全 文 :园艺学报,2015,42 (12):2478–2488.
Acta Horticulturae Sinica
2478 doi:10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0484;http://www. ahs. ac. cn
收稿日期:2015–08–03;修回日期:2015–12–10
基金项目:浙江省竹木农业新品种选育重大科技专项重点项目(2012C12908-18);中国林业科学院亚热带林业研究所基本科研业务费
专项资金项目(RISF61253)
S基于 SR标记的板栗地方品种遗传多样性与关
联分析
江锡兵 1,汤 丹 1,龚榜初 1,*,赖俊声 2
(1 中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江省林木育种技术研究重点实验室,杭州 311400;2庆元县林业局,
浙江庆元 323800)
摘 要:采用 SSR 标记对山东等 10 个省份 95 个板栗地方品种的遗传多样性、群体结构进行分析,
并进行板栗 18 个农艺性状与 SSR 标记关联分析。结果表明:(1)17 对 SSR 引物在 95 个板栗品种中检测
出 44 个等位位点,平均为 2.6 个,Shannon’s 指数(I)和多态性信息含量(PIC)平均值分别为 0.67 和
0.352,遗传多样性较为丰富;(2)山东群体和江苏群体的多态性位点比率(P)最高,均达到 94.12%,
观察等位基因数(Na)分别为 2.53 和 2.18,亦高于其他群体;(3)根据 Evanno 等统计模型,92 个板栗
品种被划分为 3 个亚群,分别包含 25、40 和 27 个品种,且均有着复杂的地理起源,另有 3 个品种没有
明确的类群归属;(4)利用 GLM 和 MLM 模型进行关联分析,并经过假阳性检验,发现叶柄长度和淀粉
含量分别与标记 CsCAT 5 和 CsCAT 22 显著关联,关联系数分别为 0.4027 和 0.1869。
关键词:板栗;SSR;遗传多样性;群体结构;关联分析
中图分类号:S 664.2 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2015)12-2478-11
Genetic Diversity and Association Analysis of Local Cultivars of Chinese
Chestnut Based on SSR Markers
JIANG Xi-bing1,TANG Dan1,GONG Bang-chu1,*,and LAI Jun-sheng2
(1Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Key Laboratory of Tree Breeding of Zhejiang
Province,Hangzhou 311400,China;2Forestry Administration of Qingyuan County,Qingyuan,Zhejiang 323800,China)
Abstract:Genetic diversity and population structure of 95 local cultivars of Chinese chestnut
(Castanea mollissima BL.)from 10 provinces,such as Shandong etc.,were analyzed using SSR markers,
and association analysis was conducted with 18 agronomic traits,all of these laid the theoretical basis for
rational use and protection of the germplasm resources,and molecular marker-assisted breeding of Chinese
chestnut. The results showed:(1)Forty-four allelic loci were detected from 95 chestnut cultivars in 17 SSR
markers,the average was 2.6,and the mean of Shannon’s index(I)and polymorphism information content
(PIC)were 0.67 and 0.352,respectively,which reveal that the genetic diversity were abundant;
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:gongbc@126.com)
致谢:感谢山东省果树研究所刘庆忠研究员、陈新助理研究员为本研究提供板栗资源名称和试验材料。
江锡兵,汤 丹,龚榜初,赖俊声.
基于 SSR 标记的板栗地方品种遗传多样性与关联分析.
园艺学报,2015,42 (12):2478–1488. 2479
(2)Percentage of polymorphic loci of Shandong and Jiangsu population reach the highest of 94.12%,and
observed number of alleles(Na)of them were 2.53 and 2.18,respectively,which also higher than the other
provinces,indicated that genetic diversity of them were higher than the other provinces;(3)Ninety-two
chestnut cultivars were divided into three subgroups based on statistical model of Evanno etc.,the three
subgroups contain 25,40 and 27 cultivars,respectively,and their geographical origin were highly
complexly,however,the other three cultivars were clearly not assigned to any subgroup;(4)Petiole length
and starch cotent were significantly associated with CsCAT5 and CsCAT22 markers after a false positive
test by using GLM and MLM models,and their association coefficient were 0.4027 and 0.1869,
repectively.
