全 文 ：园艺学报，2015，42 (3)：576–584.
Acta Horticulturae Sinica
576 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0699；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2014–11–24；修回日期：2015–02–09
基金项目：国家自然科学基金项目（31240028，31470696）
* E-mail：xiaomei7280@126. com
芍药种子 cDNA-AFLP 体系的建立
孙晓梅 1,*，杨盼盼 1，陆秀君 1，周文强 2，王 丹 2，杨宏光 1
（1 沈阳农业大学林学院，沈阳 110866；2 沈阳市植物园，沈阳 110163）
摘 要：以芍药品种‘粉玉奴’与‘粉中楼’的杂交种子为试材，通过对影响 cDNA-AFLP 反应的重
要因素进行优化，建立了适合于芍药种子的 cDNA-AFLP 分析体系，并对打破上胚轴与下胚轴休眠前后的
种子基因表达差异进行了初步分析。结果表明：使用 RNAprep Pure 植物总 RNA 提取试剂盒提取的 RNA
较完整；cDNA 利用 EcoRⅠ和 MseⅠ进行双酶切 37 ℃ 4 h，65 ℃ 20 min，酶切充分；连接产物稀释 10
倍用于预扩增；预扩增产物稀释 10 倍，取 5 μL 作为选择性扩增的模板，得到了较为清晰可辨的
cDNA-AFLP 谱带；打破下胚轴休眠前后约有 3 700 条差异条带，打破上胚轴休眠前后约有 1 600 条差异
条带。
关键词：芍药；种子；休眠；cDNA-AFLP
中图分类号：S 682.1+2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0576-09

Establishment of cDNA-AFLP System of Paeonia lactiflora Seed
SUN Xiao-mei1,*，YANG Pan-pan1，LU Xiu-jun1，ZHOU Wen-qiang2，WANG Dan2，and YANG
Hong-guang1
（1College of Forestry，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；2Shenyang Botanical Garden，
Shenyang 110163，China）
Abstract：The research established a cDNA-AFLP analysis system which suited Paeonia lactiflora
seed by using hybrid seeds of P.‘Fenyunu’and P.‘Fenzhonglou’as materials and optimizing the important
factors which affect the reaction of cDNA-AFLP. In addition，we made a preliminary analysis on the
expression difference of gene under the conditions of before and after breaking epicotyl and hypocotyl
dormancy. The results indicated that total RNA was isolated from Paeonia lactiflora seeds using the
RNAprep Pure Plant Kit according to the manufacturer’s instruction. Doubled-stranded cDNA was
digested completely with EcoRⅠand MseⅠat 37 ℃ for 4 h and at 65 ℃ for 20 min. The ligated
products should be diluted 10 times with sterilized distilled water for the pre-amplification. Then relatively
clear and differentiable bands were obtained after the pre-amplified products were diluted 10 times，and 5
μL were taken as a template for selective amplification. About 3 700 differential bands were visualized
between before and after breaking hypocotyl dormancy and about 1 600 differential bands were visualized
between before and after breaking epicotyl dormancy.
Key words：Paeonia lactiflora；seed；dormancy；cDNA-AFLP

孙晓梅，杨盼盼，陆秀君，周文强，王 丹，杨宏光.
芍药种子 cDNA-AFLP 体系的建立.
