全 文 ：园艺学报，2015，42 (7)：1400–1408.
Acta Horticulturae Sinica
1400 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0161；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–03–04；修回日期：2015–05–20
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-28）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：jiansheapple@163.com；wangna5531@126.com）
苹果茎痘病毒 TaqMan 探针实时荧光定量
RT-PCR 检测方法的建立
秦子禹 1,2，孙建设 1,*，王 娜 2,*，邵建柱 1
（1 河北农业大学园艺学院，河北保定 071001；2 河北科技师范学院园艺科技学院，河北昌黎 066600）
摘 要：为建立一种检测苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）的 TaqMan 探针实时荧光定
量 RT-PCR 方法，根据 ASPV 外壳蛋白基因（coat protein，cp）保守序列设计了特异性引物和 TaqMan 探
针，以体外转录的 RNA 为标准品构建标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立
的标准曲线决定系数达 0.996，扩增效率为 99%；该方法特异性好，与苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿
叶斑病毒（ACLSV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）均无交叉反应；其最低检测限为 1.31 × 102 copies · μL-1，
灵敏度比常规 RT-PCR 高 100 倍；批内和批间变异系数均小于 1.85%。该方法具有特异性强、灵敏度高、
重复性好等优点，适用于田间样品中 ASPV 的快速定量检测。
关键词：苹果茎痘病毒；TaqMan 探针；实时荧光定量 RT-PCR
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）07-1400-09

Development of a TaqMan Real-time RT-PCR Method for Detecting Apple
stem pitting virus（ASPV）
QIN Zi-yu1,2，SUN Jian-she1,*，WANG Na2,*，and SHAO Jian-zhu1
（1College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071000，China；2Horticultural College of
Science & Technology，Hebei Normal University of Science & Technology，Changli，Hebei 066600，China）
Abstract：This study established a TaqMan real-time RT-PCR method for detecting Apple stem pitting
virus（ASPV）. A pair of primers and a TaqMan probe were designed based on the conserved nucleotide
sequence of ASPV coat protein gene（cp）. The RNA standard of ASPV was prepared with transcription in
vitro and the standard curve was plotted. The specificity，sensitivity and reproducibility of this method
were evaluated. The results showed that the coefficient of determination（R2）was 0.996 and the
amplification efficiency（E）was 99%. There was no crossing reaction with Apple stem grooving virus
（ASGV），Apple chlorotic leaf spot virus（ACLSV）and Apple scar skin viroid（ASSVd），indicating a
strong specificity. The detection limit of this method was 1.31 × 102 copies · μL-1 and the sensitivity was
100 times higher than the conventional RT-PCR. The coefficients of variation between the intra- and