Key words:Chinese chestnut;SSR;genetic diversity;population structure;association analysis
中国板栗地方品种多达 350 个,尚不包括有价值的遗传材料和东北的丹东栗(张宇和 等,2005)。
目前对中国板栗地方品种遗传多样性、亲缘关系分析等已有不少研究(周连第 等,2006;艾呈祥 等,
2007,2008;兰彦平 等,2010),但参试品种分布区域多集中于华北地区,对长江流域等板栗品种
群研究较少。中国板栗的育种研究主要以传统的选择育种和杂交育种为主,而真正意义上的分子标
记辅助育种研究开展甚少。关联分析(Association analysis)又称连锁不平衡作图(Linkage
disequilibrium mapping)或关联作图(association mapping),是一种以连锁不平衡为基础,鉴定某一
群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法,目前已广泛应用于农林作物,如水稻、玉
米、小麦、大豆、花生、棉花、杨树等。
本研究中以来自长江流域、华北及西北地区的板栗地方品种为材料,开展遗传多样性、群体结
构分析以及 SSR 标记与农艺性状关联分析研究,为板栗种质资源的合理利用与保护、分子标记辅助
育种奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以来自山东、河北等 10 个板栗主产区省(市)95 个品种(种植于山东省果树研究所国家板栗
资源圃)为材料(表 1)。2013 年 5—6 月,每份材料采集嫩叶 5 ~ 6 片,液氮速冻后保存于–70 ℃
超低温冰箱备用。
1.2 DNA提取及SSR标记扩增
采用改良的 CTAB 法(Stewart & Via,1993)提取基因组 DNA,经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测
质量和紫外分光光度计测定浓度后,加入 1× TE 溶液稀释成 DNA 母液,–20 ℃低温下保存备用。
参照 Marinoni 等(2003)的研究,选取 45 对栗属 SSR 引物,对部分参试样品进行扩增。经过
引物多态性筛选,最终选择 17 对条带清晰、多态性高、重复性好的引物(表 2)进行扩增试验。
PCR 反应体系为 10 μL,包含 100 ~ 200 ng 基因组 DNA、50 pmol 引物、0.25 U DNA Taq 聚合
酶、10× buffer、200 μmol L-1 dNTP 以及 2 mmol L-1 Mg2+。PCR 扩增程序为:94 ℃预变性 3 min;
94 ℃变性 30 s,退火 30 s,72 ℃延伸 1 min,30 个循环;72 ℃延伸 5 min 后于 4 ℃保存。PCR 产
物变性后在 6%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳,银染显影。
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表 1 板栗品种名称及其来源
Table 1 Name and source of chestnut cultivars
来源 Source 品种名称 Name of cultivar 编号 No. 来源 Source 品种名称 Name of cultivar 编号 No.
叶里藏 Yelicang 1 铁粒头 Tielitou 49
双合大红袍 Shuanghe Dahongpao 2
江苏 Jiangsu
大底青 Dadiqing 50
广德大红袍 Guangde Dahongpao 3 尖顶油栗 Jianding Youli 51
舒城大红袍 Shucheng Dahongpao 4 中明栗 Zhongmingli 52
粘底板 Niandiban 5 西祥沟无花 Xixianggou Wuhua 53
大红袍 Dahongpao 6 石丰 Shifeng 54
安徽 Anhui
软刺早 Ruancizao 7 杂 35 Za 35 55
燕昌 Yanchang 8 海丰 Haifeng 56
怀黄 Huaihuang 9 木口峪早生 Mukouyu Zaosheng 57
燕丰 Yanfeng 10 无名 2 号 Wuming 2 58
燕红 Yanhong 11 大公书 2 号 Dagongshu 2 59
辛庄 2 号 Xinzhuang 2 12 大公书 4 号 Dagongshu 4 60
北京 Beijing
怀九 Huaijiu 13 枣林 Zaolin 61
大叶青 Dayeqing 14 白露早 Bailuzao 62
短枝板红 Duanzhi Banhong 15 金丰 Jinfeng 63
官厅 7 号 Guanting 7 16 沂蒙短枝 Yimeng Duanzhi 64
东密坞无花 Dongmiwu Wuhua 17 小果短枝 Xiaoguo Duanzhi 65
西沟 7 号 Xigou 7 18 郯城 023 Tancheng 023 66
燕山短枝 Yanshan Duanzhi 19 西店 3 号 Xidian 3 67
燕奎 Yankui 20 徂徕短枝 Culai Duanzhi 68
遵达栗 Zundali 21 威丰 Weifeng 69
迁安 Qian’an 22 沭河 10 号 Shuhe 10 70
短刺大青袍 Duanci Daqingpao 23 沭河 11 号 Shuhe 11 71
河北 Hebei
东密坞 35 Dongmiwu 35 24 东丰 Dongfeng 72
高店 9 号 Gaodian 9 25 潘庄 1 号 Panzhuang 1 73
山店大板 Shandian Daban 26 无名 1 号 Wuming 1 74
高店 10 号 Gaodian 10 27 无名 3 号 Wuming 3 75
高店 1 号 Gaodian 1 28 沭河大袍 Shuhe Dapao 76
河南 Henan
栗园 8 号 Liyuan 8 29 超短枝 1 号 Chaoduanzhi 1 77
青毛早 Qingmaozao 30 黄前无花 Huangqian Wuhua 78
红油栗 Hongyouli 31 乌山 2 号 Wushan 2 79
闭口红 Bikouhong 32 烟泉 Yanquan 80
桂花香 Guihuaxiang 33 超短枝 2 号 Chaoduanzhi 2 81
红毛早 Hongmaozao 34 红光 Hongguang 82
八月红 Bayuehong 35 垂枝 2 号 Chuizhi 2 83
湖北 Hubei
九月寒 Jiuyuehan 36 垂枝 1 号 Chuizhi 1 84
