全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (12) : 1821 - 1826
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 07 - 22; 修回日期 : 2009 - 10 - 30
基金项目 : 2008年农业科技跨越计划项目 ; 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项项目 (082060302207)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yfdong@1631com)
3种苹果潜隐病毒多重 RT2PCR检测体系的建立
范旭东 1 , 董雅凤 13 , 张尊平 1 , 李丽丽 2 , 裴光前 1
(1中国农业科学院果树研究所 , 辽宁兴城 125100; 2 沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳 110161)
摘　要 : 研究建立了能同时检测苹果茎沟病毒 (A pple stem grooving virus, ASGV )、苹果褪绿叶斑病毒
(A pple ch lorotic leaf spot virus, ACLSV) 和苹果茎痘病毒 (A pple stem pitting virus, ASPV ) 的多重 RT2PCR方
法。以复合感染 3种病毒的苹果 ‘望山红 ’组培苗为试材 , 对影响多重 PCR的反应条件进行了一系列的调
整和优化。多重 RT2PCR体系灵敏性测验显示 , 最低能从 RNA总量 18715 ng的样品中检测 3种病毒的存
在。多重 RT2PCR产物的序列与报道的病毒序列有较高的同源性 , 12个田间苹果样品的多重 RT2PCR检测
结果与单一 PCR的结果一致 , 初步证明了多重 RT2PCR检测的准确性。
关键词 : 苹果 ; 多重 RT2PCR; 检测 ; 苹果茎沟病毒 ; 苹果褪绿叶斑病毒 ; 苹果茎痘病毒
中图分类号 : S 66111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1221821206
M ultiplex RT2PCR A ssay for S im ultaneous D etection of Three La ten t Apple
V iruses
FAN Xu2dong1 , DONG Ya2feng13 , ZHANG Zun2p ing1 , L IL i2li2 , and PE I Guang2qian1
(1 R esearch Institu te of Pom ology, Chinese A cadem y of A gricu lture Sciences, X ingcheng, L iaon ing 125100, Ch ina; 2 College of
Horticulture, Shenyang A gricu ltura l U niversity, Shenyang 110161, Ch ina)
Abstract: The multip lex RT2PCR assay was established to simultaneously detect Apple stem grooving vi2
rus (ASGV ) , Apple ch lorotic leaf spot virus (ACLSV ) and A pple stem pitting virus (ASPV ). U sing tissue
culture app le seedling (W angshanhong) infected by three latent app le viruses as samp le, a series of factors
affecting the multip lex RT2PCR were op tim ized. Sensibility test showed that it could simultaneously detect out
ASGV , ACLSV and ASPV in 18715 ng total RNA. The multip lex RT2PCR p roducts were cloned and sent for
sequencing, and the sequences show high homologies to the published virus sequences. Consistent results for
virus detection of 12 app le samp les in field were obtained by the multip lex RT2PCR and single RT2PCR sys2
tem, suggesting the accuracy of the system in ASGV, ACLSV and ASPV detection.