inter-assay were both within 1.85%. This method could be used to detect ASPV rapidly and quantitatively
in field samples with strong specificity，high sensitivity and reliable reproducibility.

秦子禹，孙建设，王 娜，邵建柱.
苹果茎痘病毒 TaqMan 探针实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立.
园艺学报，2015，42 (7)：1400–1408. 1401

Key words：Apple stem pitting virus（ASPV）；TaqMan probe；real-time RT-PCR

苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）为单链正义 RNA 病毒（李丽丽 等，2010a），
是凹陷病毒属（Foveavirus）的代表种（Martelli & Jelkmann，1998），世界各地均有分布，是苹果和
梨树上普遍发生的潜隐性病毒之一，近年也有侵染樱桃（Dhir et al.，2010）和榅桲（Mathioudakis et
al.，2006）的报道。该病毒能引起苹果茎痘病、梨脉黄病、梨石痘病等多种病害，可致苹果和梨产
量下降，品质变劣（Jelkmann，1994），严重影响生产。ASPV 主要通过嫁接传播，目前尚无有效的
治疗药剂和治疗措施，繁育无病毒苗木是其防治的最有效途径（廖明安和冷怀琼，1993；王际轩 等，
2000），而快速、准确、灵敏、高效的病毒检测技术是实现苹果无毒化栽培的技术保障之一。目前检
测 ASPV 的方法主要有酶联免疫吸附试验（李丽丽 等，2010b）、分子杂交（杨俊玲 等，2006）和
常规 RT-PCR 技术（李丽丽 等，2010a；陈红霞 等，2012；乔雪华 等，2013）。但酶联免疫吸附试
验的灵敏度较低，而分子杂交检测步骤多且操作繁琐，常规 RT-PCR 技术虽然灵敏度较高，但需进
行 PCR 后处理，易发生交叉污染，造成假阳性现象，且其只能对样品中的病毒进行定性检测，无法
做到定量检测。实时荧光定量 RT-PCR（Real-time RT-PCR）是将常规 RT-PCR 与荧光检测相结合的
核酸定量检测技术，具有灵敏度高、操作简便、特异性强、重复性好、污染少、用时短和可自动定
量分析等优点。目前，实时荧光定量 RT-PCR 技术在植物病毒检测方面的应用研究已有一些成果
（Ferriol et al.，2011；高三基 等，2011；郭立新 等，2012），但国际上尚无应用体外转录的 RNA
作为标准品构建标准曲线对样品中的 ASPV 进行绝对定量检测的报道。鉴于 ASPV 对苹果产业的严
重影响，急需建立一种更为灵敏准确的检测方法。本研究中根据 ASPV 外壳蛋白（coat protein，cp）
基因的保守序列设计了特异性引物和 TaqMan 探针，通过制备 cRNA 标准品构建标准曲线，建立了
ASPV 基于 TaqMan 探针的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料：经常规 RT-PCR 检测确定携带 ASPV 的田间苹果叶片于 2012 年 6 月采自河北省清苑
县；32 份田间供试样品于 2014 年 6 月分别采自河北省保定市、山东省临沂市和山西省运城市；经
检测确认分别携带苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（Apple
chlorotic leaf spot virus，ACLSV）、苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）的苹果组培苗
及脱毒组培苗由河北农业大学生物技术实验室提供。
主要试剂：RNAiso Plus，RNAiso-mate，EASY Dilution，T7 体外转录试剂盒（TaKaRa，大连）；
2×ES Taq MasterMix（ComWin Biotech，北京）；TransStart Probe qPCR Super Mix，TransScript One-Step
gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 及 pEASY-T3 Cloning Kit（TransGen Biotech，北京）；
DNA 凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒（Sangon Biotech，上海）。
仪器：Bio-Rad S1000 PCR 仪，Bio-Rad iQTM5 实时荧光定量 PCR 仪均为美国 Bio-Rad 公司产品，
NanoDrop 2000 微量紫外分光度计为美国 Thermo Scientific 公司产品。
1.2 引物及探针的设计与合成
利用软件 Clustal X（1.81）对 GenBank 中登录的 ASPV cp 基因序列（NC003462、AF491930、
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JF946775、HM125155）进行比对分析，找到相对保守的区域，利用 Primer Primer 5.0 和 Primer Express
