全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (4) : 493 - 500
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 08 - 20; 修回日期 : 2008 - 02 - 27
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30360066 ) ; 国家 科 技 攻 关 计 划 引 导 项 目 ( 2003BA546C ) ; 兵 团 科 委 项 目
(NKB02SDXNK01SW )3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: njx105@1631com)
利用 3′和 5′RACE克隆新疆梨树苹果茎痘病毒末
端序列
赵　英 , 牛建新 3
(石河子大学农学院园艺系 , 新疆石河子 832003)
摘 　要 : 采用 RACE技术对库尔勒香梨苹果茎痘病毒进行研究 , 获得了梨树苹果茎痘病毒 5′和 3′末端
序列。研究结果表明 , 本试验采用的 3′和 5′末端快速扩增技术 (3′RACE和 5′RACE技术 ) 能很好地扩增
苹果茎痘病毒的末端序列 , 分别获得了长度为 329 bp和 367 bp的片段 , 通过与 NCB I核酸数据库中已经发
表的序列 NC_003462进行比对分析 , 发现梨树 ASPV 3′末端含有 131个核苷酸非编码序列 , 具有 poly (A )
尾 , 5′末端含有 34个核苷酸非编码序列 , 其同源性与已发表的序列分别为 78%和 84% , 为获得梨树 ASPV
病毒全长基因组和基因组功能结构分析奠定了基础。
关键词 : 梨 ; 苹果茎痘病毒 ; 3′和 5′末端快速扩增法 ; 基因工程
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0420493208
C lon ing of the Ter m ina l Reg ion s of A pple ste m pitting virus in Pear Trees
Using 3′and 5′RACE
ZHAO Ying and N IU J ian2xin3
(D epartm ent of Horticu lture, A gricu ltura l College of Sh ihezi U niversity, Sh ihezi, X injiang 832003, Ch ina)
Abstract: The 5′and 3′term inal regions of A pple stem pitting virus (ASPV) in tree of Pyrus sink iangen2
sis‘Kuerle’pear were cloned using rap id amp lification of cDNA ends ( RACE ) technique. The results
showed that the techniques of 3′and 5′RACE could amp lify the term inal regions of ASPV in pear trees effec2
tively, and the 329 bp and 367 bp segments of ASPV were obtained. The 3′term inal region of ASPV in Kuerle
pear contained 131 nt of non2coding sequence and a poly (A) tail, and the 5′term inal region contained 34 nt
of non2coding sequence. They shared 78% and 84% nucleotide acid identity with the sequence of NC_003462
in NCB I nucleotide acid database, respectively. This study laid a sound foundation for obtaining the full se2
quence and analyzing the function and structure of genome of ASPV in pear trees.
Key words: pear; A pple stem pitting virus; rap id amp lification of 3′and 5′term inal regions; genetic
engineering
梨树上的苹果茎痘病毒 (A pple stem pitting virus, ASPV ) 首先在美国报道 (邓晓云和王国平 ,
2002)。该病毒能引起苹果茎痘病、梨石痘病、梨脉黄病等多种病害 , 严重影响产量和质量。
随着分子生物学的发展 , 分子杂交和 PCR技术已逐渐应用到梨树 ASPV病毒检测中 , 建立了灵
敏、快捷的病毒检测体系 ( Kummert et al. , 1998; Malionwski et al. , 1998; Nechinov et al. , 1998;
Schwarz & Jelkmann, 1998; 刘连科 等 , 2003; 牛建新 等 , 2002, 2003a, 2003b, 2006)。
在基因工程研究中 , 分析基因全长 cDNA序列十分重要 , 但一般 RT2PCR很难从 mRNA扩增到某
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