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基于 cDNA 的扩增片段长度多态性指纹图谱（ cDNA-based amplified fragment length
polymorphism fingerprinting，cDNA-AFLP）是 Bachem 等（1996）在 AFLP 技术的基础上发明的一
种用于研究基因表达差异的 RNA 指纹分析技术。该技术无需预先知道序列信息，具有假阳性低、
重复性好、可靠性高、所需设备简单、检测基因多、模板用量少以及能够检测较低浓度的 mRNA 表
达等优点（Money et al.，1996），是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一，在文心兰（龚茂江 等，
2011）、菊花（Huang et al.，2012）、海棠（李志红 等，2008）等观赏植物的差异研究中得到了广泛
应用。但以种子为材料的 cDNA-AFLP 研究相对较少（李驰 等，2007；Lang et al.，2014），而关于
种子休眠与萌发分子机制的研究也鲜有报道（de Diego et al.，2006）。
芍药（Paeonia lactiflora）的种子具有双重休眠的特性，主要表现为秋季降温时打破下胚轴休眠，
长出胚根；冬季低温打破上胚轴休眠，来年春季升温后胚芽萌发出土（李嘉珏，1999）。自然条件下
芍药种子从播种到出苗需要 6 ~ 7 个月的时间，生长周期长，给人工栽培生产和种子检验带来很大
的困难。探讨这种特殊的双重休眠机理，对于缩短芍药育种周期，提高育种效率及解决促成栽培难
题具有重要意义。
本试验中通过优化反应体系及反应条件，建立了适合于芍药种子的 cDNA-AFLP 反应体系，为
分析芍药种子打破上、下胚轴休眠前后基因的差异表达提供技术支持，以期为进一步分离、定位、
克隆芍药种子休眠基因，揭示芍药种子休眠与萌发的分子机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
芍药（Paeonia lactiflora）种子于 2012 年 8 月下旬收获自沈阳农业大学植物园，其母本为芍药
品种‘粉玉奴’，父本为芍药品种‘粉中楼’。以未经处理的休眠种子（A），经 15 ℃沙藏层积后露
白的种子（B）和根长达到 3 ~ 4 cm 的种子（C），以及根长达 3 ~ 4 cm 后又经 4 ℃层积 28 d 的种子
（D）为试材。取 A 和 B 进行打破下胚轴休眠前后基因表达差异分析，取 C 和 D 进行打破上胚轴休
眠前后差异分析。选取的芍药种子在超净工作台上去除种皮，切成薄片，用锡纸包裹后迅速投入液
氮中速冻，于–80 ℃冰箱中保存备用。
RNAprep Pure 植物总 RNA 提取试剂盒（目录号：DP432）、T4 DNA Ligase 和 Taq DNA Polymerase
购自北京 TIANGEN 公司；cDNA 双链合成试剂盒（M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit）购自大连宝
生物工程有限公司；EcoRⅠ和 MseⅠ购自 Fermentes；其余试剂均为国产分析纯。
试验中所需接头和引物（表 1）由北京赛百盛基因技术有限公司合成，其中 AP 代表接头，E00
和 M00 为预扩增的引物；E-NN 和 M-NN（NN 表示两个任意碱基）为选择性扩增的引物。

表 1 cDNA-AFLP 接头和引物序列
Table 1 The sequences of cDNA-AFLP adapters and primers
名称
Name
EcoRⅠ接头及引物序列
The sequences of EcoRⅠadapters and primers
名称
Name
MseⅠ接头及引物序列
The sequences of MseⅠadapters and primers
AP1 5′-CTCGTAGACTGCGATCC-3′ AP1 5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′
AP2 3′-CATCTGACGCATGGTTAA-5′ AP2 3′-TACTCAGGACTCAT-5′
E00 5′-GACTGCGTACCAATTC-3′ M00 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′
E-NN 5′-GACTGCGTACCAATTCNN-3′ M-NN 5′-GATGAGTCCTGAGTAANN-3′

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1.2 方法
1.2.1 芍药种子总 RNA的提取
按照北京 TIANGEN 公司的 RNAprep pure Plant Kit 说明书对芍药去皮种子进行总 RNA 的提取。
其中对前两步进行了改良，即：取 2 个 1.5 mL 的 RNase-free 离心管，向每管中加入 450 μL RL 裂解