v3.0 软件分别设计特异性引物和 TaqMan 探针（表 1），探针 5′端标记荧光基团 FAM，3′端标记淬灭
基团 BHQ1，由宝生物工程（大连）有限公司合成。ASPV cp 基因的扩增引物参考刘娜和牛建新（2011）
报道的序列合成，标记为 ASPV-cp-F/R。

表 1 本研究中所用引物及探针序列
Table 1 Primers and probe sequences in this study
引物名称 Primer 引物探针序列（5′→ 3′）Sequence（5′ to 3′） 扩增产物长度/ bp Size of amplification products
ASPV-cp-F CCCATTAGGTTAGGGTGTAGTTGCT 1 444
ASPV-cp-R ATGAAAGAAACACACACATAGCCGC
ASPV-Probe3-F AGCAGACCGAGGGGTGTACTCT 260
ASPV-Probe3-R GCGGTACATCTGTATTTCCTTGCT
ASPV-Probe3 FAM-TTGTGCCTTCTACGCGAAGCATGTC-BHQ1
1.3 总 RNA 的提取及 RT-PCR
称取 0.1 g 苹果叶片，利用 RNAiso Plus 及 RNAiso-mate 按照试剂盒说明书提取总 RNA，30 μL
无 RNase 水溶解后，取 5 μL 于 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性，并用 NanoDrop 2000 微量紫
外分光度计测定其浓度和纯度，以 A260/A280 = 1.9 ~ 2.1 的总 RNA 作为实时荧光定量 RT-PCR 的模板，
置于–80 ℃保存备用。
以阳性材料的总 RNA 为模板，利用引物 ASPV-cp-F/R 进行 ASPV cp 基因的 RT-PCR 扩增。20 μL
反转录体系中加入 2× TS Reation Mix 10 μL，TransScriptTM RT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover
1 μL，ASPV-cp-R（10 pmol · μL-1）2 μL，总 RNA 2 μL，无 RNase 水 4 μL。反转录程序为：42 ℃孵
育 30 min，85 ℃加热 5 min。反转录结束后以 1 μL cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应体系 25 μL：
2× ES Taq MasterMix 12.5 μL，ASPV-cp-F/R（10 pmol · μL-1）各 1 μL，cDNA 模板 1 μL，双蒸水 9.5
μL。PCR 程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环；72 ℃ 5 min。
1.4 阳性质粒的构建
PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用 DNA 凝胶回收试剂盒对符合目标片段大小（1 444 bp）
的特异条带进行切胶回收，纯化后与含有 T7 启动子的 pEASY-T3 载体连接，转化至大肠杆菌
（Escherichia coli）DH5α 感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养，用质粒小量提试剂盒提取阳性
质粒。利用 NotⅠ内切酶对阳性质粒 pEASY-T3 载体上分别位于插入片段上游 23 bp 和下游 27 bp 处
的两个酶切位点进行双酶切处理，产物于 1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测。经酶切鉴定有目的片段插入
的质粒送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。经鉴定正确的阳性质粒命名为 ASPV-cp，
用于体外转录标准品 cRNA。
1.5 标准品 cRNA 的制备及标准曲线的绘制
阳性质粒经 PstⅠ内切酶进行线性化处理后，利用 T7 体外转录试剂盒（TaKaRa）进行体外转录
合成 cRNA，并用 RNase-Free DNaseⅠ对其进行纯化。用 NanoDrop 2000 微量紫外分光度计测定其
纯度和质量浓度。拷贝数浓度（copies · μL-1）= 质量浓度（ng · μL-1）× 10-9 × 6.02 × 1023/（RNA 碱
基数 × 330），将质量浓度换算为拷贝数浓度（陶珍珍 等，2015）。经计算制备的 cRNA 拷贝数浓度
为 1.31 × 1010 copies · μL-1。
用 EASY Dilution 将标准品 cRNA 按 10 倍比稀释成 1.31 × 108 ~ 1.31 × 101 copies · μL-1 8 个浓度，
以此为模板进行实时荧光定量 RT-PCR 反应。20 μL 实时荧光定量 PCR 扩增体系包括 TransStart Probe
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图 1 重组质粒酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the recombinant plasmid