一基因的全长片段。
RACE ( rap id amp lification of cDNA ends ) 技术是由 Frohman等 (1988) 首次提出 , 是一种以 PCR
反应为基础 , 应用通用引物和特异引物从低丰度转录本中快速扩增已知 cDNA片段旁侧 5′和 3′末端的
简单而有效的方法。这种获得 cDNA 5′和 3′末端的方法 , 也被称为锚定 PCR (Anchored2PCR ) 或单边
PCR (One2sided PCR) , 得到 cDNA 3′和 5′末端的技术分别称之为 3′RACE和 5′RACE (唐克轩 等 ,
2002; 王少丽 等 , 2004; 陈启龙 , 2006; 郝敏 等 , 2006)。
本试验中利用 TaKaRa公司设计的 3′RACE和 5′RACE试剂盒 , 通过多条引物 , 采用 3′RACE和
5′RACE技术成功获得了梨树 ASPV病毒 3′末端序列和 5′末端序列 , 为获得 ASPV病毒全长基因组和
基因组功能结构分析奠定了基础。
1　材料与方法
111　试材与试剂
试验材料取自新疆库尔勒沙依东园艺场、28团、29团、30团香梨园中已通过 RT2PCR检测确定
带苹果茎痘病毒 (A pple stem pitting virus) 的库尔勒香梨 ( Pyrus sink iangensis Yu) 树 , 以一年生幼嫩
叶片和枝条为试材。
主要试剂购于上海生工生物工程技术服务有限公司。常规试剂均为国产分析纯。3′RACE、5′
RACE试剂盒购自 TaKaRa公司。
112　引物设计与梨组织总 RNA提取
采用 DNAman软件 , 根据 GenBank中已发表的 NC_003462序列设计保守序列引物 , 通过扩增、
克隆获得一段 3′端和 5′端保守序列 , 根据测定的序列设计 3′RACE和 5′RACE的特异引物。引物序列
见表 1, 由上海生工生物技术服务有限公司合成。
表 1　梨树 ASPV病毒引物序列
Table 1　Pr im er sequence of ASPV in pear trees
引物
Primer
引物序列
Primer sequence
3′端保守序列引物 P3 1: ATGTCTGGAACCTCATGCTGCAA
Primer of 3′the end conservative sequence P3 2: TTGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATAA
3′RACE (1 - 103) P3 3: TGGAGTTGAAAGCTCCGGCC
3′RACE (1 - 165) P3 4: CTGAGAGAGTAGCCAATGCGACCA
3′RACE (Outer) P3 5: TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
3′RACE ( Inner) P3 6: CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
5′端保守序列引物 P5 1: AAAGGCAACTTCATAATTTACTCG
Primer of 5′the end conservative sequence P5 2: ATAGTGTTCTTGGAGATTGGTAAGC
5′RACE内侧引物 5′the RACE inside p rimer P5 3: ATGGGTTTTACAAGCAGGATGG
5′RACE外侧引物 5′the RACE flank p rimer P5 4: GCCTCCTCTTCAGAAAGTCAAC
5′RACE (Outer) P5 5: CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
5′RACE ( Inner) P5 6: CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
梨组织总 RNA采用刘连科等 (2003) 和牛建新等 (2003a) 的方法提取。
113　3′和 5′末端保守序列反转录及 PCR扩增
RT反应体系及反应条件 : 200μL Eppendorf管中加入总 RNA 10μL, 特异性引物 P3 2 ( P5 2) (20
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　4期 赵 　英等 : 利用 3′和 5′RACE克隆新疆梨树苹果茎痘病毒末端序列 　
pmol·L - 1 ) 1μL, DEPC水 4μL, 70 ℃水浴 5 m in后再冰浴 5 m in; 加入 dNTPs (各 10 mol·L - 1 )
215μL, RNasin (40 U·μL - 1 ) 1μL, 5 ×Buffer 5μL, 37 ℃水浴 5 m in; 再加入 M 2MLV 115μL, 42
℃温育 1 h, 92 ℃灭活 4 m in, 立即置于冰上。
PCR反应体系及反应条件 : 在 200 μL Eppendorf管中加入 10 ×Buffer 210 μL, Mg2 + 112 μL,
dNTPs 014μL, P3 1 ( P5 1) 引物 1μL, P3 2 ( P5 2) 引物 1μL, cDNA 315μL, Taq E 015μL, 补水至
20μL, 94 ℃预变性 3 m in, 30次循环 : 94 ℃ 45 s, 退火 62 ℃, 72 ℃ 45 s, 最后 1个循环 72 ℃延伸
7 m in。
114　ASPV病毒 3′RACE操作
参考侯俊等 (2006) 和刘永斌等 (2006) 的方法进行。
逆转录 : 取梨组织总 RNA 3μL, 3′RACE Adap tor (5μmol·L - 1 , 试剂盒中自带 ) 1μL, 5 ×M 2