液和 5 μL β–巯基乙醇。将芍药的去皮种子在液氮中迅速研磨成粉末，分装到 2 个管中，每管加
50 mg 左右，在涡旋混合器上剧烈震荡混匀。将两个管中的混合物转移至一个过滤柱中，4 ℃条件
下 12 000 r · min-1 离心 5 min，小心吸取收集管中的上清液至一新的 RNase-Free 离心管中，之后按照
操作说明进行。提取得到的 RNA 溶液取 1 μL 在 ES-2 型微量紫外可见吸光 · 荧光光度计上检测其纯
度和浓度，取 5 μL 在 1.2%的琼脂糖凝胶上检测其完整性。
1.2.2 双链 cDNA的合成
参照大连宝生物工程有限公司的 M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 说明书以 2 μg 的模板 RNA
为材料进行双链 cDNA 的合成。取 3 μL 经 1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，1 μL 进行浓度检测，剩
余的 cDNA 溶液于–20 ℃保存。
1.2.3 cDNA的双酶切体系
采用 EcoRⅠ和 MseⅠ酶切组合对合成的双链 cDNA 进行双酶切，通过对酶切模板、酶的用量及
酶切时间进行优化，最终确定的酶切体系为：双链 cDNA 350 ng，10 × Tango buffer（with BSA）2 µL，
EcoRⅠ（10 U · μL-1）0.5 µL，MseⅠ（10 U · μL-1）0.5 µL，ddH2O 补足至 20 µL。短暂离心混匀后
在 PCR 仪中进行如下反应：37 ℃酶切 4 h，65 ℃酶切 20 min，立即置于冰上冷却 2 min，之后进行
连接反应。
1.2.4 连接体系
5 pmol · L-1 EcoRⅠ接头的制备：取已稀释至 100 μmol · L-1 的 EcoRⅠ接头的上链和下链各 1.5
μL，加入 ddH2O 稀释至 30 μL，混匀后在 PCR 仪上：94 ℃ 3 min；65 ℃ 10 min；37 ℃ 10 min；25 ℃
10 min。–20 ℃保存备用。
50 pmol · L-1 MseⅠ接头的制备：取已稀释至 100 μmol · L-1 的 MseⅠ接头的上链和下链各 15 μL，
混匀后在 PCR 仪上：94 ℃ 3 min；65 ℃ 10 min；37 ℃ 10 min；25 ℃ 10 min。–20 ℃保存备
用。
连接反应：向 1.5 mL 离心管中加入酶切产物 20 μL，EcoRⅠ接头（5 pmol · L-1）1 μL，MseⅠ
接头（50 pmol · L-1）1 μL，10 × T4 DNA Ligation buffer 3 μL，T4 DNA Ligase（3 U · μL-1）1 μL，ddH2O
补足至 30 µL。混匀后放于金属浴中，16 ℃连接过夜，70 ℃水浴 10 min。–20 ℃保存备用。
1.2.5 预扩增体系的优化
以芍药休眠种子的连接产物为模板，以 E00 和 M00 为预扩增引物，对连接产物的稀释倍数进行
了优化，分别以连接产物未稀释，稀释 5 倍、10 倍、15 倍和 20 倍作为模板进行预扩增，预扩增反
应体系为：稀释 10 倍的酶切连接产物 5 μL，10 × Taq buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol · L-1）0.5 μL，
E00 1 μL，M00 1 μL，Taq DNA Polymerase（2.5 U · μL-1）0.5 μL，ddH2O 14.5 µL。按以下 PCR 反应
程序进行扩增：94 3 min℃ ；94 30 s℃ ，50 30 s℃ ，72 1 min℃ ，30 个循环；72 5 min℃ 。取 5 μL
预扩增产物，用 1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余产物保存于–20 ℃冰箱中备用。
1.2.6 选择性扩增体系优化
选择性扩增所用的引物组合为 E-NN 和 M-NN，反应体系为：稀释 10 倍的预扩增产物 5 μL，10 ×
Taq buffer 2 μL，dNTPs（10 mmol · L-1）0.4 μL，E-NN 0.8 μL，M-NN 0.8 μL，Taq DNA Polymerase
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图 1 总 RNA 电泳图
A：休眠种子；B：露白种子；C：根长达 3 ~ 4 cm 的种子；
D：根长达 3 ~ 4 cm 后 4 ℃层积 28 d 的种子。
Fig. 1 Electrophoresis result of total RNA
A：Dornancy seed；B：Dehiscent seed; C:Seed with 3–4 cm root
length；D：Seed with stratification for 28 d at 4 ℃
after root length reaching to 3–4 cm.