邵阳它栗 Shaoyang Tali 37 浮来大红袍 Fulai Dahongpao 85
双季栗 Shuangjili 38 上丰 Shangfeng 86
湖南 Hunan
白云早 Baiyunzao 39 莱西大油栗 Laixi Dayouli 87
江苏 Jiangsu 炮车 7 号 Paoche 7 40
山东 Shandong
辐照 Fuzhao 88
重阳蒲 Chongyangpu 41 柞板 11 号 Zuoban 11 89
官兴大红袍 Guanxing Dahongpao 42 柞红栗 Zuohongli 90
优选处暑红 Youxuan Chushuhong 43 灰拣 Huijian 91
处暑红 Chushuhong 44
陕西 Shaanxi
寸栗 Cunli 92
焦刺替码 Jiaoci Tima 45 浙江 Zhejiang 魁栗 Kuili 93
短扎 Duanzha 46 紫油栗 Ziyouli 94
青毛软刺 Qingmao Ruanci 47 上光栗 Shangguangli 95
炮车 2 号 Paoche 2 48
1.3 数据分析
利用 POPGEN 1.32 软件对板栗品种遗传多样性指标进行统计分析,多态性信息含量(PIC)的
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计算参照顾竟等(2011)的方法。
应用 STRUCTURE 2.3.4 软件估测板栗品种的群体结构。方法:设定亚群数,K = 1 ~ 11,将
MCMC(Markov Chain Monte Carlo)开始时的不作数迭代设为10 000次,再将不作数迭代后的MCMC
设为 100 000 次,每个 K 值重复迭代次数设置为 10。最终依据 Evanno 等(2005)的统计模型,以
最大似然法和∆K 值确定 K 值,作为群体的亚群数。计算 Q 参数,作为关联分析的协变量。
SPAGeDi 1.3 软件被用于估算品种两两个体之间的亲缘关系(Hardy & Vekemans,2002),kinship
矩阵(K)中所有小于 0 的亲缘关系值被调整为 0(Yu & Buckler,2006)。
采用 Tassel 3.0 软件中的一般线性模型(general linear model,GLM)和混合线性模型(mixed linear
model,MLM)对 SSR 标记和板栗 18 个农艺性状进行关联分析。GLM 以 Q 作为协变量进行回归分
析;MLM 采用 Q + K 方法分析。Q-value 软件(http://genomics. princeton. edu/storeylab/qvalue/)
用于检测各模型中伪关联情况。
2 结果与分析
2.1 板栗地方品种的遗传多样性
95 个板栗地方品种在 17 对 SSR 引物中的遗传多样性指数如表 2 所示。图 1 示引物 CSCAT3 的
SSR 扩增图谱。17 对引物共检测出 44 个多态性等位位点,等位位点数变幅为 2 ~ 5 个,平均为 2.6
个,其多态性程度较低。Shannon’s 指数(I)平均值为 0.67,其中引物 CsCAT5 最高(I = 1.31),引
物 CsCAT14 最低(I = 0.33)。作为物种遗传多样性评价的标准,17 对引物的多态性信息含量(PIC)
表 2 板栗品种在 17 对 SSR 引物中的遗传多样性指数
Table 2 Genetic diversity indices of chestnut cultivars in 17 SSR markers
引物名称 Marker 重复类型 Repeat type Na Ne I PIC Ho He Nm
CsCAT2 (AG)16 2 1.67 0.59 0.321 0.3488 0.4047 1.9829
CsCAT3 (AG)20 2 1.79 0.63 0.344 0.1213 0.4468 1.0438
CsCAT4 (CA)23 2 1.59 0.56 0.303 0.2022 0.3743 1.9944
CsCAT5 (GA)20 4 3.47 1.31 0.660 0.1667 0.7182 0.4477
CsCAT8 (GT)7(GA)20 5 2.47 1.07 0.513 0.3222 0.5992 0.9944
CsCAT14 (CA)22 2 1.22 0.33 0.166 0.1739 0.1836 1.9432
CsCAT15 (TC)12 3 1.79 0.78 0.396 0.1182 0.4452 1.0974
CsCAT16 (TC)20 3 2.42 0.95 0.498 0.1943 0.5932 0.5994
CsCAT18 (CA)12CG(CA)10 2 1.63 0.58 0.318 0.2347 0.3984 2.1631
CsCAT20 (AC)4(AT)3A(AT)3 2 1.63 0.55 0.403 0.2847 0.3698 1.7853
CsCAT21 (TG)10TA(TG)12 2 1.30 0.39 0.203 0.2644 0.2307 2.9286
CsCAT22 (AC)21 3 2.02 0.72 0.383 0.4946 0.5079 1.2811
CsCAT24 (AG)17 2 1.23 0.34 0.171 0.2118 0.1905 6.9907
CsCAT26 (CT)25 2 1.28 0.38 0.197 0.1566 0.2223 1.5770
CsCAT32 (AC)4TC(AC)3 2 1.67 0.59 0.320 0.5109 0.4029 5.7156
CsCAT33 (GA)5GG(GA)11 3 2.70 1.05 0.558 0.2182 0.6350 0.6642
CsCAT41 (AG)20 3 1.37 0.49 0.242 0.1449 0.2742 0.9285
均值 Average 2.6 1.85 0.67 0.352 0.2427 0.3927 2.0022
注:SSR 引物来源于 Marinoni 等(2003)。Na:观察等位基因数;Ne:有效等位基因数;I:Shannon’s 指数;PIC:多态性信息含量;
Ho:观测杂合度;He:期望杂合度;Nm:基因流。
Note:SSR name and repeat type were from Marinoni et al.(2003). Na:Observed number of alleles;Ne:Effective number of alleles;I:
Shannon’s information index;PIC:Polymorphism information content;Ho:Observed heterozygosity;He:Expected heterozygosity;Nm:Gene
flow.