MLV Buffer 2μL, dNTP M ixture (各 10 mmol·L - 1 ) 1μL, RNAase Inhibitor (40 U·μL - 1 ) 0125μL,
Reverse Transcrip tase M 2MLV (RNAase H) (200 U·μL - 1 ) 0125μL, RNAase Free ddH2 O 215μL, 反
应条件为 42 ℃温浴 60 m in后 70 ℃灭活 15 m in, - 20 ℃保存待用。
3′Outer PCR反应 : 取 RT产物 3μL, 1 ×cDNA D ilution BufferⅡ8μL, P3 3 (10μmol·L - 1 ) 2
μL, P3 5 (10μmol·L - 1 ) 2μL, 10 ×LA PCR BufferⅡ (Mg2 + Free) 4μL, MgCl2 (25 mmol·L - 1 ) 3
μL, TaKaRa LA Taq (5 U·μL - 1 ) 013μL, ddH2 O 2717μL, 反应条件为 94 ℃ 3 m in, 94 ℃ 30 s,
55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 m in, 30个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。
Inner PCR反应 : 取 PCR 产物 1 μL, dNTP M ixture (各 215 mmol·L - 1 ) 2 μL, 10 ×LA PCR
BufferⅡ (Mg2 + Free) 5μL, MgCl2 (25 mmol·L - 1 ) 5μL, TaKaRa LA Taq (5 U·μL - 1 ) 015μL,
P3 4 (10μmol·L - 1 ) 2μL, P3 6 (10μmol·L - 1 ) 2μL, ddH2O 3215μL, 反应条件同前一步 PCR。
套式 PCR扩增产物经回收、克隆、鉴定 , 每个阳性克隆挑选 3个平行菌 , 交上海生工生物技术
服务有限公司进行测序。
115　ASPV病毒 5′RACE操作技术
参考秦兆习等 (2005)、石奕武等 (2006) 的方法进行。
梨组织总 RNA (2μL) 的去磷酸化、“去帽子 ”反应、5′RACE Adap tor连接均参考 TaKaRa公司
试剂盒操作流程进行 , 获得 L igated RNA。
反转录 : 取 L igated RNA 6μL, Random 9 mers (50μmol·L - 1 ) 015μL, 5 ×M 2MLV Buffer 2μL,
dNTPs (各 10μmol·L - 1 ) 1μL, RNAase Inhibitor ( 40 U ·μL - 1 ) 0125μL, Reverse Transcrip tase
MMLV (RNAase H - ) (200 U·μL - 1 ) 0125μL, 30 ℃10 m in, 42 ℃ 60 m in, 70 ℃ 15 m in。
5′Outer PCR反应 : 取 RT产物 4μL, 1 ×cDNA D ilution Buffer Ⅱ10μL, 10 ×LA PCR BufferⅡ
(Mg2 + Free) 4μL, MgCl2 (25 mmol·L - 1 ) 3μL, TaKaRa LA Taq (5 U·μL - 1 ) 0125μL, P5 4 (10
μmol·L - 1 ) 2μL, P5 5 (10μmol·L - 1 ) 2μL, ddH2 O 28175μL, 94 ℃ 3 m in, 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30
s, 72 ℃ 1 m in, 25个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in。
Inner PCR反应 : 取 Outer PCR反应液 1μL, 10 ×LA PCR BufferⅡ (Mg2 + Free) 5μL, MgCl2
(25 mmol·L - 1 ) 5μL, TaKaRa LA Taq (5 U·μL - 1 ) 015μL, P5 3 (10μmol·L - 1 ) 2μL, P5 6 (10
μmol·L - 1 ) 2μL, ddH2 O 2615μL, 反应条件同前一步 PCR。
5′RACE PCR产物经回收、克隆、鉴定 , 挑选阳性克隆测序。
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2　结果与分析
211　3′RACE序列克隆和分析
21111　外壳蛋白部分保守序列目的基因扩增 　
用特异引物 P3 1、P3 2扩增出了 ASPV 3′末端保守序列预期大小的特异片段 (图 l) , 将克隆测序
结果 (358 bp) 用 DNAman和 BLAST分析软件分析 , 确认其为 ASPV病毒 8 873～9 238之间的特异片
段。
图 1　3′末端保守序列 PCR扩增产物
1: Marker; 2～4: 梨树 ASPV病毒 3′末端
保守序列 PCR产物 ; 5: 阴性对照。
F ig. 1　PCR products of con serva tive sequence of 3′end
w ith gel electrophoresis ana lysis
1: Marker; 2 - 4: 3′the end conservative sequence PCR p roducts of
ASPV in pear trees; 5: Negative control.