digested with restriction enzyme
图 2 实时荧光定量 RT-PCR 标准曲线
Fig. 2 Standard curves of TaqMan real-time RT-PCR
qPCR Super Mix 10 μL，上、下游引物（10 pmol · μL-1）各 0.4 μL，TaqMan 探针（10 pmol · μL-1）
0.4 μL，模板 1.0 μL，双蒸水 7.8 μL。实时荧光定量 PCR 反应程序为：94 ℃预变性 30 s；94 ℃变性
5 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 15 s，共 40 个循环。反应结束后，利用分析软件自动生成标准曲线。
1.6 实时荧光定量 RT-PCR 反应体系的验证与田间样品检测
以分别携带 ASGV、ASPV、ACLSV 和 ASSVd 的苹果组培苗的总 RNA 为模板，进行实时荧光
定量 RT-PCR 扩增，检测该体系的特异性。
以 10 倍倍比稀释成 1.31 × 108 ~ 1.31 × 101 copies · μL-1，8 个浓度梯度的 cRNA 为模板，分别
进行实时荧光定量 RT-PCR 和常规 RT-PCR 反应，比较两种方法的灵敏度。
以 10 倍倍比稀释成 1.31 × 107 ~ 1.31 × 103 copies · μL-1 共 5 个浓度的 cRNA 为模板进行实时荧
光定量 RT-PCR 反应。同一次反应每个稀释度重复 3 孔，连续 3 d 进行 3 次重复验证试验，根据获
得的 Ct 值计算平均 Ct 值、标准差（SD）和变异系数（CV）。
利用建立的实时荧光定量 RT-PCR 方法对采自河北省保定市、山东省临沂市和山西省运城市的
32 份田间样品进行检测。
2 结果与分析
2.1 阳性质粒的构建
提取田间阳性材料的总 RNA 并反转录成
cDNA 后，利用引物 ASPV-cp-F/R 进行 PCR 扩
增，获得长度约为 1 444 bp 的特异条带，与预
期大小相符。将其切胶回收、纯化后进行克隆，
提取重组质粒并进行酶切鉴定，结果表明克隆
质粒中有与目的片段大小相符的片段插入（图
1）。其测序结果在 NCBI 经 Blast 分析显示，与
ASPV cp 基因序列（HM125155）的相似度为
94%，由此确定成功构建了 ASPV-cp 阳性质粒。
2.2 标准曲线的绘制
将 ASPV-cp 阳性质粒进行线性化处理并
纯化后，利用 T7 体外转录试剂盒转录合成
cRNA 作为标准品。用 EASY Dilution 将其按
10倍倍比稀释成浓度依次为 1.31 × 108 ~ 1.31 ×
101 copies · μL-1 的 cRNA。以此为模板进行实时
荧光定量 RT-PCR 反应并绘制标准曲线，结果
（图 2）显示，标准品 cRNA 拷贝数浓度的对
数值与 Ct 值之间具有良好的线性关系，决定系
数（R2）为 0.996，扩增效率（E）为 99%，直
线方程为 y =–3.345 lg (x) + 43.679。
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2.3 实时荧光定量 RT-PCR 的特异性
以分别携带苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）
和苹果锈果类病毒（ASSVd）的苹果组培苗的总 RNA 为模板进行实时荧光定量 RT-PCR 检测。结
果如图 3 所示，除 ASPV 反应管中检测到了呈明显上升趋势的荧光信号外，其余检测结果均为阴性，
表明该方法能够特异地检测 ASPV。

图 3 实时荧光定量 RT-PCR 特异性试验结果
Fig. 3 Specificity of the TaqMan real-time RT-PCR for ASPV
2.4 实时荧光定量 RT-PCR 的灵敏度
将标准品 cRNA 以 10 倍倍比稀释后，分别进行实时荧光定量 RT-PCR 检测和常规 RT-PCR 检测。
结果显示，实时荧光定量 RT-PCR 能够检测到 1.31 × 102 copies · μL-1 的 cRNA（图 4），而常规 RT-PCR
只能检测到 1.31 × 104 copies · μL-1 的 cRNA（图 5），表明实时荧光定量 RT-PCR 比常规 RT-PCR 的
灵敏度高 100 倍。

图 4 不同拷贝数浓度 cRNA 的实时荧光定量 RT-PCR 扩增曲线
Fig. 4 Amplification plots of real-time RT-PCR using cRNA samples at different diluted concentration
图 5 不同拷贝数浓度 cRNA 的常规 RT-PCR 电泳图
Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of conventional RT-PCR using cRNA samples at different diluted concentration
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2.5 实时荧光定量 RT-PCR 的重复性
利用 DPS 软件对不同浓度 cRNA 在同一次试验和不同试验间得到的 Ct 值进行统计学分析（表