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平均值为 0.352,处于中等水平,其中,引物 CsCAT5(PIC = 0.660)、CsCAT8(PIC = 0.513)和 CsCAT33
(PIC = 0.558)为高度多态性位点,而引物 CsCAT14、CsCAT21、CsCAT24、CsCAT26 和 CsCAT41
的多态性含量较低(PIC < 0.25)。17 对引物观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的平均值分别为
0.2427、0.3927,总体来说 Ho 偏离 He(其中 14 对引物的 He值高于 Ho 值)。基因流(Nm)平均值为
2.0022,表明板栗各品种间存在较为频繁的基因交流。
图 1 部分板栗品种的 SSR 扩增图谱(引物 CsCAT3)
Fig. 1 SSR patterns of part of chestnut cultivars by CsCAT3
进一步对 10 个板栗群体进行遗传多样性分析(表 3),结果显示,山东群体和江苏群体的多态
性位点比率(P)最高,均达到 94.12%,观察等位基因数(Na)分别为 2.53 和 2.18,亦高于其他省
份,表明山东和江苏板栗群体遗传多样性较高。
表 3 板栗不同群体(省份)遗传多样性
Table 3 Genetic diversity of chestnut from different population(provinces)
群体 Population Na Ne I P Ho He
安徽 Anhui 1.88 1.58 0.49 82.35 0.2241 0.3683
北京 Beijing 1.94 1.63 0.49 82.35 0.1549 0.3696
河北 Hebei 2.12 1.66 0.55 92.17 0.2152 0.3530
河南 Henan 1.88 1.51 0.45 82.35 0.1245 0.3329
湖北 Hubei 2.06 1.63 0.52 82.35 0.2228 0.3667
湖南 Hunan 1.59 1.43 0.36 58.82 0.1961 0.3137
江苏 Jiangsu 2.18 1.65 0.52 94.12 0.2255 0.3398
山东 Shandong 2.53 1.76 0.60 94.12 0.2020 0.3717
陕西 Shaanxi 1.59 1.50 0.34 47.06 0.1520 0.2710
浙江 Zhejiang 1.75 1.47 0.40 64.71 0.1667 0.3292
注:Na:观察等位基因数;Ne:有效等位基因数;I:Shannon’s 指数;P:多态位点比率;Ho:观测杂合度;He:期望杂合度。
Note:Na:Observed number of alleles;Ne:Effective number of alleles;I:Shannon’s information index;P:Percentage of polymorphic loci.
Ho:Observed heterozygosity;He:Expected heterozygosity.
2.2 板栗地方品种的群体结构分析
95 个板栗品种的引物标记在 STRUCTURE 2.3.4 软件中的自然对数 lnP(D)值从 K = 1 到 K = 11
持续增加,依据 Evanno 等(2005)的统计模型,以最大似然法和∆K 值确定亚群数(图 2)。
结果表明,理想的群体结构数是 K = 3,此时∆K 具有明显的峰值(∆K = 22.53)。据此,95 个板
栗品种理论上可以被划分为 3 个亚群(分别命名为 POP1、POP2 和 POP3,图 3),3 个亚群的平均混
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图 3 95 个板栗地方品种的群体结构划分
Fig. 3 Population structure of 95 local cultivars of chestnut
K = 3.
合度为 0.079。每个品种都是依据 Q 值(第 i
份材料 SSR 位点变异源于第 K 群体的概率)
进行归类,分析 95 个板栗品种在不同群体的 Q
值时发现,92 个品种在某一类群中的 Q 值大于
或等于 0.5,推测其遗传组分相对比较单一,可
以被划分到 3 个亚群中。
图 2 不同 K 值下∆K 值变化
L(K)、m 和 s 分别指自然对数 lnP(D)值、参数的
平均值和标准差,L’(K)= L(K + 1)+
L(K–1)–2L(K)。
Fig. 2 Change of delta K values(∆K)based on K values
L(K),m and s represent the lnP(D),mean values
and standard deviation respectively,and L’(K)=
L(K + 1)+ L(K–1)–2L(K).