（2.5 U · μL-1）0.4 μL，ddH2O 10.6 µL。为了确保试验的可重复性和准确性，将预扩增产物进行不
同倍数的稀释（10 倍、20 倍、30 倍、40 倍、50 倍、100 倍、150 倍和 200 倍），且设置 2 次重复。
在 PCR 中进行选择性扩增，反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（–0.7 ℃/cycle），72 ℃
1 min，13 个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，24 个循环；72 ℃ 7 min。
1.2.7 选择性扩增产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
向 20 μL 选择性扩增产物中加 6 μL 溴酚蓝，混合均匀后置于 PCR 仪上 95 ℃变性 5 min，然后
立即置于冰上。取变性的产物 3 μL 上样于点样孔。设置电压为 2 000 V，电流为 100 mA 进行电泳。
电泳至二甲苯氰距胶下缘 2/5 处停止，银染显色。在灯箱上对检测结果进行观察，分别读取芍药种
子休眠和露白间的差异条带及根长 3 ~ 4 cm 和根长 3 ~ 4 cm 后 4 ℃层积 28 d 的差异条带。
2 结果与分析
2.1 芍药种子总 RNA 的提取
从未经处理的休眠种子、露白的种子、根
长达 3 ~ 4 cm 的种子和根长达 3 ~ 4 cm 后 4 ℃
层积 28 d 的种子中提取总 RNA，经 1.2%的琼
脂糖凝胶电泳检测显示，总 RNA 的 28S rRNA
和 18S rRNA 两条带完整且清晰，28S rRNA 的
亮度基本是 18S rRNA 的两倍（图 1），表明提
取的 RNA 完整性较好。
经 ES-2 型微量紫外可见吸光 · 荧光光度
计检测，OD260/OD280 的值在 1.8 ~ 2.1 之间，
OD260/OD230 的值大于 2，RNA 的浓度在 200 ~
400 ng · μL-1 之间（表 2），说明提取获得的总
RNA 样品纯度高，无 DNA、蛋白质、多糖等
杂质的污染，符合合成双链 cDNA 的模板要求，
能满足 cDNA-AFLP 试验的需要。

表 2 总 RNA 的紫外检测
Table 2 UV detection of total RNA
材料代号
Material symbol
阶段
Stage
OD260 OD260/OD230 OD260/OD280
RNA/
（ng · μL-1）
A 休眠种子 Dormancy seed 5.864 2.022 1.980 234.56
B 露白种子 Dehiscent seed 5.651 2.146 2.076 226.04
C 根长 3 ~ 4 cm 的种子 Seed with 3–4 cm root length 8.798 2.266 1.816 351.92
D 根长达 3 ~ 4 cm 后 4 ℃层积 28 d 的种子
Seed with stratification for 28 d at 4 ℃ after root length
reaching to 3–4 cm
9.831 2.208 1.972 393.24

2.2 双链 cDNA 的合成
合成的双链 cDNA 大小在 300 ~ 2 000 bp 之间，呈弥散状（图 2），说明其质量较好。经 ES-2
型微量紫外可见吸光 · 荧光光度计对 cDNA 浓度检测，均大于 20 ng · μL-1，符合后续酶切试验要求。
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图 3 连接产物稀释不同倍数预扩增的电泳结果
Fig. 3 The pre-amplified result with template diluted differently
from ligation products
M：DL2 000 marker.
图 4 预扩增产物的电泳图
M：DL2 000 marker；A：休眠种子；B：露白种子；C：根长达
3 ~ 4 cm 的种子；D：根长达 3 ~ 4 cm 后 4 ℃层积 28 d 的种子。
Fig. 4 Electrophoresis result of pre-amplification products
M：DL2000 marker；A：Dormancy seed；B：Dehiscent seed；C：
Seed with 3–4 cm root length；D：Seed with stratification for 28 d at
4 ℃ after root length reaching to 3–4 cm.

图 2 双链 cDNA 电泳图
M：DL2 000 marker；A：休眠种子；B：露白种子；C：根长达 3 ~ 4 cm 的种子；D：根长达 3 ~ 4 cm 后 4 ℃层积 28 d 的种子。
Fig. 2 Electrophoresis result of dscDNA
M：DL2 000 marker；A：Dornancy seed；B：Dehiscent seed；C：Seed with 3–4 cm root length；
D：Seed with stratification for 28 d at 4 ℃ after root length reaching to 3–4 cm.