2），组内重复的最大变异系数为 1.12%，组间重复的最大变异系数为 1.85%，表明该方法具有较好
的组内重复性和组间重复性。

表 2 实时荧光定量 RT-PCR 的重复性试验结果
Table 2 Reproducibility assay of the TaqMan real-time RT-PCR for ASPV
组内重复 Reproducibility of intra-assay 组间重复 Reproducibility of inter-assay cRNA/
（1.31 · μL-1） Ct 平均值 Mean Ct value SD CV/% Ct 平均值 Mean Ct value SD CV /%
107 20.17 0.02 0.08 20.21 0.16 0.78
106 23.72 0.15 0.61 23.56 0.21 0.89
105 26.25 0.08 0.31 26.71 0.40 1.50
104 29.52 0.15 0.51 29.65 0.32 1.08
103 33.12 0.37 1.12 33.75 0.63 1.85
 
2.6 田间样品的检测结果
利用建立的实时荧光定量 RT-PCR 方法对来自河北保定、山东临沂和山西运城的 32 份田间样品
进行 ASPV 检测。结果（表 3）显示，除样品 L7、Y2、Y7、Y9 的检测结果为阴性外，其余 28 份
样品的检测结果均为阳性，ASPV 的阳性检出率达 87.5%。其中样品 B5 的 Ct 值最小，为 22.30，其
病毒含量为 2.46 × 106 copies · μL-1；Y8 的 Ct 值最大，为 32.48，病毒含量为 2.23 × 103 copies · μL-1。
表明该方法适用于田间样品中 ASPV 的定量检测。

表 3 实时荧光定量 RT-PCR 检测 ASPV 含量
Table 3 Detection and quantitation of ASPV by TaqMan real-time PCR

采集地
Region
样品
Sample
Ct 值
Ct value
ASPV/
（copies · μL-1）
检测结果
Result
河北保定 Baoding，Heibei B1 24.49 5.45 × 105 阳性 Positive
B2 26.76 1.14 × 105 阳性 Positive
B3 23.08 1.44 × 106 阳性 Positive
B4 25.43 2.85 × 105 阳性 Positive
B5 22.30 2.46 × 106 阳性 Positive
B6 24.15 6.89 × 105 阳性 Positive
B7 28.91 2.60 × 104 阳性 Positive
B8 25.73 2.32 × 105 阳性 Positive
B9 26.47 1.40 × 105 阳性 Positive
B10 23.30 1.24 × 106 阳性 Positive
B11 25.13 3.51 × 105 阳性 Positive
B12 27.56 6.59 × 104 阳性 Positive
山东临沂 Linyi，Shandong L1 26.03 1.89 × 105 阳性 Positive
L2 25.86 2.12 × 105 阳性 Positive
L3 27.07 9.23 × 104 阳性 Positive
L4 23.87 8.36 × 105 阳性 Positive
L5 28.08 4.61 × 104 阳性 Positive
L6 25.67 2.42 × 105 阳性 Positive
L7 0 0 阴性 Negative
L8 28.35 3.83 × 104 阳性 Positive
L9 30.58 8.24 × 103 阳性 Positive
L10 23.02 1.50 × 106 阳性 Positive
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3 讨论
实时荧光定量 RT-PCR 与常规 RT-PCR 相比，不仅可以对未知样品中的核酸进行定性检测，还
可以通过制备标准品并建立标准曲线的方法对其进行定量检测。有学者研究发现，在相同扩增条件
下采用不同类型的标准品，同一样品的定量结果存在较大差异（孙培明 等，2006；李丽 等，2011）。
因此制备合适的标准品是获得准确定量数据的前提和关键。本研究中 ASPV 属于 RNA 病毒，因此
以体外转录 cRNA 为标准品，对 ASPV 进行绝对定量检测，可以准确反映该检测体系中反转录和 PCR
扩增过程的效率，使结果更为可信。未知样品通过与标准曲线比较即可得到定性及定量结果。而以
重组质粒作为标准品，只能反映 PCR 反应体系的扩增效率。本研究中以 cRNA 为标准品建立的标准
曲线的 Ct 值与其拷贝浓度呈良好的线性关系，决定系数（R2）为 0.996，扩增效率（E）为 99%，
说明该体系有较好的检测效能。
本研究根据 ASPV cp 基因的保守序列设计了特异性扩增引物和 TaqMan 探针，只有当引物和探
针均可特异结合到检测靶标序列上时才能产生扩增信号，因此 TaqMan 探针实时荧光定量 RT-PCR
较常规 RT-PCR 具有更好的特异性（钱微 等，2013）。本研究以中国分布最广、危害性最大的 3 种
病毒 ASGV、ACLSV、ASSVd（王亚南 等，2010）为阴性对照对检测体系的特异性进行验证，结