Key words: app le; multip lex RT2PCR; detection; A pple stem grooving virus; Apple ch lorotic leaf spot
virus; A pple stem pitting virus
苹果茎沟病毒 (A pple stem g rooving virus, ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒 (A pple ch lorotic leaf spot vi2
rus, ACLSV)、苹果茎痘病毒 (Apple stem pitting virus, ASPV ) 在大多数苹果栽培品种上不表现症状 ,
称为潜隐病毒 , 我国栽培的苹果普遍潜带上述病毒 (王国平 , 1994)。苹果病毒主要通过接穗和苗木
传播 , 无法通过药剂进行化学防治 , 培育和栽培无病毒苗木是防治苹果病毒病的根本措施。无病毒苗
木培育过程中 , 需要对母本树及脱毒后的苗木进行病毒检测 , 因此 , 快速有效的检测手段显得尤为重
要。
近年来 , 多重 RT2PCR检测以其独特的优越性被广泛运用于植物病毒的检测 ( Ito et al. , 2002;
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Roy et al. , 2005; 王继华 等 , 2005; 丁芳 等 , 2006; Gambino & Gnbaudo, 2006; 牛建新 等 ,
2006; Periasamy et al. , 2006; 张志宏 等 , 2006; 徐榕雪 等 , 2007; W ei et al. , 2008; 赵丽 等 ,
2008)。作者在前人研究的基础上 , 针对栽培苹果研究建立了能同时检测 ASGV、ACLSV和 ASPV的
多重 RT2PCR检测体系 , 以期为苹果潜隐病毒的田间调查以及病毒的脱除提供准确、简便、快速、经
济的检测方法。
1　材料与方法
111　材料
潜带 ASGV、ACLSV和 ASPV 3种病毒的苹果 ‘望山红 ’试管苗由中国农业科学院果树研究所国
家落叶果树脱毒中心提供。
单一 PCR已鉴定的 12个苹果植株 , 于 2008年 12月重新从国家果树种质兴城苹果圃取样 , 采取
部位均为休眠枝条 , 其样品编号 , 品种名称及带毒情况见表 1。
表 1　田间苹果样品的带毒情况
Table 1　The v iruses in f ield sam ples of 12 apples
编号
Code
品种
Cultivar
苹果茎沟病毒
ASGV
苹果褪绿叶斑病毒
ACLSV
苹果茎痘病毒
ASPV
1 甜黄魁 Tian Huangkui - - +
2 乔纳金 Jonagold - - +
3 肯达尔 Kendall + + +
4 红冠 R ichard Delicious - - +
5 斯帕坦 Spartan + + +
6 大沙河元帅 Dashahe Yuanshuai + - +
7 新冬 Xindong - - +
8 太平洋玫瑰 Pacific Rosa - + +
9 澳洲青苹 Granny Sm ith + + +
10 青森早生 Q ingsen Zaosheng + + +
11 长富 3 Nagafu 3 + + +
12 丹霞 Danxia + + -
　　注 : + : 带毒 ; - : 不带毒。
Note: + : V irus infected; - : V irus uninfected.
112　样品总 RNA的提取及其反转录
取 ‘望山红 ’试管苗叶片 100 mg, 其他苹果样品先刮取其休眠枝条韧皮部 100 mg, 参照二氧化
硅吸附法 ( Foissac et al. , 2000) 进行总 RNA提取。
然后进行反转录 : 在 115 mL消毒离心管中 , 依次加入灭菌纯水 910μL, Random Prime (上海生
工生物工程有限公司合成 ) 110μL和总 RNA 510μL, 离心混匀 , 95 ℃水浴 5 m in, 冰上放置 2 m in。
加入以下混合液 : 5 ×M 2MLV buffer 510μL, 10 mmol·L - 1 dNTPs 115μL, 200 U·μL - 1M 2MLV逆转
录酶 018μL, 灭菌纯水 217μL。37 ℃水浴 10 m in, 然后转入 42 ℃水浴 50 m in, 最后 70 ℃水浴 5
m in, 立即进行 PCR扩增或 - 20 ℃保存备用。
113　多重 RT2PCR检测体系的建立
11311　不同 dNTPs、Taq酶和模板用量的分析
改变 PCR反应体系 (25μL) 中 dNTPs、Taq酶和模板的用量 , 设定 4种用量组合 (见图 1) , 电
泳观察 PCR产物条带 , 确定适宜组合。
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　12期 范旭东等 : 3种苹果潜隐病毒多重 RT2PCR检测体系的建立 　
11312　适宜引物浓度组合的分析　
设定 8种不同引物浓度组合 (表 2) , 电泳观
察 PCR产物条带 , 确定适宜引物组合。
所用引物见表 3, 均由上海生工生物工程有
限公司合成。
11313　适宜退火温度的分析 　
根据 ASGV, ACLSV和 ASPV的单一 PCR的
最佳 Tm为 55、52和 54 ℃, 分别设定多重 PCR
的退火温度为 48、50和 53 ℃, 电泳观察 PCR产
物条带 , 确定适宜的退火温度。
表 2　重 PCR引物不同用量组合
Table 2　D ifferen t com b ina tion of pr im er sets
/ (mmol·L - 1 )
组合
Composition No.
