全 文 ：书新 疆 农 业 大 学 学 报 2014，37( 4) : 327 ～ 332
Journal of Xinjiang Agricultural University
文章编号:1007-8614(2014)04-0327-06
李属坏死环斑病毒(PNＲSV)ＲT-LAMP
检测方法的建立
韩 剑1，罗 明1，殷智婷1，周国辉2，张祥林3
(1．新疆农业大学 农学院，乌鲁木齐 830052;2．华南农业大学 资源与环境学院，广州 510642;3．新疆出入境检
疫检验局，乌鲁木齐 830052)
摘 要: 针对李属坏死环斑病毒(PNＲSV)外壳蛋白(CP)基因保守序列，设计了 1 套特异性识别 CP基因中 6 个不
同区段的环介导等温扩增(LAMP)引物。通过对反应条件的优化，建立了适用于 PNＲSV 的 ＲT-LAMP 检测技术，对
优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示，此方法能够特异性的检测出 PNＲSV，对马铃薯 X病毒(PVX)、马
铃薯 Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)的检测均为阴性，灵敏度高于 ＲT-PCＲ 10 倍。
关键词: 李属坏死环斑病毒(PNＲSV) ;反转录环介导等温扩增(ＲT-LAMP) ;CP基因;检测
中图分类号:S436． 629 文献标识码:A
Development of Ｒeverse Transcription Loop-mediated Isothermal
Amplification Assay for Detection of Prunus Necrotic Ｒingspot Virus
HAN Jian1，LUO Ming1，YIN Zhi-ting1，ZHOU Guo-hui2，ZHANG Xiang-lin3
(1． College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;2． College of Natural
Ｒesources and Environment，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;3． Xinjiang
Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau，Urumqi 830052，China)
Abstract: A set of four specific LAMP primers were designed to recognize six distinct regions，according to the
gene sequence of coat protein in prunus necrotic ringspot virus (PNＲSV)． Based on optimization of reaction condi-
tions，ＲT-LAMP detection method was developed which was treated with specific techniques and was evaluated． It
suggested that PNＲSV can be found by the method． The amplified fragments were not found in the samples of potato
virus X (PVX) ，potato virus Y (PVY) ，cucumber mosaic virus (CMV) ，broad bean wilt virus (BBWV)and the
sensitivity for the detection of PNＲSV was 10 times higher than the traditional ＲT-PCＲ method．
Key words: prunus necrotic ringspot virus (PNＲSV) ;reverse transcription loop-mediated isothermal amplifica-
tion (ＲT-LAMP) ;coat protein gene (CP) ;detection
李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot vi-
rus，PNＲSV)可危害多种果树、花卉等经济作物，寄
主遍及 21 个科、47 个属 189 种植物，寄主一旦感
