuel et al.，2009；Li et al.，2010，2013；Safavian & Goring，2013；Zárský
et al.，2013；Safavian et al.，2014）。在本试验中，通过结构域分析发现羽衣甘蓝 BoExo70A1 蛋白
曹明明，杨 佳，李晓屿，李玉花，蓝兴国.
羽衣甘蓝 ARC1 与 Exo70A1 蛋白相互作用结构域的分析与鉴定.
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的 C 末端（271 ~ 627 aa）含有一个典型的 Exo70 结构域（图 3）。在酵母中，Exo70 结构域能够与
Rho3 GTPase 发生相互作用，介导细胞的极性运输（Robinson et al.，1999）。BoExo70A1 蛋白的 N
末端（1 ~ 270 aa）并没有发现典型的结构域，但这部分结构可能参与蛋白质间相互作用。
在油菜 SI 信号转导研究中，以 BnARC1 的 UND 结构域为诱饵筛选油菜柱头 cDNA 文库，获得
与 BnARC1 相互作用的蛋白 BnExo70A1（BoExo70A1-Δ1，1 ~ 85 aa）（Samuel et al.，2009）。然而，
对 ARC1 与 Exo70A1 相互作用的结构域未进行全面分析。在本研究中，将羽衣甘蓝 BoARC1、
BoARC1-N 端及 BoARC1-C 端分别与 BoExo70A1、BoExo70A1-Δ1、Exo70A1-Δ2 及 Exo70A1-Δ3 进
行蛋白质相互作用的检测。BoARC1 的 N 端 UND 结构域能够与 BoExo70A1 的 N 端结构域
（BoExo70A1-Δ1、BoExo70A1-Δ2）发生相互作用。这说明两者间的 N 端介导了相互作用，这个结
果与油菜中获得的 BnARC1 与 BnExo70A1 相互作用的结果一致。然而并没有检测到 BoARC1 的全
长与 BoExo70A1 的全长发生相互作用。在体外的泛素化试验及转基因试验已经证明了 BnExo70A1
是 BnARC1 的下游底物，并且参与了 SI 反应（Samuel et al.，2009）。这说明在酵母系统中 ARC1 与
Eo70A1 两者间可能存在阻碍两者相互作用的区域，可能受到其他因子的修饰调控。下一步的研究
主要是进一步分析 Exo70A1 与 ARC1 在植物体内的信号复合体及其相互作用的调控机制。

References
Cabrillac D，Cock J M，Dumas C，Gaude T. 2001. The S-locus receptor kinase is inhibited by thioredoxins and activated by pollen coat proteins.
Nature，410：220–223.
de Nettancourt D. 2001. Incompatibility and incongruity in wild and cultivated plants. Berlin：Springer-Verlag.
Franklin-Tong V E. 2008. Self-incompatibility in flowering plants：Evolution，diversity and mechanisms. Berlin：Springer-Verlag.
Goring D R，Rothstein S J. 1992. The S-locus receptor kinase gene in a self-incompatible Brassica napus line encodes a functional serine/threonine
kinase. Plant Cell，4：1273–1281.
Gu T，Mazzurco M，Sulaman W，Matias D D，Goring D. 1998. Binding of an arm repeat protein to the kinase domain of the S-locus receptor kinase.
Proc Natl Acad Sci USA，95：382–387.
Hatakeyama S，Nakayama K I. 2003. U-box proteins as a new family of ubiquitin ligases. Biochem Biophys Res Commun，302：635–645.
Indriolo E，Goring D R. 2014. A conserved role for the ARC1 E3 ligase in Brassicaceae self-incompatibility. Front Plant Sci，5：181.
Indriolo E，Safavian D，Goring D R. 2014. The ARC1 E3 ligase promotes two different self-pollen avoidance traits in Arabidopsis. Plant Cell，26：
1525–1543.
Indriolo E，Tharmapalan P，Wright S I，Goring D R. 2012. The ARC1 E3 ligase gene is frequently deleted in self-compatible Brassicaceae species
and has a conserved role in Arabidopsis lyrata self-pollen rejection. Plant Cell，24：4607–4620.
Ivanov R，Fobis-Loisy I，Gaude T. 2010. When no means no：Guide to Brassicaceae self-incompatibility. Trends Plant Sci，15：387–394.
Iwano M，Takayama S. 2012. Self/non-self discrimination in angiosperm self-incompatibility. Curr Opin Plant Biol，15：78–83.
Kachroo A，Schopfer C R，Nasrallah M E，Nasrallah J B. 2001. Allele-specific receptor-ligand interactions in Brassica self-incompatibility. Science，
293：1824–1826.
Kakita M，Murase K，Iwano M，Matsumoto T，Watanabe M，Shiba H，Isogai A，Takayama S. 2007. Two distinct forms of M-locus protein kinase
localize to the plasma membrane and interact directly with S-locus receptor kinase to transduce self-incompatibility signaling in Brassica rapa.
Plant Cell，1912：3961–3973.
Kulich I，Cole R，Drdova E，Cvrckova F，Soukup A，Fowler J，Zarsky V. 2010. Arabidopsis exocyst subunits SEC8 and EXO70A1 and exocyst
interactor ROH1 are involved in the localized deposition of seed coat pectin. New Phytol，188 (2)：615–625.
Lan Xing-guo，Li Xiao-yu，Yang Jia，Li Yu-hua. 2013. Prokaryotic expression，purification and in vitro ubiquitination assay of BoARC1 from
ornamental kale. Acta Horticulturae Sinica，40 (12)：2472–2478. (in Chinese)
Cao Ming-ming，Yang Jia，Li Xiao-yu，Li Yu-hua，Lan Xing-guo.