根据图 3 分析得出,3 个亚群中的 92 个板
栗品种并未完全按照其地理起源而聚类,但每
个亚群中品种分布具有一定的规律。
亚群 1 包含来自 10 个省份的 25 个品种,
其中 14 个板栗品种来自山东(6 个)、河北(4
个)、河南(4 个)等 3 省,其余 11 个品种分
布于其他 7 个省份,表明亚群 1 以华北地区板
栗品种为主。
亚群 2 包含 40 个品种,分布于 9 个省份,
其中山东(17 个)、河北(6 个)、江苏(4 个)、
湖北(4 个)等 4 个省份板栗品种在亚群 2 中
比例达 77.5%,亚群 2 以华北地区和长江流域
板栗品种为主。
亚群 3 包含 27 个品种,与亚群 2 类似,
品种主要分布于华北地区的山东(13 个)、北
京(3 个)和长江流域的江苏(5 个)、安徽(2
个)4 省。此外,‘叶里藏’(1 号)、‘西祥沟无
花’(53 号)和‘大公书 2 号’(59 号)等 3
个板栗品种在某一类群中的 Q 值小于 0.5,因
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此,这 3 个品种没有明确的类群归属特性。
2.3 板栗地方品种间亲缘关系分析
利用 17 对多态性 SSR 引物对 95 个板栗地方品种两两个体之间亲缘关系进行分析,结果(图 4)
表明,不同品种间的亲缘关系估计值差异明显,且估计值与所占比例呈负相关关系。其中,52.3%
的板栗品种间亲缘关系值为 0,46.4%的板栗品种间亲缘关系值介于 0 到 0.5 之间,只有 1.3%的板栗
品种两两间的亲缘关系值大于 0.5。亲缘关系估计值分析说明大部分板栗品种间遗传差异较大,存
在广泛的遗传变异;而部分品种间亲缘关系较近,如来自山东的‘枣林’(61 号)和‘沂蒙短枝’(64
号),亲缘关系值为 0.82,来自北京的‘燕昌’(8 号)和来自河北的‘迁安’(22 号),其亲缘关系
值达到 0.85,这些品种在地理起源上邻近,推测其在引种栽培及驯化过程中可能存在交叉渗入或亲
本基因型的参与。
图 4 95 个板栗地方品种两两个体间亲缘关系分布图
Fig. 4 Distribution of 95 C. mollissima cultivars based on pairwise relative kinship estimates
2.4 板栗品种农艺性状与SSR标记关联分析
利用 TASSEL 软件中的 GLM 和 MLM 模型,将 95 个板栗地方品种的 18 个农艺性状与 SSR 标
记进行关联分析(表 4)。
GLM 模型中有 7 对引物与坚果长度、坚果宽度等 10 个性状在 P < 0.01 水平上相关联,各引物
对性状的解释率在 0.1047 ~ 0.4027 之间;各引物中,引物 CsCAT5 关联的性状最多,分别与淀粉含
量、叶柄长度、叶脉数、叶脉分支角及叶缘齿数共 5 个性状关联,解释率 0.2147 ~ 0.4027;各性状
中,与淀粉含量关联的引物最多(CsCAT4、CsCAT5 和 CsCAT22),解释率分别为 0.1151、0.2197
和 0.1869。在 MLM 模型中,有 2 对 SSR 引物与 3 个性状在 P < 0.01 水平上相关联,引物 CsCAT3
与叶柄长度关联(解释率为 0.2422),引物 CsCAT5 与叶柄长度、叶脉数和叶缘齿数相关联(解释率
分别为 0.4027、0.2063 和 0.2072)。
经过 Q-value 软件的假阳性检验(FDR < 0.05)后,多数引物和性状不再显著关联,只有少数引
物与性状显著关联。其中,GLM 模型中,叶柄长度与引物 CsCAT5、淀粉含量与引物 CsCAT22 显
著关联;MLM 模型中,叶柄长度与引物 CsCAT5 显著关联。
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表 4 板栗 18 个农艺性状与 SSR 标记的关联性
Table 4 Association of 18 agronomic traits with SSR markers for chestnut cultivars
GLM MLM 性状
Trait
平均值
Average CsCAT3 CsCAT4 CsCAT5 CsCAT15 CsCAT22 CsCAT32 CsCAT33 CsCAT3 CsCAT5
坚果长度/mm Nut length 27.49 ± 0.78 0.1922
坚果宽度/mm Nut width 31.06 ± 1.14 0.2074
果形指数 Nut shape index 0.89 ± 0.03
单果质量/g Nut weight 10.56 ± 0.88 0.2373 0.1237
淀粉含量/%
Starch content
24.47 ± 1.89 0.1151 0.2197 0.1869*
可溶性糖含量/%
Soluble sugar content
13.23 ± 1.02
蛋白质含量/%
Protein content
6.29 ± 0.44 0.1207 0.1047
钙含量/(mg · g-1)
Ca content
0.80 ± 0.04 0.1979 0.2386
铁含量/(mg · g-1)
Fe content
0.016 ± 0.002
叶片长度/cm Leaf length 16.8 ± 0.9
叶片宽度/cm Leaf width 7.1 ± 0.5
叶形指数 Leaf shape index 2.4 ± 0.1
叶柄长度/cm
Petiole length
1.5 ± 0.2 0.2422 0.4027* 0.2422 0.4027*
叶脉数 Veins number 30.5 ± 1.4 0.2233 0.2063
叶脉分支角/°
Vein branch angle
57.8 ± 2.9 0.2648
叶基角/° Leaf basic angle 110.8 ± 7.1
叶尖角/° Leaf tip angle 33.2 ± 3.5
叶缘齿数
Leaf margin teeth number
27.8 ± 1.5 0.2147 0.2072
* FDR < 0.05。
3 讨论
3.1 板栗地方品种的遗传多样性
微卫星引物序列(SSR)常被用来发现物种之间新的标记(Du et al.,2010)。本研究中,17 对
SSR 引物在 95 个板栗品种中平均观察到 2.6 对等位基因,低于其他类似的研究。如:田华等(2009)
和黄武刚等(2010)对中国部分板栗野生群体遗传多样性研究发现等位基因数为 16 和 8.4;Martin 等
(2010)在 9 个欧洲板栗群体中检测到 5.7;Nishio 等(2011)在 142 份日本板栗品种中检测到 15.8。
较低的等位基因数或因所选的材料均为地方栽培品种,经过长期的人工定向选择导致一些稀有基因
的丢失。95 个板栗地方品种的平均观察杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别为 0.2427 和 0.3927,
相对而言较低。杂合性是基因多样性的一个重要评价尺度(Slatkin & Barton,1989),较低的 He和
Ho 值可能与引物数量和试验中选取的样品及其群体数量有关(Ferrer et al.,2004)。在 17 对 SSR 引
物中,Ho 总体是偏离 He(其中 14 对引物的 He值高于 Ho 值)的,表明所选用的 SSR 引物分布在染
色体组的静默区或活跃区(Du et al.,2012)。Wright(1931)认为,当群体中的 Nm值大于 1 时,基
因流可以有效的阻止不同区域群体间的遗传分化。95 个板栗地方品种的平均 Nm为 2.0022,表明各
板栗品种间存在着较为频繁的基因交流,从而减少了因遗传漂变引起的群体间分化。
10 个板栗产区的群体遗传多样性分析表明,山东省和江苏省遗传多样性高于其他省份,研究结
果与暴朝霞和黄宏文(2002)的一致。山东省板栗栽培历史悠久,过去长期采用实生繁殖,群体庞
Jiang Xi-bing,Tang Dan,Gong Bang-chu,Lai Jun-sheng.