果除携带 ASPV 的样品有阳性扩增外，其它均无扩增，表明其具有检测 ASPV 的特异性，可保证检
测结果的正确性。
实时荧光定量 RT-PCR 技术较常规 RT-PCR 技术具有更高灵敏度，已被广泛应用于植物病毒检
测中。胡加谊等（2014）应用实时荧光定量 RT-PCR 对菠萝凋萎相关病毒–2 进行了检测，其灵敏
度比常规 RT-PCR 高 100 倍；陶珍珍等（2015）采用实时荧光定量 RT-PCR 检测 T3 基因型柑橘衰退
病毒时发现实时荧光定量 RT-PCR 比常规 RT-PCR 的灵敏度高 100 倍；吴然等（2015）检测苹果锈
果类病毒时发现实时荧光定量 RT-PCR 比常规 RT-PCR 的灵敏度高 100 倍。本研究建立的 ASPV 实
时荧光定量 RT-PCR 检测体系同样具有较高的灵敏度，其检测灵敏度为 1.31 × 102 copies · μL-1，比常
规 RT-PCR 高 100 倍。
本文是应用体外转录的 RNA 为标准品构建标准曲线，从而建立起 ASPV 基于 TaqMan 探针的实
时荧光定量 RT-PCR 检测方法的首次报道，也是国内首次关于 ASPV 实时荧光定量 RT-PCR 检测方
法的报道。整个 PCR 检测过程只需在 Bio-Rad iQTM5 荧光定量 PCR 仪上进行 1 h 左右，检测结果直
接由电脑软件得出，无需进行 PCR 后处理和分析，简化了检测步骤，提高了检测的效率，同时避免
续表 3
采集地
Region
样品
Sample
Ct 值
Ct value
ASPV/
（copies · μL-1）
检测结果
Result
山西运城 Yuncheng，Shanxi Y1 31.68 3.86 × 103 阳性 Positive
Y2 0 0 阴性 Negative
Y3 26.32 1.55 × 105 阳性 Positive
Y4 29.39 1.87 × 104 阳性 Positive
Y5 27.67 6.11 × 104 阳性 Positive
Y6 29.39 2.87 × 104 阳性 Positive
Y7 0 0 阴性 Negative
Y8 32.48 2.23 × 103 阳性 Positive
Y9 0 0 阴性 Negative
Y10 26.93 1.02 × 105 阳性 Positive
阳性对照 Positive control 23.90 8.18 × 105 阳性 Positive
阴性对照 Negative control 0 0 阴性 Negative
空白对照 Control 0 0 阴性 Negative
秦子禹，孙建设，王 娜，邵建柱.
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了常规 RT-PCR 后处理过程中因产生 PCR 产物气溶胶而造成的交叉污染和假阳性，保证了检测结果
的可靠性。与传统检测方法相比，该方法具有简便、快速、高效、准确、特异、灵敏等优点，适用
于田间样品中 ASPV 的定量检测，还可用于研究 ASPV 的浸染及其在寄主内的运动复制等规律，具
有广阔的应用前景。

References
Chen Hong-xia，Shao Jian-zhu，Sun Jian-she，Cao Xiao-feng，Qiao Xue-hua. 2012. Quick assay detection of apple latent viruses by two-step
multiplex RT-PCR. Journal of Fruit Science，29 (4)：695–701. (in Chinese)
陈红霞，邵建柱，孙建设，曹晓凤，乔雪华. 2012. 两步多重 RT-PCR 快速检测苹果潜隐性病毒. 果树学报，29 (4)：695–701.
Dhir S，Tomar M，Thakur P D，Ram R，Hallan V，Zaidi A A. 2010. Molecular evidence for Apple stem pitting virus infection in India. Plant
Pathology，59 (2)：393.
Ferriol I，Ruiz-Ruiz S，Rubio L. 2011. Detection and absolute quantitation of Broad bean wilt virus 1（BBWV-1) and BBWV-2 by real time RT-PCR.
Journal of Virological Methods，177 (2)：202–205.
Gao San-ji，Yang Fan，Chen Ping-hua，Wang Heng-bo，Xu Jing-sheng，Chen Ru-kai. 2011. Cloning and detection of coat protein gene of Sugarcane
yellow leaf virus by real-time fluorescent RT-PCR. Acta Phytopathologica Sinica，41 (3)：262–269. (in Chinese)
高三基，杨 帆，陈平华，王恒波，徐景升，陈如凯. 2011. 甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其实时荧光 RT-PCR 检测. 植物病理学
报，41 (3)：262–269.