2.3 预扩增体系的优化
2.3.1 连接产物稀释倍数对预扩增的影响
预扩增反应在 cDNA-AFLP 体系中起承上
启下的作用，既可以反映酶切和连接的效果，
又为选择性扩增提供模板，影响选择性扩增的
结果。不同稀释倍数的连接产物扩增后经 1.0%
的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示所有预扩增
均可获得 100 ~ 1 000 bp 的弥散条带（图 3），
可见酶切反应充分且接头连接效果好，可用于
cDNA-AFLP 试验分析。
其中以连接产物稀释 10 倍的预扩增产物
的信号最强，所以试验选择以稀释 10 倍的连接
产物进行预扩增反应。
2.3.2 预扩增产物的电泳检测
分别将休眠种子、露白种子、根长达 3 ~ 4
cm 的种子和根长达 3 ~ 4 cm 后 4 ℃层积 28 d
的种子的酶切连接产物稀释 10 倍进行预扩增。
经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，条带呈弥散
状，主要分布在 100 ~ 1 000 bp 之间，扩增信
号较强，而且可以看到某些清晰的条带（图 4），
证明预扩增反应成功，得到的预扩增产物可用
于下一步的选择性扩增。
2.4 预扩增产物的稀释倍数对选择性扩增的
影响
以预扩增产物为模板进行选择性扩增时，
预扩增产物的稀释倍数影响较大。为得到清晰
稳定的条带，试验中将稀释 10 ~ 200 倍的预扩
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增产物作为模板进行选择性扩增。以预扩增产物原液和不同稀释倍数的预扩增产物为模板扩增后的
产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：与预扩增相比，选择性扩增产物泳道中的条带更加
清晰（图 5）。其中以预扩增产物原液为模板进行选择性扩增，扩增条带最为弥散，而以稀释 10 倍
的预扩增产物为模板得到的扩增结果多态性最好，且条带清晰。


图 5 预扩增产物稀释不同倍数的扩增结果
Fig. 5 The selective amplification result with template diluted differently from pre-amplification products
M：DL2000 marker.

2.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
运用 256 对引物（E-NN 和 M-NN）对 4 个阶段的芍药种子的 cDNA 进行选择性扩增，每个泳
道可呈现出 20 ~ 40 条谱带，条带清晰，可读出的条带较多且适合进行回收，说明以上建立的
cDNA-AFLP 体系适合于芍药去皮种子进行差异分析。
在灯箱上观察比较休眠和露白两个泳道，检测到差异条带有 3 700 多条；对根长 3 ~ 4 cm 和根
长 3 ~ 4 cm 后 4 ℃层积 28 d 两时期进行多态性差异分析，检测到差异条带数约有 1 600 条。部分引
物选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图 6。


图 6 部分选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶图谱
A：休眠种子；B：露白种子；C：根长达 3 ~ 4 cm 的种子；D：根长达 3 ~ 4 cm 后 4 ℃层积 28 d 的种子。
Fig. 6 Polyacrylamide gel mapping of several selective amplification products
A：Dormancy seed；B：Dehiscent seed；C：Seed with 3–4 cm root length；D：Seed with stratification for 28 d at
4 ℃ after root length reaching to 3–4 cm.
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3 讨论
3.1 内切酶的选择和引物的筛选
内切酶的选择是 cDNA-AFLP 分析的关键技术之一。为了使酶切后的片段大小均匀，酶切时一
般采用两种限制性内切酶进行双酶切，一种是密切酶（识别位点为 4 个碱基），另一种是稀切酶（识
别位点为 6 个碱基）。在对不同的物种进行 cDNA-AFLP 分析时，所选用的限制性内切酶组合也不尽
相同。目前 AFLP 实验中常用的双酶切组合有 EcoRⅠ/MseⅠ、TaqⅠ/AseⅠ和 BstYⅠ/MseⅠ，而在
对植物进行分析时多选用 EcoRⅠ/MseⅠ组合（于虹和丁国华，2007）。cDNA-AFLP 在芍药上的应
用未见报道，无从参考，但芍药的 AFLP 多态性分析研究较多，而在芍药进行 AFLP 分析时多采用
EcoRⅠ/MseⅠ组合对 DNA 进行酶切（朱红霞，2004；刘萍 等，2006；胡文清 等，2011），因此本
试验在建立芍药种子的 cDNA-AFLP体系时选择EcoRⅠ/MseⅠ酶切组合对芍药种子的双链 cDNA进