Genetic diversity and association analysis of local cultivars of Chinese chestnut based on SSR markers.
2486 Acta Horticulturae Sinica,2015,42 (12):2478–2488.
大,单株性状纷杂多样,且品种多为实生单株人工选优的产物,归根结底是性状各异的天然杂种,
还有极少数人工杂种。江苏省地处长江流域,板栗野生资源及栽培品种数量多,且其形态、生理特
征变异大(郎萍和黄宏文,1999),具有丰富的物种及基因多样性。
3.2 板栗地方品种的群体结构分析
群体结构即群体内亚群的存在情况,包括群体大小与遗传结构。群体结构分析对研究物种进化
与指导选择具有重要的意义。STRUCTURE 软件分析群体结构是基于等位基因频率,并依据样本在
不同亚群中的 Q 值而归类。本试验中根据 95 个研究材料的遗传复杂程度,将遗传相似性比例(Q)
大于 0.5 的材料划分到某个单一的类群中,发现 92 个板栗品种可以被清楚地划分到 3 个亚群中,仅
有 3 个样本没有明显的分类归属。划分到 3 个亚群的品种具有多样的地理起源,不同地理来源的品
种聚类到同一类群或相同地理来源的品种存在不同的类群划分,不完全与其地理分布相关联,本研
究结果与暴朝霞和黄宏文(2002)、兰彦平等(2010)对板栗的 UPGMA 聚类结果类似。表明不同
地理来源的板栗品种在引种栽培过程中存在同物异名、同名异物及错名现象,或部分品种为芽变育
种,以及引种过程中混淆了原产地和引种地等。品种间亲缘关系分析显示,部分品种(比例为 1.3%)
两两间亲缘关系值大于 0.5,亦表明同物异名等现象的存在,或在栽培过程中不同品种间有交叉渗
入、亲本基因型参与的现象。同时研究结果也表明板栗品种多样性丰富,品种间存在广泛的遗传变
异,且某些品种在特定的生境下已经形成相对独立的遗传结构,这与板栗地方品种的农艺性状多样
性研究结果(江锡兵 等,2013,2014)一致。
3.3 板栗农艺性状与SSR标记关联分析
Thornsberry 等(2001)第一次在玉米上应用关联分析,现其已作为有力的工具用来确定数量性
状位点(Flint-Garcia et al.,2003),并在杨树(黄秦军 等,2007)、小麦(Chen et al.,2012)、水稻
(Gupta et al.,2014)等植物中广泛运用。本研究中采用一般线性模型(GLM)进行关联分析时,
只考虑群体结构 Q 的影响,伪关联不能完全被排除。而混合模型(MLM)添加亲缘关系对关联分
析的影响,比一般线性模型能更好的控制错误,降低伪关联(Flint-Garcia et al.,2005;Yu & Buckler,
2006)。本研究中以 GLM 和 MLM 两种模型对板栗品种农艺性状和 SSR 引物进行关联分析,在两种
模型中,均存在同一引物和多个性状相关联或同一性状与多个引物相关联的现象,表明板栗多数农
艺性状是受多基因控制的数量性状。然而,关联的性状—引物经过假阳性检验(FDR < 0.5),大多
数显著关联的性状为伪关联。在 GLM 模型中仅叶柄长度和淀粉含量显著地与引物 CsCAT5 和
CsCAT22 关联,在 MLM 模型中则只有叶柄长度与引物 CsCAT5 关联。叶柄是完全叶的三大组成部
分之一,直接与叶片形态、生理特征等相联系(Peng & Harberd,1997),进而影响叶基角、冠层结
构、同化物的运输和存储(黄方 等,2005)。引物 CsCAT5 与叶柄长度显著关联,表明其可能在一
定程度上影响叶片的生长与功能。淀粉是板栗坚果的主要组成成分,占干质量的 40% ~ 60%,其含
量直接影响到板栗的产量和品质,引物 CsCAT22 与淀粉含量显著关联,推测其可能对提高板栗产量、
改善板栗品质等起到重要作用。
本研究的结果系统地揭示了来自 10 个板栗主产区(省、市)的 95 个地方品种的遗传多样性、
群体结构以及品种间亲缘关系,并首次采用关联分析确定与板栗农艺性状显著相关的 SSR 标记,研
究结果将为板栗种质资源的合理利用与保护、分子标记辅助育种奠定重要的理论基础。然而,关于
CsCAT5 和 CsCAT22 标记是如何调节叶柄长度和淀粉含量以及相互作用机理,仍需要开展更深入的
研究来验证。
江锡兵,汤 丹,龚榜初,赖俊声.