引物
Primer ASGV
引物
Primer ACLSV
引物
Primer ASPV
1 0112 0116 0120
2 0116 0120 0124
3 0116 0120 0128
4 0116 0120 0132
5 0120 0116 0112
6 0124 0120 0116
7 0128 0120 0116
8 0132 0120 0116
表 3　多重 RT2PCR引物
Table 3　Pr im ers used in m ultiplex RT2PCR
病毒
V irus
引物序列
Sequence of p rimer
序列位置
Location of p rimer
扩增产物 / bp
Amp licon
参考文献
Reference
ASGV 5′2CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC23′ 5 870～5 894 524 Mackenzie et al. , 1997
5′2CTGCAAGACCGCGACCAAGTTT23′ 6 393～6 372
ACLSV 5′2GGCAACCCTGGAACAGA23′ 6 875～6 891 358 Candresse et al. , 1995
5′2CAGACCCTTATTGAAGTCGAA23′ 7 232～7 212
ASPV 5′2CTCTTGAACCAGCTGATGGC23′ 8 993～9 012 265 Jelkmann & Keim2konrad, 1997
5′2ATAGCCGCCCCGGTTAGGTT23′ 9 256～9 237
114　多重 RT2PCR的灵敏性测验
取 5μL总 RNA 稀释 10倍 , 用 DU800型核酸蛋白分析仪测定 OD260和 OD280, 并计算总 RNA
浓度。然后对 RNA进行 10 - 1、10 - 2、10 - 3、10 - 4、10 - 5、10 - 6一系列的稀释 , 经过多重 RT2PCR扩
增 , 观察电泳结果 , 分析多重 RT2PCR检测的灵敏性。
115　多重 RT2PCR特异性试验
对挑选带有 ASGV、ACLSV、ASPV中的 1种、2种或 3种病毒的 12株苹果样品提取总 RNA, 进
行多重 RT2PCR检测 , 将多重 PCR检测结果与已知样品的带毒情况相比较 , 验证多重 RT2PCR对田间
样品的检测效果。
116　多重 PCR产物的克隆与测序
PCR扩增的目的 DNA 片段经 PCR Fragment Recovery Kit ( TaKaRa) 回收纯化 , 与 pMD182T Vector
( TaKaRa) 连接后转化 E. coli JM109大肠感菌株感受态细胞 , 经蓝白斑筛选 , 挑取白色菌落进行培养。
经 PCR鉴定获得重组质粒 , 由上海生工生物工程
公司进行测序。采用 DNA Star分析软件中的
MegA lign程序将 3种病毒扩增片段测序结果与
GenBank数据库中已登录的一些分离物的核苷酸
序列进行同源性分析。
2　结果与分析
211　多重 RT2PCR检测体系
通过比较 4组具有不同 dNTPs、Taq酶和模板
浓度的多重 PCR 反应 (图 1 ) 发现 , 适当增加
dNTPs、 Taq酶和模板浓度有利于此多重 PCR的
图 1　dNTPs、Taq酶和模板不同浓度组合多重 RT2PCR扩增结果
F ig. 1　M ultiplex RT2PCR amplif ica tion with d ifferent amoun t of
dNTPs, Taq enzyme, and template
M: DNA Marker; 1: dNTPs 015 mL, Taq 01375 mL, temp late
3 mL; 2: dNTPs 015 mL, Taq 015 mL, template 3 mL; 3: dNTPs
110 mL, Taq 015 mL, template 3 mL; 4: dNTPs 110 mL,
Taq 015 mL, template 5 mL.