21112　3′RACE扩增结果和序列分析 　
根据扩增出的 3′末端保守序列结合 3′RACE原理设计引物 P3 3、和 P3 4, 反转录后 , 用引物 P3 5、
P3 6进行套式 PCR扩增 , 电泳检测扩增片段大小约为 361 bp (含接头引物 ) (图 2)。
图 2　3′RACE琼脂糖凝胶电泳图
1: 梨树 ASPV病毒 3′RACE扩增产物 ;
2: Marker (501、404、331、242、190、147 bp)。
F ig. 2　Agaose gel electrophoresis ana lysis of 3′RACE PCR products
1: 3′RACE PCR p roducts of ASPV in pear trees;
2: Marker (501, 404, 331, 242, 190, 147 bp) .
将克隆测序结果 (图 3) 329 bp (不含接头引物 ) 在 DNAman和 BLAST软件中分析 , 结果表明 ,
该序列与已发表的 ASPV NC_003462序列相应部位的同源性达 78%。
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　4期 赵 　英等 : 利用 3′和 5′RACE克隆新疆梨树苹果茎痘病毒末端序列 　
图 3　利用 3′RACE扩增得到的 ASPV末端 cD NA序列
TAA: 终止密码子。
F ig. 3　cD NA end sequence of ASPV am plif ied by 3′RACE
TAA: Term ination codon.
本试验中获得的 3′末端含 186个核苷酸氨基酸编码序列 (图 4)、终止密码子 TAA、131个核苷
酸非编码序列和 poly (A) 12尾。
图 4　利用 3′RACE扩增得到的 ASPV末端 cD NA编码序列
F ig. 4　Cod ing sequence of ASPV end cD NA am plif ied by 3′RACE
212　5′RACE序列的克隆和分析
21211　5′末端保守序列目的基因扩增 　
用特异引物 P5 1、P5 2扩增出了 ASPV 5′末端保守序列预期的大小片段 909 bp (图 5) , 将测序结
果用 DNAman和 BLAST软件进行分析 , 确认其为 ASPV病毒 8～1 016之间的特异片段。
图 5　5′末端保守序列 PCR扩增产物电泳
1: 无病毒对照 ; 2: 梨树 ASPV病毒 5′末端保守序列 PCR产物 ; 3: Marker。
F ig. 5　Gel electrophoresis of PCR am plif ica tion products of
5′end con serva tive sequence
1: Control samp le of non virus infection; 2: Products of 5′end
conservative sequence of ASPV in pear trees; 3: Marker.
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21212　5′RACE扩增结果和序列分析 　
根据扩增的 5′末端保守序列 , 结合 5′RACE原理设计引物 P5 3和 P5 4, 与梨树总 RNA经去磷酸
化、“去帽子 ”反应、5′RACE Adap tor连接后获得 L igated RNA及给定引物 P5 5、P5 6进行反转录、套
式 PCR反应 , 获得的 PCR扩增产物在 112%的琼脂糖凝胶上进行电泳 , 结果见图 6, 片段大小为 367
bp (不含接头引物 )。
图 6　5′RACE琼脂糖凝胶电泳
1～3: 梨树 ASPV病毒 5′RACE扩增产物 ; 4: Marker。
F ig. 6　Gel electrophoresis of 5′end RACE
1 - 3: Products amp lified by 5′end RACE of ASPV in pear trees; 4: Marker.