基于 SSR 标记的板栗地方品种遗传多样性与关联分析.
园艺学报,2015,42 (12):2478–1488. 2487
References
Ai Cheng-xiang,Yu Xian-mei,Zhang Li-si,Liu Qing-zhong. 2007. Development and characterization of SSR markers in Chinese patial chestnut
(Castanea mollissima)cultivars. Journal of Agricultural Biotechnology,15 (2):283–289. (in Chinese)
艾呈祥,余贤美,张力思,刘庆忠. 2007. 中国部分板栗品种的 SSR 标记. 农业生物技术学报,15 (2):283–289.
Ai Cheng-xiang,Zhang Li-si,Wei Hai-rong,Liu Qing-zhong. 2008. Studies on the genetic diversity of some chestnut(Castanea)cultivars by AFLP
analysis. Acta Horticulture Sinica,35 (5):747–752. (in Chinese)
艾呈祥,张力思,魏海蓉,刘庆忠. 2008. 部分板栗品种遗传多样性的 AFLP 分析. 园艺学报,35 (5):747–752.
Bao Zhao-xia,Huang Hong-wen. 2002. Analysis of genetic diversity and genetic relationships of Chinese chestnut. Acta Horticulturae Sinica,29 (1):
13–19. (in Chinese)
暴朝霞,黄宏文. 2002. 板栗主栽品种的遗传多样性及其亲缘关系分析. 园艺学报,29 (1):13–19.
Chen X J,Min D H,Yasir T A,Hu Y G. 2012. Genetic diversity,population structure and linkage disequilibrium in elite Chinese winter wheat
investigated with SSR markers. PLoS ONE,7 (9):e44510. doi:10.1371/journal.pone. 0044510
Du Q Z,Wang B W,Wei Z Z,Zhang D Q,Li B L. 2012. Genetic diversity and population structure of Chinese white poplar(Populus tomentosa)
revealed by SSR markers. The Journal of Heredity,103 (6):853–862.
Du X Y,Chen Z W,Li W,Tan Y Q,Lu J,Zhu X D,Zhao T Y,Dong G,Zeng L. 2010. Development of novel microsatellite DNA markers by
cross-amplification and analysis of genetic variation in gerbils. The Journal of Heredity,101 (6):710–716.
Evanno G,Regnaut S,Goudet J. 2005. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE:A simulation study.
Molecular Ecology,14 (8):2611–2620.
Ferrer M M,Eguiarte L E,Montana C. 2004. Genetic structure and outcrossing rates in Flourensia cernua(Asteraceae)growing at different densities
in the South-western Chihuahuan Desert. Annals of Botany,94 (3):419–426.
Flint-Garcia S A,Thornsberry J M,Buckler E S 4th. 2003. Structure of linkage disequilibrium in plants. Annu Rev Plant Biol,54:357–374.
Flint-Garcia S A,Thuillet A C,Yu J,Pressoir G,Romero S M,Mitchell S E,Doebley J,Kresovich S,Goodman M M,Buckler E S. 2005. Maize
association population:A high-resolution platform for quantitative trait locus dissection. Plant J,44 (6):1054–1064.
Gu Jing,Li Ling,Zong Xu-xiao,Wang Hai-fei,Guan Jian-ping,Yang Tao. 2011. Association analysis between morphological traits of pea and its
polymorphic SSR markers. Journal of Plant Genetic Resources,12 (6):833–839. (in Chinese)
顾 竟,李 玲,宗绪晓,王海飞,关建平,杨 涛. 2011. 豌豆种质表型性状 SSR 标记关联分析. 植物遗传资源学报,12 (6):833–
839.
Gupta S,Kumari K,Muthamilarasan M,Parida S K,Prasad M. 2014. Population structure and association mapping of yield contributing agronomic
traits in foxtail millet. Plant Cell Rep,33 (6):881–893.
Hardy O J,Vekemans X. 2002. SPAGeDi:A versatile computer program to analyse spatial genetic structure at the individual or population
levels. Molecular Ecology Notes,2 (4):618–620.
Huang Fang,Meng Qing-chang,Zhao Tuan-jie,Gai Jun-yi,Yu De-yue. 2005. Genetic analysis and RAPD markers of genes related to short petiole
in soybean. Acta Agronomica Sinica,31 (6):818–820. (in Chinese)
黄 方,孟庆长,赵团结,盖钧镒,喻德跃. 2005. 大豆短叶柄性状的遗传分析和 RAPD 标记研究. 作物学报,31 (6):818–820.
Huang Qin-jun,Ding Ming-ming,Zhang Xiang-hua,Su Xiao-hua. 2007. Association analysis between SSR molecular and wood properties of
Populus nigra. Scientia Silvae Sinicae,43 (2):43–47. (in Chinese)
黄秦军,丁明明,张香华,苏晓华. 2007. SSR 标记与欧洲黑杨材性性状的关联分析. 林业科学,43 (2):43–47.