Guo Li-xin，Duan Wei-jun，Zhang Xiang-lin，Deng Cong-liang，Wen Wei-gang，Li Shi-fang. 2012. Detection of Hop latent viroid by real-time
fluorescent RT-PCR assay. Acta Phytopathologica Sinica，42 (5)：466–473. (in Chinese)
郭立新，段维军，张祥林，邓丛良，闻伟刚，李世访. 2012. 啤酒花潜隐类病毒的实时荧光 RT-PCR 检测. 植物病理学报，42 (5)：
466–473.
Hu Jia-yi，Luo Zhi-wen，Fan Hong-yan，Li Xiang-hong，Liu Zhi-xin，He Fan. 2014. Development of a real-time fluorescent quantitative RT-PCR
method for the detection of Pineapple mealybug wilt associated virus-2. Acta Horticulturae Sinica，41 (6)：1257–1266. (in Chinese)
胡加谊，罗志文，范鸿雁，李向宏，刘志昕，何 凡. 2014. 菠萝凋萎相关病毒–2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立. 园艺学报，
41 (6)：1257–1266.
Jelkmann W. 1994. Nucleotide sequences of Apple stem pitting virus and of the coat protein gene of a similar virus from pear associated with vein
yellows disease and their relationship with potex- and carlaviruses. Journal of General Virology，75：1535–1542.
Li Li，Zhao Cheng-ping，Li Hong，Li Wu-feng，Zhang Li-huan，Xu Dong-mei，Wang Jin-sheng，Li Hui-feng. 2011. Establishment of the plasmid
standard curve generation method for absolute quantification PCR. Journal of Agricultural Biotechnology，19 (6)：1157–1162. (in
Chinese)
李 丽，赵成萍，李 宏，李武峰，张利环，许冬梅，王金胜，李慧锋. 2011. 质粒制备绝对定量 PCR 标准曲线方法的建立. 农业生物
技术学报，19 (6)：1157–1162.
Li Li-li，Dong Ya-feng，Zhang Zun-ping，Zhang Zhi-hong，Fan Xu-dong，Pei Qian-guang. 2010a. RT-PCR Detection and molecular variability of
Apple stem pitting virus. Acta Horticulturae Sinica，37 (1)：9–16. (in Chinese)
李丽丽，董雅凤，张尊平，张志宏，范旭东，裴光前. 2010a. 苹果茎痘病毒 RT-PCR 检测及分子变异分析. 园艺学报，37 (1)：9–
16.
Li Li-li，Zhang Zhi-hong，Dong Ya-feng，Zhang Zun-ping，Fan Xu-dong，Pei Guang-qian. 2010b. Prokaryotic expression of Apple stern pitting virus
coat protein and antiserum preparation. Acta Phytophylacica Sinica，37 (4)：319–324. (in Chinese)
李丽丽，张志宏，董雅凤，张尊平，范旭东，裴光前. 2010b. 苹果茎痘病毒外壳蛋白的原核表达及抗血清制备. 植物保护学报，37 (4)：
319–324.
Liao Ming-an，Leng Huai-qiong. 1993. The difference of some substance and development in between virus-free and virus-infected apple trees.
China Fruits，(2)：6–8. (in Chinese)
Qin Zi-yu，Sun Jian-she，Wang Na，Shao Jian-zhu.
Development of a TaqMan real-time RT-PCR method for detecting Apple stem pitting virus（ASPV）.
1408 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (7)：1400–1408.
廖明安，冷怀琼. 1993. 苹果无病毒与带病毒幼树某些内含物及生育的差别. 中国果树，(2)：6–8.
Liu Na，Niu Jian-xin. 2011. Cloning and expression in E. coli of Apple stem pitting virus CP gene in Pyrus bretschneideri Rehd. cv. Yali. Molecular
Plant Breeding，9 (6)：722–727. (in Chinese)
刘 娜，牛建新. 2011. 鸭梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达. 分子植物育种，9 (6)：722–727.
Martelli G P，Jelkmann W. 1998. Foveavirus，a new plant virus genus. Arch Virol，143 (6)：1245–1249.
Mathioudakis M M，Maliogka V I，Dovas C I，Vasilakakis M，Katis N I. 2006. Fist record of the Apple stem pitting virus（ASPV）in quince in
Greece. Journal of Plant Pathology，88 (2)：225–229.