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扩增 , 三者最佳组合为 10 mmol·L - 1 dNTPs 1
μL, 2 U·μL - 1 Taq酶 015μL, cDNA 模板量 5
μL。
8种不同 ASGV , ACLSV和 ASPV引物用量组
合 (表 2) 的 PCR结果显示 , 当 ASGV每对引物
为 0128μmol·L - 1 , ACLSV为 0120μmol·L - 1 ,
ASPV为 0116μmol·L - 1时 , 多重 PCR有较好的
扩增效果 (图略 )。
当退火温度设为 48、50 和 53 ℃时 , 多重
PCR扩增效果差别不大 , 综合考虑 , 最终退火温
度定为 53 ℃ (图 2)。
　　综上所述 , 最终将多重 PCR反应体系 ( 25
μL) 定为 : 10 ×Taq酶 buffer 215μL, 10μmol·
L - 1 dNTPs 1 μL, ASGV 引物 0128 μmol·L - 1 ,
ACLSV 引物 0120 μmol·L - 1 , ASPV 引物 0116
μmol·L - 1 , 5 U ·μL - 1 Taq酶 015 μL, 模板 5
μL, 灭菌纯水补足 25μL。多重 PCR反应程序 :
94 ℃ 5 m in; 94 ℃ 40 s, 53 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 m in,
循环 35次 ; 72 ℃ 7 m in; 4 ℃终止反应。
212　多重 RT2PCR的灵敏性
经过核酸蛋白分析仪测定并计算出总 RNA的
量为 18175μg, 灵敏性测验结果表明 , 能同时检
测出 3种病毒的最大稀释限度为 10 - 2 , 即该体系
最低能从总 RNA量为 18715 ng的样品检测出 3种
病毒的存在情况 (图 3)。
213　多重 RT2PCR的特异性
结果显示 , 样品 3、5、9、10、11均带 3种
病毒 ; 样品 6带 ASGV和 ASPV两种病毒 , 样品 8
带 ACLSV 和 ASPV 两种病毒 ; 样品 12带 ASGV
和 ACLSV 两种病毒 , 样品 1、2、4、7 带仅带
ASPV一种病毒 (图 4) , 这与样品本身带毒情况
(表 1) 一致。
214　RT2PCR产物的测序
对 RT2PCR特异性目的产物进行回收、克隆和测序 , 得到与目标片段大小相符的 DNA序列 , AS2
GV序列为 524 bp, ACLSV为 358 bp, ASPV为 265 bp, 现已将所得到序列提交至 GenBank, ASGV、
ACLSV 和 ASPV 基因序列登录号为 FJ445218、 FJ445222 和 FJ445223。其中 ASGV 扩增片段
( FJ445218) 与两个日本分离物相似性均达 91%以上 , 与其他分离物相似性达 89%以上。ACLSV扩
增片段 ( FJ445222) 与日本分离物 (AB060961) 相似性达 93% , 与新疆分离物相似性均达 91% , 与
其他分离物同源性均在 83%以上。ASPV扩增片段 ( FJ445222) 与捷克分离物和中国兴城分离物相似
性均在 91%以上 , 与波兰和德国分离物相似性达 83%以上 (图 5)。
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图 5　FJ445218序列 ( ASGV)、FJ445222序列 ( ACL SV)、FJ445223序列 ( ASPV) 与其他分离物核苷酸序列的系统进化树
F ig. 5　Phylogenetic dendrogram of the ASGV, ACL SV, ASPV nucleotide seqences
3　讨论
建立多重 PCR检测体系时 , 引物的选择直接影响多重 PCR的检测质量 (丁芳 等 , 2006)。因
此 , 首先利用 DNAman软件对引物对之间进行分析 , 证实引物间不存在自身匹配和竞争性扩增 , 能
对后续的多重 PCR检测体系的优化以及扩增成功提供保障。本研究中退火温度对多重 PCR的扩增结
果影响不大 , 因此 , 作者认为选用 Tm相近的引物更有利于多重 PCR扩增。每对引物的用量也是一个
非常重要的因素 , 引物用量与扩增片段的大小明显相关 , 即片段越长 , 引物用量越多 , 这一结果与前
人的结论 (谢芝勋 等 , 2000; 丁芳 等 , 2006) 一致。本试验中增加 dNTPs、 Taq酶和模板的量对多
重 PCR的成功扩增起关键性的作用。适当延长 PCR的延伸时间对多重 PCR的扩增也有一定的帮助。
通过将多重 PCR产物序列与其他分离物序列进行比对发现 : 3种病毒序列与中国和日本的一些分
离物相似性较高 , 均在 91%以上 , 与其他大部分分离物相似性均在 83%以上 , 较高的同源性证明了
利用这 3对引物建立的多重 RT2PCR检测体系可以检测苹果上不同来源的 ASGV、ACLSV和 ASPV。
目前 , 许多研究者在建立多重 PCR检测体系时使用了内标 ( Gambino & Gnbaudo, 2006; 牛建新
等 , 2006) , 可以有效控制假阴性样品的出现 , 使得多重 PCR检测体系更加规范 , 值得借鉴。另外 ,
本研究建立的多重 RT2PCR检测体系仍需大量检测田间样本验证其实用性。
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