染，终生带毒，逐年加重，可引起叶片坏死环斑和穿
孔，果实畸形，品质下降，腐烂加快，树体急剧衰退，
提早枯死，导致大幅度减产甚至绝产［1 － 3］。要从根
本上解决 PNＲSV的防治问题必须采取有效的预防
措施，加强种子、苗木的检疫检验，建立无病苗木繁
育体系，从源头上杜绝病原才是控制 PNＲSV发生蔓
延和安全防控的根本途径，而构建和应用先进的
收稿日期:2014 － 04 － 23
基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2012211B25)
通讯作者:罗 明，E-mail:luomingxjau@ sina． com
新 疆 农 业 大 学 学 报 2014 年
病原检测技术是果树安全生产的核心所在。目
前，ＲT-PCＲ［4］、IC-ＲT-PCＲ［5］或实时荧光 PCＲ［6］
已成为 PNＲSV 检测的重要手段，但这些检测方
法对于设备和技术的要求较高，大多数基层检疫
机构很难做到。环介导等温扩增技术(loop-medi-
ated isothermal amplification，LAMP)具有快速，特
异性强，灵敏度高，操作简单，不需要复杂的仪
器，肉眼可直接观察检测结果等优点，非常适合
于基层及现场使用［7，8］。本研究根据 LAMP 原
理，建立了 PNＲSV ＲT-LAMP 检测方法，并以出现
焦磷酸镁白色沉淀作为结果的判定标准，可快
速、准确的检测出 PNＲSV，为 PNＲSV 的快速诊断
提供了一种更加简便的方法。
1 材料与方法
1． 1 材 料
带病毒材料取自新疆喀什地区部分巴旦木
果园中已通过双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-
ELISA)和 ＲT-PCＲ 检测确定带有李属坏死环斑
病毒的巴旦木树，以当年生的巴旦木幼嫩叶片和
枝条为试材，样品保存于 4 ℃冰箱和液氮中。同
时以健康巴旦木枝叶作为对照。马铃薯 X 病毒
(PVX)、马铃薯 Y 病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒
(CMV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)均由新疆农业大
学植物病理系保存并提供。
1． 2 主要试剂
植物总 ＲNA 提取试剂盒(ＲNAplant plus Ｒe-
agen，TIANGEN)、dNTPs、Taq DNA聚合酶购自北京
天根生化科技有限公司;反转录试剂盒(BioTeke su-
per ＲT Kit)购自北京百泰克生物技术有限公司;Bst
DNA聚合酶大片段、1 × ThermoPol 反应缓冲液为北
京纽英伦 NEB生物技术有限公司产品;甜菜碱(Be-
tain)购自上海生工生物工程公司。
1． 3 巴旦木总 ＲNA的提取
取 0． 1 g新鲜巴旦木叶片和幼嫩枝条在液氮中
研磨至粉末，采用植物总 ＲNA提取试剂盒抽提样品
总 ＲNA。抽提 ＲNA 产物加入 DEPC-ddH2O 溶解，
－ 70 ℃保存备用。
1． 4 cDNA的合成
以提取的巴旦木样品总 ＲNA为模板，反转录合
成 cDNA第 1 条链。反转录体系(20 μL) :ＲNA 模
板 2 μL，dNTPs(10 mmol /L)1 μL，Oligo(dT) (50
μmol /L)1 μL，DEPC-ddH2O 10 μL，65 ℃下5 min，
冰上放置 5 min，加入 5 × first-strand Buffer 4 μL，M-
MLV反转录酶(200 U /μL)1 μL，ＲNA酶抑制剂(40
U /μL)1 μL。反应条件:30 ℃，10 min;42 ℃，60
min;95 ℃，5 min。
1． 5 PNＲSV的 ＲT-PCＲ扩增
参照已报道［4，9］的 PNＲSV 外壳蛋白基因(CP)
检测引物对进行 ＲT-PCＲ 扩增，引物序列:上游为
5-ACGCGCAAAAGTGTCGAAATCTAAA-3，下游为
5-TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAA-AG-3，预期扩
增产物大小约为 450 bp。反应体系(20 μL) :cDNA
2． 0 μL，10 × PCＲ Buffer (2． 5 mmol /L MgCl2)2． 0
μL，dNTPs (2． 5 mmol /L)1． 0 μL，上、下游引物(10
μmol /L)各 1． 0 μL，Taq DNA 聚合酶(2． 5 U /μL)
0． 5 μL，ddH2O 12． 5 μL。PCＲ 扩增程序:94 ℃预变