行双酶切。
引物是 cDNA-AFLP 体系中 PCR 进行特异性反应的关键，其 3′末端所加的选择性碱基数很大程
度上决定了扩增的效果（王锋，2005）。目前在 cDNA-AFLP 差异分析中用于选择性扩增的引物 3′
末端大多连接 2 个选择性碱基（Zhang et al.，2012；Li et al.，2013），但也有连接 3 个选择性碱基的。
袁伟等（2013）在研究番茄抗黄化曲叶病毒病相关基因的差异表达时，所选的选择扩增引物的 3′端
为 3 个核苷酸，因此用 64 对引物进行选择性扩增，分析了抗 TYLCV 的番茄材料在不同时段中基因
的差异表达。连接 3 个选择性碱基一般用于 AFLP 对 DNA 的分析，cDNA 相对简单，选择性扩增引
物 3′末端连接 2 个选择性碱基即可（韩斌和彭建营，2006；李文杨和黄贵修，2009）。Hartings（1999）
用 BstYⅠ和 MseⅠ分析玉米不同 mRNA 之间的差异表达，BstYⅠ引物的选择性碱基改用简并引物，
用 64 对引物组合对 75%的 mRNA 进行了分析，用 128 对引物组合进行分析可覆盖 95%以上的
mRNA。本试验中选择在 2 条引物的 3′末端分别加上 2 个选择性碱基 E + NN/M + NN 的引物组合，
运用 256 对引物组合对芍药种子的 4 个阶段进行了选择性扩增，提供的信息量大，能够比较全面地
获取转录组的信息。
3.2 PCR 扩增
cDNA-AFLP 体系中的扩增反应由预扩增和选择性扩增两部分构成。预扩增为选择性扩增提供
大量的模板，决定选择性扩增的成败。连接产物和预扩增产物的稀释倍数直接影响两次扩增效率。
稀释倍数太大，扩增条带减弱；稀释倍数太小，扩增结果不稳定（郭莹 等，2010）。不同的反应体
系对连接产物和预扩增产物的稀释倍数不同，一般将连接产物稀释 0 ~ 20 倍用作预扩增反应的模板，
而预扩增模板的稀释倍数跨度较大，为 10 ~ 200 倍。李霞等（2010）在优化杉木茎段 cDNA-AFLP
反应体系时将连接产物稀释 2 倍，预扩增产物稀释 20 倍，琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳得到的扩增
条带清晰，多态性好。吴智明等（2010）在优化辣椒 cDNA-AFLP 体系时发现酶切连接产物稀释 15
倍进行预扩增可获得 100 ~ 1 000 bp 的弥散条带，效果较好。王忠等（2012）在以野生茄子的根为
试材构建其 cDNA-AFLP 体系时选用未稀释的连接产物进行预扩增，琼脂糖凝胶检测呈现明亮的连
续一片，而经稀释的相比之下亮度减弱、弥散的范围减小。将预扩增产物稀释不同的倍数发现，高
浓度模板的扩增产物会出现拖尾现象，稀释 50 倍为模板的选择性扩增效果较好。谭全伟（2010）在
建立荔枝胚胎的 cDNA-AFLP 体系时连接产物未稀释，预扩增产物稀释 200 倍。本试验中将连接产
物和预扩增产物都进行了 10 倍的稀释，经琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到了清晰
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的条带且多态性较好，说明该体系适合于芍药种子的 cDNA-AFLP 分析。

References
Bachem C W B，van der Hoeven R S，de Bruijn S M，Vreugdenhil D，Zabeau M，Visser R G F. 1996. Visualization of differential gene expression
using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP：Analysis of gene expression during potato tuber development. The Plant Journal，
9 (5)：745–753.
de Diego J G，Rodrguez F D，Lorenzo J L R，Grappin P，Cervantes E. 2006. cDNA-AFLP analysis of seed germination in Arabidopsis thaliana
identifies transposons and new genomic sequences. Journal of Plant Physiology，163：452–462.
Gong Mao-jiang，Tian Min，Wang Cai-xia. 2011. Establishment of A cDNA-AFLP system in Oncidium orchid and TDFs analysis. Journal of Nuclear
Agricultural Scienc，25 (6)：1142–1147. (in Chinese)
龚茂江，田 敏，王彩霞. 2011. 文心兰 cDNA-AFLP 体系的建立及 TDFs 分析. 核农学报，25 (6)：1142–1147.