将克隆测序的 367 bp的核苷酸序列在 DNAman生物学软件和 BLAST中进行分析 , 结果表明 : 该
序列与已发表的 NC_003462 ASPV序列的相应部位的同源性达 84% (图 7)。
图 7　梨树 ASPV 5′末端序列3 为非编码区。
F ig. 7　5′end sequence of ASPV in pear trees3 Shows the non2coding regions.
本试验扩增得到了 367 bp的碱基 , 包括 5′端 34个核苷酸非编码序列 , 5′端 333个核苷酸编码序
列 , 该序列共编码 111个氨基酸。编码氨基酸序列见图 8。
图 8　利用 5′RACE扩增得到的 ASPV末端 cD NA编码序列
F ig. 8　Cod ing sequence of ASPV end cD NA am plif ied by 5′RACE
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　4期 赵 　英等 : 利用 3′和 5′RACE克隆新疆梨树苹果茎痘病毒末端序列 　
3　讨论
获得基因全长序列是生物工程和分子生物学研究的重点之一。尽管已有多种获得基因全长序列的
方法 , 但是由于果树中病毒含量很低 , 且果树组织中富含酚类、糖类和蛋白质等物质 , RNA在提取
中很容易发生降解 , 从而使得由低丰度 mRNA通过转录获得全长 cDNA变得很困难。近年来发展成熟
的 cDNA末端快速扩增 (RACE) 技术 , 为从低丰度转录本快速获得全长 cDNA提供了一个便捷的途
径。
Jelkmann (1994) 的研究表明 ASPV 为正单链 RNA 病毒 , 核酸分子量约 3 100 kD, 衣壳蛋白分
子量约 48 kD。该病毒约由 9 306个核苷酸组成 , 含有 5个开放阅读框 , 分别编码 247、25 l、1218、
712、4317 kD的蛋白质 , 3′末端含有 135个非编码序列 , 具有 Poly (A ) 尾。应用 GenBank中的
BLAST检索和 DNAman对本试验扩增的 3′RACE目的片段和 5′RACE目的片段进行了分析 , 结果表
明 : 本试验获得的梨树 ASPV病毒 3′端含有 131个非编码序列 , 含有 Poly (A ) 尾 , 扩增片段的序列
与已发表序列 (Jelkmann, 1994) 的同源性达 78%。5′端含有 34个非编码序列 , 扩增的片段序列与
已发表序列的同源性高达 84%。由于扩增的 3′RACE目的片段 [不包含 Poly (A) 尾 ] 是在 ASPV病
毒全长的 9 260～9 306的位置 , 涵盖了最后一个核苷酸。5′RACE目的片段在 ASPV病毒全长的 1～
367核苷酸。所以本试验获得了 ASPV病毒完整的 3′末端序列和 5′末端序列。
传统的 5′RACE技术是用一个反向基因特异引物 ( GSP) 在反转录酶作用下反转录总 RNA得到
第一链 cDNA, 再用末端脱氧核糖核苷酸酶 ( TdT) 给 cDNA的 5′端进行同聚物加尾反应 , 从而在未
知的 cDNA 5′端加上一个接头 , 再用 GSP和接头引物经 PCR扩增出未知 mRNA的 5′端。但这种传统
方法在实际操作中仍有不少困难。
我们采用的是由 TaKaRa公司设计的 5′RACE技术 , 其主要采用了 “去帽法 ”原理 , 利用 TAP
( tobacco acid pyrophosphatase) 去掉 mRNA的 5′帽子结构 , 使用 T4 RNA L igase 5′RACE Adap tor连接到
mRNA的 5′端后 , 使用 5′RACE Adap tor上的引物与已知序列部分引物进行 RT2PCR反应 , 可高度特异
性扩增 cDNA 5′末端全长序列。
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