性5 min;94 ℃变性 30 s，52 ℃复性 30 s，72 ℃延伸
30 s，25 个循环;72 ℃延伸 7 min。扩增结束后取
PCＲ产物经 15 g /L的琼脂糖凝胶电泳检测。
1． 6 LAMP检测方法的建立
1． 6． 1 LAMP引物的设计与合成
根据 GenBank 中公布的 PNＲSV 分离物的 CP
基因序列，并结合本研究中测定 PNＲSV 分离物的
CP基因保守序列［10］，利用 LAMP 在线引物设计软
件 Primer Explorer V4(http:/ /primerexplorer． jp /el-
amp4． 0． 0 / index． html)针对 PNＲSV分离物的 CP 基
因保守序列的 6 个区域设计了多组引物，然后根据
引物所在区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体
GC含量以及 Tm值等综合因素，选取出 1 套特异性
引物，包括 1 对外引物 F3、B3 和 1 对内引物 FIP、
BIP。引物由上海生工生物工程公司合成。
F3:5-AATCATACCCACGCTGGTG-3
B3:5-AATTCGGGGAGGCACATTC-3
FIP:5-TTCGCAGCCCTTTGTTGAGCCTT-TTTT-
GCAAGAAGTGCCATCCG-3
BIP:5-TAGGGTTTCGAGCGGTGTAGGA-
TTTTTCACGGTCCAAGTGGTCT-3
1． 6． 2 LAMP反应条件的优化
根据已报道的 LAMP 试验条件和预试验初步
建立了 PNＲSV LAMP 反应体系。进一步对扩增
温度、反应时间及对构建反应体系的主要影响因
素进行优化:扩增温度 60 ～ 65 ℃;反应时间 30，
45，60，75，90 min;外引物与内引物浓度比(1 ∶
1，1 ∶ 4，1 ∶ 8，1 ∶ 12，1 ∶ 16)、dNTPs(0 ． 5 ～ 3 ． 0
mmol /L，以 0 ． 5 mmol /L 依次递增)、MgSO4(2 ． 0
～ 12 ． 0 mmol /L，以 2 ． 0 mmol /L 依次递增)、Bst
DNA 聚合酶(1 ． 6 ～ 11 ． 2 U /μL，以 1 ． 6 U /μL 依
次递增)、Betaine(0 ～ 3． 0 mmol /L，以 0 ． 5 mmol /
823
第 4 期 韩 剑，等:李属坏死环斑病毒(PNＲSV)ＲT-LAMP检测方法的建立
L 依次递增)。每次反应均设置 ddH2O 阴性对
照，反应在水浴锅中进行。反应结束后取 5 μL
扩增产物，15 g /L 的琼脂糖凝胶电泳分析，同时
将 LAMP 扩增产物 10 000 r /min 离心 30 s，观察
白色沉淀产生情况，筛选出最优反应条件。
1． 6． 3 LAMP特异性试验
利用优化后的 PNＲSV LAMP反应体系，同时对
李属坏死环斑病毒(PNＲSV)、马铃薯 X 病毒
(PVX)、马铃薯 Y 病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒
(CMV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)阳性样品，及实验
室保存的健康巴旦木植株样品，进行 LAMP扩增，检
验 LAMP方法的特异性。反应结束后取 5 μL 扩增
产物，15 g /L的琼脂糖凝胶电泳分析，同时将 LAMP
扩增产物 10 000 r /min 离心 30 s，观察白色沉淀产
生情况。
1． 6． 4 LAMP灵敏度试验
将 cDNA用灭菌 ddH2O 进行 10 倍梯度稀释至
1 × 10 －5。采用优化后的 LAMP反应条件进行扩增，
同时也对稀释样品进行 ＲT-PCＲ 检测，比较两种方
法的灵敏度。反应结束后取 5 μL扩增产物，15 g /L
的琼脂糖凝胶电泳分析，观察结果。
1． 7 田间样品的适用性检测
采用植物总 ＲNA 提取试剂盒抽提从新疆喀什
地区巴旦木果园中采集到的 60 份疑似感染 PNＲSV
病毒的巴旦木植株总 ＲNA，同时利用本研究建立的
PNＲSV ＲT-LAMP检测技术和 PNＲSV 常规 ＲT-PCＲ
检测方法(方法同 1． 5)进行检测，比较两种检测方
法的阳性检出率和符合率。
2 结果与分析
2． 1 LAMP检测方法的建立
经优化确定 PNＲSV LAMP 检测方法最佳反应
体系为 25 μL:Bst DNA聚合酶(8 U /μL)1． 0 μL，1
× ThermoPol 反应缓冲液 2． 5 μL，dNTPs(10 mmol /