Qian Wei，Liu Yan，Xiao Chen-wen，Wei Qiang，Ji Quan-an，Bao Guo-lian，Yao Huo-chun. 2013. Development and applification of TaqMan
fluorescence quantitative PCR assay to detect rabbit Bordetella bronchiseptica. Journal of Agricultural Biotechnology，21 (4)：498–504. (in
Chinese)
钱 微，刘 燕，肖琛闻，韦 强，季权安，鲍国连，姚火春. 2013. 兔支气管败血波氏杆菌 TaqMan 荧光定量 PCR 检测方法的建立与
应用. 农业生物技术学报，21 (4)：498–504.
Qiao Xue-hua，Guo Chao，Shao Jian-zhu，Sun Jian-she，Chen Hong-xia. 2013. Detection of apple latent virus in seeds of Malus robusta and effect
of physicochemical treatment on the virus. Journal of Fruit Science，30 (3)：489–492. (in Chinese)
乔雪华，郭 超，邵建柱，孙建设，陈红霞. 2013. 八棱海棠种子潜带病毒检测及理化处理对其带毒状况的影响. 果树学报，30 (3)：
489–492.
Sun Pei-ming，Bao En-dong，Wang Zhi-liang. 2006. Establishment and improvement on fluorescence quantitative PCR of HSP70 mRNA in the
Broilers. Journal of Agricultural Biotechnology，14 (1)：45–50. (in Chinese)
孙培明，鲍恩东，王志亮. 2006. 肉鸡热休克蛋白 70 mRNA 荧光定量 PCR 方法的建立和优化. 农业生物技术学报，14 (1)：45–50.
Tao Zhen-zhen，Li Zhong-an，Ja Min，Tang Meng，Tang Ke-zhi，Zhou Chang-yong，Zhou Yan. 2015. Development and application of a quantitative
RT-PCR approach for quantification of T3 genotype of Citrus tristeza virus. Acta Horticulturae Sinica，42 (1)：183–190. (in Chinese)
陶珍珍，李中安，贾 敏，唐 萌，唐科志，周常勇，周 彦. 2015. T3 基因型柑橘衰退病毒实时荧光定量 RT-PCR 检测体系的建立及
应用. 园艺学报，42 (1)：183–190.
Wang Ji-xuan，Liu Zhi，Xie Xiu-hua，Wu Bin，Tong Zhao-guo. 2000. The reaction of virus-free apple tree growth and fruit production. Acta
Horticulturae Sinica，27 (3)：157–160. (in Chinese)
王际轩，刘 志，谢秀华，吴 斌，佟兆国. 2000. 苹果无病毒树的生长和结果表现. 园艺学报，27 (3)：157–160.
Wang Ya-nan，Hu Tong-le，Liu Shu-xiang，Zhao Xu-sheng，Yang Jun-yu，Cao Ke-qiang. 2010. Research on apple virus in China. Journal of Anhui
Agricultural Science，38 (15)：7933–7936. (in Chinese)
王亚南，胡同乐，刘淑香，赵绪生，杨军玉，曹克强. 2010. 我国苹果病毒病的研究现状. 安徽农业科学，38 (15)：7933–7936.
Wu Ran，Li Jun-ying，Shao Jian-zhu，Sun Jian-she，Zhang He. 2015. Establishment of detection method for Apple scar skin viroid（ASSVd）by
real-time PCR. Journal of Fruit Science，32 (1)：150–155. (in Chinese)
吴 然，李君英，邵建柱，孙建设，张 鹤. 2015. 苹果锈果类病毒实时荧光 PCR 检测方法的建立. 果树学报，32 (1)：150–155.
Yang Jun-ling，Dong Ya-feng，Li Shi-fang，Zhang Zun-ping，He Jun. 2006. Detection of Apple stem pitting virus（ASPV）by dotblothybridization
with digoxigenin-labelled viral cDNA probe. Acta Phytopathologica Sinica，36 (5)：470–472. (in Chinese)
杨俊玲，董雅凤，李世访，张尊平，何 峻. 2006. 地高辛标记 cDNA 探针检测苹果茎痘病毒. 植物病理学报，36 (5)：470–472.