Huang Wu-gang,Cheng Li-li,Zhou Zhi-jun,Liu Jian-li. 2010. SSR analysis on genetic diversity of wild Chinese chestnut populations. Journal of
Fruit Science,27 (2):227–232. (in Chinese)
黄武刚,程丽莉,周志军,刘建立. 2010. 板栗野生居群遗传多样性研究. 果树学报,27 (2):227–232.
Jiang Xi-bing,Gong Bang-chu,Liu Qing-zhong,Chen Xin,Wu Kai-yun,Deng Quan-en,Tang Dan. 2014. Phenotypic diversity of important
agronomic traits of local cultivars of Chinese chestnut. Acta Horticulturae Sinica,41 (4):641–652. (in Chinese)
江锡兵,龚榜初,刘庆忠,陈 新,吴开云,邓全恩,汤 丹. 2014. 中国板栗地方品种重要农艺性状的表型多样性. 园艺学报,41 (4):
Jiang Xi-bing,Tang Dan,Gong Bang-chu,Lai Jun-sheng.
Genetic diversity and association analysis of local cultivars of Chinese chestnut based on SSR markers.
2488 Acta Horticulturae Sinica,2015,42 (12):2478–2488.
641–652.
Jiang Xi-bing,Gong Bang-chu,Tang Dan,Liu Qing-zhong,Chen Xin,Wu Kai-yun,Deng Quan-en. 2013. Genetic variation of nut phenotype and
nutrient of some of Chinese chestnut cultivars. Acta Bot Boreal-Occident Sin,33 (11):2216–2224. (in Chinese)
江锡兵,龚榜初,汤 丹,刘庆忠,陈 新,吴开云,邓全恩. 2013. 中国部分板栗品种坚果表型及营养成分遗传变异分析. 西北植物
学报,33 (11):2216–2224.
Lan Yan-ping,Zhou Lian-di,Yao Yan-wu,Wang Shang-de,Liu Guo-bin. 2010. Analysis of Castanea mollissima germplasm resource by AFLP. Acta
Horticulturae Sinica,37 (9):1499–1506. (in Chinese)
兰彦平,周连第,姚研武,王尚德,刘国彬. 2010. 中国板栗种质资源的 AFLP 分析. 园艺学报,37 (9):1499–1506.
Lang Ping,Huang Hong-wen. 1999. Genetic diversity and geographic variation in natural populations of the endemic Castanea species in China.
Acta Botanica Sinica,41 (6):651–657. (in Chinese)
郎 萍,黄宏文. 1999. 栗属中国特有种居群的遗传多样性及地域差异. 植物学报,41 (6):651–657.
Marinoni D,Akkak A,Bounous G,Edwards K J,Botta R. 2003. Development and characterization of microsatellite markers in Castanea sativa
(Mill.). Molecular Breeding,11 (2):127–136.
Martin M A,Mattioni C,Marcello C,Taurchini D,Villani F. 2010. Genetic diversity in European chestnut populations by means of genomic and
genetic microsatellite markers. Tree Genetics and Genomes,6 (5):735–744.
Nishio S,Yamamoto T,Terakami S,Sawamura Y,Takada N,Saito T. 2011. Genetic diversity of Japanese chestnut cultivars assessed by SSR markers.
Breeding Science,61 (2):109–120.
Peng J,Harberd N P. 1997. Gibberellin deficiency and response mutations suppress the stem elongation phenotype of phytochrome deficient mutants
of Arabidopsis. Plant Physiol,113 (4):1051–1058.
Slatkin M,Barton N. 1989. A comparison of three indirect methods for estimating average levels of gene flow. Evolution,43:1349–1368.
Stewart C N Jr,Via L E. 1993. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications. Biotechniques,
14 (5):748–750.
Thornsberry J M,Goodman M M,Doebley J,Kresovich S,Nielsen D,Buckler E S 4th. 2001. Dwarf8 polymorphisms associate with variation in
flowering time. Nature Genetics,28 (3):286–289.
Tian Hua,Kang Ming,Li Li,Yao Xiao-hong,Huang Hong-wen. 2009. Genetic diversity in natural populations of Castanea mollissima inferred from
nuclear SSR markers. Biodiversity Science,17 (3):296–302. (in Chinese)
田 华,康 明,李 丽,姚小洪,黄宏文. 2009. 中国板栗自然居群微卫星(SSR)遗传多样性. 生物多样性,17 (3):296–302.
Wright S. 1931. Evolution in mendelian populations. Genetics,16 (2):97–159.
Yu J,Buckler E S. 2006. Genetic association mapping and genome organization of maize. Curr Opin Biotechnol,17 (2):155–160.
Zhang Yu-he,Liu Liu,Liang Wei-jian,Zhang Yu-ming. 2005. Fruit flora of China:Chestnut and hazelnut volume. Beijing:Chinese Forestry
Publishing House:9–17. (in Chinese)
张宇和,柳 鎏,梁维坚,张育明. 2005. 中国果树志 · 板栗榛子卷. 北京:中国林业出版社:9–17.
Zhou Lian-di,Lan Yan-ping,Han Zhen-hai. 2006. Study on heritance diversity of Chinese chestnut(Castanea mollissima)variety resources at
molercular level. Acta Agriculturae Boreali-Sinica,21 (3):81–85. (in Chinese)
周连第,兰彦平,韩振海. 2006. 板栗品种资源分子水平遗传多样性研究. 华北农学报,21 (3):81–85.