L)2． 0 μL，Betaine(0． 1 mmol /L)5． 0 μL，MgSO4
(100 mmol /L)1． 5 μL，内引物FIP /BIP(10 μmol /L)
各 4． 0 μL，外引物 F3 /B3 (10 μmol /L)各0． 5 μL，
cDNA模板 2． 0 μL，补 ddH2O 至 25 μL。对不同反
应温度和不同反应时间扩增结果比较，发现反应 30
min后电泳检测即能观察到明显的梯形条带，45 min
后反应体系开始出现微量焦磷酸镁沉淀，在 90 min
反应时间时沉淀量达到最大。扩增温度在 60 ～ 65
℃均有梯形条带产生，且在 65 ℃时扩增效率最高，
沉淀更为明显。因此确定最终的反应程序为:65 ℃
水浴反应 60 min，80 ℃反应 2 min终止反应。
反应结束后，取 5 μL 扩增产物于 15 g /L 的琼
脂糖凝胶上进行电泳检测，结果显示(图 1)PNＲSV
样品出现明显的梯形条带，而阴性对照未出现任何
条带。另外，肉眼观察反应管，阳性反应管中反应体
系较反应前混浊，而阴性对照管未见混浊，
10 000 r /min离心 30 s，可见阳性管底部有少量焦磷
酸镁白色沉淀，而阴性对照管未出现(图 1)。表明
本研究建立的 LAMP 检测方法能够有效地检测
PNＲSV。
M． 100 bp Ladder;1．空白对照;2 ～ 4．李属坏死环斑病毒;5．健康巴旦木植株
图 1 LAMP产物的琼脂糖凝胶电泳及可视化检测结果
Fig． 1 Ｒesults of LAMP product analyzed by agarose gel electrophoresis and visual detection
2． 2 LAMP检测方法的特异性
特异性检测结果显示，建立的 LAMP 检测方法
只能对 PNＲSV进行有效扩增，琼脂糖凝胶电泳呈特
征性梯形条带，而健康植株、CMV、PVX、PVY、BBWV
923
新 疆 农 业 大 学 学 报 2014 年
相应泳道无特异性条带出现(图 2) ，说明所设计的
引物特异性良好。同时，将所有反应管10 000 r /min
离心 30 s，仅 5 号管(PNＲSV)管底出现了白色沉淀
(图 2) ，说明沉淀的生成具有特异性。
M．100 bp Ladder;1．马铃薯 X病毒;2．马铃薯 Y病毒;3．黄瓜花叶病毒;4．蚕豆萎蔫病毒;5．李属坏死环斑病毒;6．健康巴旦木植株
图 2 ＲT-LAMP特异性的琼脂糖凝胶电泳及可视化检测结果
Fig． 2 Ｒesults of specificity of the ＲT-LAMP analyzed by agarose gel electrophoresis and visual detection
2． 3 LAMP检测方法的灵敏度
将 cDNA用灭菌 ddH2O 进行 10 倍梯度稀释至
1 × 10 －5，同时进行 LAMP 和 ＲT-PCＲ 检测。ＲT-
LAMP最小可检出 1 × 10 －3的 cDNA。ＲT-PCＲ 最小
仅能检出 1 × 10 －2的 cDNA(图 3)。由此可以看出，
本研究建立的 LAMP 检测方法的灵敏度比 ＲT-PCＲ
高 10 倍。可视化检测也有同样结果(图 4)。
M． 100 bp Ladder;1 ～ 5．分别为 1 × 10 －1，1 × 10 －2，1 × 10 －3，1 × 10 －4，1 × 10 －5共 5 个 cDNA稀释浓度;6．空白对照
图 3 ＲT-LAMP和 ＲT-PCＲ检测 PNＲSV灵敏度对比试验
Fig． 3 Comparison of sensitivity of ＲT-LAMP and ＲT-PCＲ for the detection of PNＲSV
1 ～ 5．分别为 1 × 10 －1，1 × 10 －2，1 × 10 －3，1 × 10 －4，1 × 10 －5
共 5 个 cDNA稀释浓度;6．空白对照
图 4 ＲT-LAMP灵敏度对比可视化结果
Fig． 4 The sensitivity of the ＲT-LAMP analyzed by visual
detection of PNＲSV
2． 4 田间样品的适用性检测
抽提 60 份疑似感染 PNＲSV病毒的巴旦木植株
总 ＲNA后，平行进行 ＲT-LAMP和 ＲT-PCＲ检测，结
果 ＲT-LAMP和 ＲT-PCＲ均检测出 8 个阳性样品，阳
性检出率为 13． 3%，两种方法的结果符合率为
100%，说明本研究建立的 ＲT-LAMP 检测方法与常
用的 ＲT-PCＲ 检测方法具有极高的一致性，建立的
ＲT-LAMP方法适用于 PNＲSV的检测。
3 讨 论
本研究针对 PNＲSV 分离物的 CP 基因保守