Guo Ying，Yang Xiao-yun，Zhang Qing-xia，Si Chao-guang，Zhang Shu-xia，Wang Yuan. 2010. Optimization of cDNA-AFLP analysis system for
Chinese cabbage. Molecular Plant Breeding，8 (5)：1003–1007. (in Chinese)
郭 莹，杨晓云，张清霞，司朝光，张淑霞，王 媛. 2010. 大白菜 cDNA-AFLP 分析体系的优化. 分子植物育种，8 (5)：1003–
1007.
Han Bin，Peng Jian-ying. 2006. cDNA-AFLP and its application in research about gene expressions of plants. Acta Botanica Boreall-occidentalla
Sinica，26 (8)：1753–1758. (in Chinese)
韩 斌，彭建营. 2006. cDNA-AFLP 技术及其在植物基因表达研究中的应用. 西北植物学报，26 (8)：1753–1758.
Hartings H. 1999. High resolution fingerprinting of transcribed genes by means of a modified cDNA-AFLP method. Maydica，(44)：179–181.
Hu Wen-qing，Lu Heng，Liu Wei，Yuan Jun-xia. 2011. Paternity identification and genetic structure analysis on the wild population in Paeonia
lactiflora Pallas（Paeoniaceae）. ActaHorticulturae Sinica，38 (3)：503–511. (in Chinese)
胡文清，鲁 衡，刘 伟，袁俊霞，张大明. 2011. 芍药野生居群父系分析与遗传结构研究. 园艺学报，38 (3)：503–511.
Huang He，Niu Ya-jing，Cao Hua-wen，Tang Xing-jiao，Xia Xin-li，Yin Wei-lun，Dai Si-lan. 2012. cDNA-AFLP analysis of salt-inducible genes
expression in Chrysanthemum lavandulifolium under salt treatment. Journal of Plant Physiology，169 (4)：410–420.
Lang Si-rui，Liu Xiao-xia，Ma Gang，Lan Qin-ying，Wang Xiao-feng. 2014. Identification of desiccation tolerance transcripts potentially involved
in rape（Brassica napus L.）seeds development and germination. Plant Physiology and Biochemistry，83：316–326.
Li Chi，Lu Xin-xiong，Chen Xiao-ling，Zhang Zhi-e，Lin Feng. 2007. Differential expression analysis of aging cotton seed（Gossypium hirsutum）
by cDNA- AFLP. Cotton Science，19 (4)：255–260. (in Chinese)
李 驰，卢新雄，陈晓玲，张志娥，林 凤. 2007. 利用 cDNA-AFLP 技术分析老化棉花种子基因差异表达. 棉花学报，19 (4)：255–
260.
Li Jia-jue. 1999. Chinese tree peony and Paeonia lactiflora. Beijing：Chinese Forestry Publishing House. (in Chinese)
李嘉珏. 1999. 中国牡丹与芍药. 北京：中国林业出版社.
Li Wen-yang，Huang Gui-xiu. 2009. cDNA-AFLP and its application in the interaction between plant and pathogen. Tropical Agricultural
Engineering，33 (6)：5–10. (in Chinese)
李文杨，黄贵修. 2009. cDNA-AFLP 技术及其在植物与病原菌互作方面的应用. 热带农业工程，33 (6)：5–10.
Li Xia，Su Qian，Shi Ji-sen. 2010. Optimization of cDNA-AFLP technical system for young stem tissue of Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.
Molecular Plant Breeding，8 (2)：410–416. (in Chinese)
李 霞，苏 倩，施季森. 2010. 杉木茎段 cDNA-AFLP 反应体系的优化. 分子植物育种，8 (2)：410–416.
Li Yan，Chen Wang，Ma Dong-fang，WuYun-feng. 2013. cDNA-AFLP analysis revealed genes potentially implicated in Catharanthus roseus flowers
during wheat blue dwarf phytoplasma infection. Physiological and Molecular Plant Pathology，84：1–9.