Analysis and characterization of interaction domain between ARC1 and Exo70A1 from ornamental kale（Brassica oleracea var. acephala）.
798 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (4)：791–798.
蓝兴国，李晓屿，杨 佳，李玉花. 2013. 羽衣甘蓝 ARC1 蛋白的原核表达、纯化及泛素连接酶活性分析. 园艺学报，40 (12)：2472–2478.
Lan Xing-guo，Yang Jia，Zhao Xin，Li Yu-hua. 2011. Isolation，expression of ARC1 from ornamental kale and interaction analysis between ARC1
and SRK. Acta Horticulturae Sinica，38（12）：2342–2348. (in Chinese)
蓝兴国，杨 佳，赵 昕，李玉花. 2011. 羽衣甘蓝 ARC1 的基因分离、表达及与 SRK 相互作用的分析. 园艺学报，38 (12)：2342–2348.
Li S，Chen M，Yu D，Ren S，Sun S，Liu L，Ketelaar T，Emons A M，Liu C M. 2013. EXO70A1-mediated vesicle trafficking is critical for tracheary
element development in Arabidopsis. Plant Cell，25：1774–1786.
Li S，van Os G M，Ren S，Yu D，Ketelaar T，Emons A M，Liu C M. 2010. Expression and functional analyses of EXO70 genes in Arabidopsis
implicate their roles in regulating cell type-specific exocytosis. Plant Physiol，154 (4)：1819–1830.
Marchler-Bauer A，Lu S，Anderson J B，Chitsaz F，Derbyshire M K，DeWeese-Scott C，Fong J H，Geer L Y，Geer R C，Gonzales N R，Gwadz
M，Hurwitz D I，Jackson J D，Ke Z，Lanczycki C J，Lu F，Marchler G H，Mullokandov M，Omelchenko M V，Robertson C L，Song J
S，Thanki N，Yamashita R A，Zhang D，Zhang N，Zheng C，Bryant S H. 2011. CDD：A Conserved domain database for the functional annotation
of proteins. Nucleic Acids Res，39：D225–9. DOI：10.1093/nar/gkq1189.
Murase K，Shiba H，Iwano M，Entani T，Che F S，Satta Y，Ito A，Watanabe M，Isogai A，Takayama S. 2004. A membrane-anchored protein kinase
involved in Brassica self-incompatibility signaling. Science，303：1516–1519.
Robinson N G，Guo L，Imai J，Toh-E A，Matsui Y，Tamanoi F. 1999. Rho3 of Saccharomyces cerevisiae，which regulates the actin cytoskeleton
and exocytosis，is a GTPase which interacts with Myo2 and Exo70. Mol Cell Biol，19 (5)：3580–3587.
Safavian D，Goring D R. 2013. Secretory activity is rapidly induced in stigmatic papillae by compatible pollen，but inhibited for self-incompatible
pollen in the Brassicaceae. PLoS ONE，8：e84286.
Safavian D，Jamshed M，Sankaranarayanan S，Indriolo E，Samuel M A，Goring D R. 2014. High humidity partially rescues the Arabidopsis thaliana
exo70A1 stigmatic defect for accepting compatible pollen. Plant Reprod，27：121–127.
Samuel M A，Chong Y T，Haasen K E，Aldea-Brydges M G，Stone S L，Goring D R. 2009. Cellular pathways regulating responses to compatible
and self-incompatible pollen in Brassica and Arabidopsis stigmas intersect at Exo70A1，a putative component of the exocyst complex. Plant
Cell，21：2655–2671.
Schopfer C R，Nasrallah M E，Nasrallah J B. 1999. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science，286：1697–1700.
Stone S L，Anderson E M，Mullen R T，Goring D R. 2003. ARC1 is an E3 ubiquitin ligase and promotes the ubiquitination of proteins during the
rejection of self-incompatible Brassica pollen. Plant Cell，15：885–898.
Stone S L，Arnoldo M，Goring D R. 1999. A breakdown of Brassica self-incompatibility in ARC1 antisense transgenic plants. Science，286：1729–1731.
Synek L，Schlager N，Eliás M，Quentin M，Hauser M T，Zárský V. 2006. AtEXO70A1，a member of a family of putative exocyst subunits specifically
expanded in land plants，is important for polar growth and plant development. Plant J，48 (1)：54–72.
Takasaki T，Hatakeyama K，Suzuki G，Watanabe M，Isogai A，Hinata K. 2000. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica
stigma. Nature，403：913–916.
Takayama S，Shiba H，Iwano M，Shimosato H，Che F S，Kai N，Watanabe M，Suzuki G，Hinata K，Isogai A. 2000. The pollen determinant of
self-incompatibility in Brassica campestris. Proc Natl Aca Sci USA，97：1920–1925.
Takayama S，Shimosato H，Shiba H，Funato M，Iwano M，Che F S，Watanabe M，Iwano M，Isogai A. 2001. Direct ligand-receptor complex
interaction controls Brassica self-incompatibility. Nature，413：534–538.
Yang Jia，Lan Xing-guo，Hao Ai-xin，Li Yu-hua. 2012. Isolation and expression analysis of Exo70A1 of ornamental kale. Acta Horticulturae Sinica，
39 (1)：127–135. (in Chinese)
杨 佳，蓝兴国，郝艾馨，李玉花. 2012. 羽衣甘蓝 Exo70A1 基因的分离及表达分析. 园艺学报，39 (1)：127–135.
Zárský V，Kulich I，Fendrych M，Pečenková T. 2013. Exocyst complexes multiple functions in plant cells secretory pathways. Curr Opin Plant Biol，
16 (6)：726–733.
Zhang Y J，Zhao Z H，Xue Y B. 2009. Roles of proteolysis in plant self-incompatibility. Annu Rev Plant Bio，60：21–42.