序列的 6 个区域设计并筛选出了 1 套特异性
033
第 4 期 韩 剑，等:李属坏死环斑病毒(PNＲSV)ＲT-LAMP检测方法的建立
LAMP 引物，通过对反应程序和反应体系的优化，
成功建立了 PNＲSV ＲT-LAMP 检测方法，特异性
检测结果表明，本研究建立的 ＲT-LAMP 检测方
法对 PNＲSV 的检测结果为阳性，而对常见的马
铃薯 X 病毒等 4 株其他病毒及健康植株的检测
结果均为阴性，表明本研究建立的方法特异性良
好。将本方法与传统的 ＲT-PCＲ 方法进行比较，
对 60 份疑似感染 PNＲSV 病毒的巴旦木植株样
品进行检测时，两种方法的结果符合率为 100%，
说明本方法适用于 PNＲSV 的检测。
LAMP检测方法是一种高灵敏度的检测方法，
其灵敏度甚至达到或高于荧光定量 PCＲ 的检测水
平［11］。本研究建立的 PNＲSV ＲT-LAMP 检测方法
的灵敏度是 ＲT-PCＲ检测方法灵敏度的 10 倍，这与
He等［12］在利用 ＲT-LAMP 技术检测人肠病毒(En-
tero virus，EV)和杜鹃等［13］利用 ＲT-LAMP检测流行
性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)的
研究结果相同。另外王永江等［14］在利用 ＲT-
LAMP 检测柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，
CTV)时，ＲT-LAMP 的灵敏度是 ＲT-PCＲ 的 100
倍;Ju［15］利用 ＲT-LAMP 技术检测马铃薯卷叶病
毒(Potato leafroll virus，PLＲV)时灵敏度是 ＲT-
PCＲ 技术的 2000 倍。ＲT-LAMP 技术的灵敏度
在不同试验中差别较大，可能是由于扩增效率造
成。扩增效率主要与所用引物的质量和特性有
关，如引物的长度、GC 含量、退火温度等因素都
会影响到引物的结合率和反应的扩增效率。因
此在今后的研究中，我们将继续设计和筛选出更
为高效的 LAMP 扩增引物，以期进一步提高李属
坏死环斑病毒 ＲT-LAMP 检测方法的灵敏度。
对于 LAMP反应结果的判定，除可通过琼脂糖
凝胶电泳检测外，还可通过肉眼直接观察焦磷酸镁
白色沉淀产生现象［16，17］或在反应液中加入核酸染
料［18，19］，通过观察反应液颜色的变化进行判断，从
而实现反应及产物检测一步完成。染料法相对更加
灵敏，利于辨别，但核酸染料不易保存，成本较高，将
会制约其在基层的推广。本研究为了降低成本，选
择肉眼观察焦磷酸镁白色沉淀的产生作为结果的判
定方法，并进行电泳验证。特异性及灵敏度实验结
果表明，LAMP电泳检测结果与焦磷酸镁白色沉淀
产生现象完全一致，说明通过肉眼观察白色沉淀产
生现象作为 ＲT-LAMP结果的判定方法是可信的。
李属坏死环斑病毒株系繁多，主要表现在致病
力差异上。Hammond［20］通过对 PNＲSV 分离物 CP
基因的序列分析，将 PNＲSV株系划分为 3 个不同的
组群，即 GroupⅠ、GroupⅡ和 GroupⅢ;GroupⅠ中的
株系大多表现明显症状，GroupⅡ中的株系大多表现
温和症状，GroupⅢ两种症状类型都包括。已有研究
表明［21］PNＲSV不同的组群的 CP 基因具有组群特
异性序列，GroupⅠ组分离物 CP基因的 124 ～ 129 nt
位置存在 6 个核苷酸序列 ATAGGA，而 GroupⅡ和
GroupⅢ组群分离物不存在此序列;GroupⅢ组分离
物的 360 ～ 362 nt 位置的核苷酸序列为 CAA，且第
360 位的 C 特异存在于 GroupⅢ组分离物中。目前
已报道的 PNＲSV分子生物学检测方法，主要是针对
PNＲSV的 CP基因高度保守区设计引物或探针，基
于 PCＲ技术来完成对 PNＲSV 的检测，这些方法仅
能对 PNＲSV进行通用检测，而对 PNＲSV 不同致病
性组群分离物却无法区分和鉴定。而 LAMP检测方
法相对 PCＲ技术具有更高的特异性，由 LAMP的原
理可知，LAMP反应中 4 条特异性引物对靶序列上 6
个特定区域的严格地识别，理论上能从仅相差 1 个
核苷酸的基因标本中找出相应靶序列进行扩增。因
此，能否针对 PNＲSV CP基因组群特异性序列，根据
LAMP引物设计原理，设计出能够鉴别不同组群的
特异性 LAMP 引物，建立能够快速检测和区分
PNＲSV不同组群分离物的 LAMP 检测方法，在今后
的研究中还有待进一步探究。
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