Li Zhi-hong，Tang Mei-ling，Liu Jia，Wang Yi，Li Tian-zhong，Han Zhen-hai，Xu Xue-feng，Kong Jin. 2008. Establishment of cDNA-AFLP system
of Malus zumi Mats. Journal of Nuclear Agricultural Science，22 (5)：607–610. (in Chinese)
李志红，唐美玲，刘 佳，王 忆，李天忠，韩振海，许雪峰，孔 瑾. 2008. 珠眉海棠 cDNA-AFLP 分析体系的建立. 核农学报，22 (5)：
Sun Xiao-mei，Yang Pan-pan，Lu Xiu-jun，Zhou Wen-qiang，Wang Dan，Yang Hong-guang.
Establishment of cDNA-AFLP system of Paeonia lactiflora seed.
584 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：576–584.
607–610.
Liu Ping，Wang Zi-cheng，Shang Fu-de. 2006. AFLP analysis of genetic diversity of Paeonia suffruticosa cultivars in Henan Province.
ActaHorticulturae Sinica，33 (6)：1369–1372. (in Chinese)
刘 萍，王子成，尚富德. 2006. 河南部分牡丹品种遗传多样性的 AFLP 分析. 园艺学报，33 (6)：1369–1372.
Money T，Reader S，Qu L J，Dunford R P，Moore G. 1996. AFLP-based mRNA fingerprinting. Nucleic Acids Research，24 (13)：2616–
2617.
Tan Quan-Wei. 2010. Seperation and analisis on litchi embryo development-related genes by cDNA-AFLP[M. D. Dissertation]. Fuzhou：Fujian
Agriculture and Forestry University. (in Chinese)
谭全伟. 2010. cDNA-AFLP 技术分离和分析荔枝胚胎发育相关基因[硕士论文]. 福州：福建农林大学.
Wang Feng. 2005. The cDNA-AFLP Technique and its application in studying differential gene expression of plants. Bulletin of Biology，40 (7)：
59–60. (in Chinese)
王 锋. 2005. cDNA-AFLP 技术原理及其在研究植物基因差异表达中的应用. 生物学通报，40 (7)：59–60.
Wang Zhong，Yang Qing，Wang Ren，Zheng Yu-hong. 2012. Optimization and establishment of cDNA-AFLP technical system in Solanum melongena.
Northern Horticulture，(19)：108–112. (in Chinese)
王 忠，杨 清，汪 仁，郑玉红. 2012. 野生茄子 cDNA-AFLP 分析体系的优化和建立. 北方园艺，(19)：108–112.
Wu Zhi-ming，Zeng Jing，Hu Kai-lin，Qiao Ai-min. 2010. Optimization and application of cDNA-AFLP analysis system for Capsicum annuum.
Chinese Agricultural Science Bulletin，26 (12)：26–29. (in Chinese)
吴智明，曾 晶，胡开林，乔爱民. 2010. 辣椒 cDNA-AFLP 体系的优化与应用. 中国农学通报，26 (12)：26–29.
Yu Hong，Ding Guo-hua. 2007. cDNA-AFLP technique and its application in cloning of differentially expressed genes. Chinese Agricultural Science
Bulletin，3 (12)：77–80. (in Chinese)
于 虹，丁国华. 2007. cDNA-AFLP 技术及在差异表达基因克隆上的应用. 中国农学通报，3 (12)：77–80.
Yuan Wei，Wan Hong-jian，Liu Yun-fei，Yu ke，Yang Yue-jian. 2013. The application of cDNA-AFLP technique in the interactions between tomato
and Tomato yellow leaf curl virus. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences，(1)：44–47. (in Chinese)
袁 伟，万红建，刘云飞，俞 锞，杨悦俭. 2013. cDNA-AFLP 技术在番茄及其黄化曲叶病毒互作中的应用. 浙江农业科学，(1)：
44–47.
Zhang Wen-wei，Wang Sheng-zheng，Liu Kai，Si Ning，Qi Fang-jun，Jian Gui-liang. 2012. Comparative expression analysis in susceptible and
resistant Gossypium hirsutum responding to Verticillium dahliae infection by cDNA-AFLP. Physiological and Molecular Plant Pathology，80：
50–57.
Zhu Hong-xia. 2004. Preliminary study on DNA fingerprinting of peony curtivars[M. D. Dissertation]. Beijing：Beijing Forestry University. (in
Chinese)
朱红霞. 2004. 牡丹、芍药品种 DNA 指纹图谱绘制的初步研究[硕士论文]. 北京：北京林业大学.