全 文 ：园艺学报，2016，43 (3)：525–537.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0625；http：//www. ahs. ac. cn 525
收稿日期：2016–01–15；修回日期：2016–03–21
基金项目：教育部博士点基金项目（20130146110022）；黄冈师范学院项目（2015TD02）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangcy@mail.hzau.edu.cn）
桂花 C4H 基因的克隆与表达特性分析
曾祥玲，郑日如，罗 靖，王彩云*
（华中农业大学，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）
摘 要：利用转录组测序获得的表达序列信息，结合 RACE 技术，从桂花（Osmanthus fragrans）花
瓣中克隆到两个参与苯丙烷代谢第 2 步反应的肉桂酸–4–羟基化酶（C4H）基因。其 ORF 全长分别为
1 518 bp 和 1 611 bp，各自编码 505 和 536 个氨基酸，命名为 OfC4H1 和 OfC4H2（登录号分别为 KR861466、
KF254842）。系统进化树表明，OfC4H1 与矮牵牛中的 PhC4H1、PhC4H2 等 C4H 蛋白聚为一类，属于 Class
Ⅰ类型；OfC4H2 与金银花中的 LjC4H 等属于 ClassⅡ类型。进一步的 C4H 蛋白序列多重比较发现，OfC4H1
和 OfC4H2 蛋白具有该基因家族特有的保守结构域，在这些保守结构域中存在区别两类 C4H 蛋白的典型
特征。利用 Real-time PCR 比较分析了 OfC4H1 和 OfC4H2 基因的时空表达模式，结果显示，OfC4H1 在
花瓣中的表达量最高；OfC4H2 在花瓣中的表达量较低，在花梗、雌蕊和幼叶等组织中表达量较高。构建
原核表达载体 pET6xHN-C4Hs，转化 Transetta（DE3）大肠杆菌并诱导表达的结果表明，目的蛋白能在原
核表达系统中顺利表达，而且与预期大小一致，但因溶解度较低无法进行酶活性分析。
关键词：桂花；肉桂酸 4–羟基化酶；黄酮类化合物；原核表达；基因表达
中图分类号：S 685.13 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0525-13

Cloning and Characterization of Cinnamate 4-hydroxylase（C4H）Genes
from Osmanthus fragrans
ZENG Xiang-ling，ZHENG Ri-ru，LUO Jing，and WANG Cai-yun*
（Key Laboratory for Biology of Horticultural Plants，Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，Wuhan
430070，China）
Abstract：According to the expressed sequence tags from transcriptome assembly and RACE
method， two cinnamate 4-hydroxylase genes，which are the second key enzymes involving in
phenylpropanoid biosynthesis，were obtained from petals of Osmanthus fragrans. The ORF of these two
C4H genes were separately 1 518 bp and 1 611 bp，encoded 505 and 536 amino acids and named OfC4H1
（GenBank No. KR861466）and OfC4H2（GenBank No. KF254842）. Phylogenetic analysis showed that
OfC4H1 protein was clustered together with Petunia hybrida C4H1 and C4H2，and belonged to ClassⅠ
type ， whereas OfC4H2 protein was clustered with Lonicera japonica C4H in Class Ⅱ type.
Multi-alignment of OfC4Hs proteins of several plants found that OfC4H1 and OfC4H2 had the
characteristic conservative domains of the C4H family，and special conserved domains which were
different in ClassⅠand ClassⅡ C4H. The results of time and space expression patterns by real-time PCR

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Cloning and characterization of cinnamate 4-hydroxylase（C4H）genes from Osmanthus fragrans.
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showed that OfC4H1 had the highest amount of expression in the petals. While OfC4H2 displayed higher
expression in green tissues including peduncles，pistils and young leaves，comparing to petals. By
constructing prokaryotic expression vector pET6xHN-C4H1 and pET6xHN-C4H2，and transforming into
Escherichia coli Transetta（DE3），the result showed that the target proteins can be well expressed in the
prokaryotic expression system，and consistent with the expected size，but unable to enzyme activity
analysis due to the low solubility of the recombinant proteins.
Key words：Osmanthus fragrans；cinnamate 4-hydroxylase；flavonoid compound；prokaryotic
expression；gene expression

桂花（Osmanthus fragrans）具有很高的观赏价值，食用价值和药用价值。根据花色的不同，桂
花被划分为银桂品种群、金桂品种群和丹桂品种群（向其柏和刘玉莲，2008）。类胡萝卜素的积累导
致桂花的花色加深。目前有关类胡萝卜素组分及其生物合成分子机制的研究已有报道（Han et al.，
2013，2014）。桂花中的类黄酮物质种类和含量丰富，不仅是重要的呈色物质，而且在食用和药用领
域具有广阔的应用前景。蔡璇等（2010）发现四季桂花瓣中的色素主要为类黄酮和类胡萝卜素，且
以类黄酮化合物为主。侯丹（2014）进一步对 23 个桂花品种的色素成分进行分析，所有品种的花瓣
中均含有类黄酮物质，定性分析共得到 8 种组分，确定的有乙氧基槲皮素、异鼠李素–3–O–芸香
糖苷、芒柄花素–7–O–葡萄糖苷和丁香亭–3–O–芸香糖苷，其中异鼠李素–3–O–芸香糖苷
是最主要的组分，占总黄酮含量的 2/3 以上，但总黄酮含量在不同品种中存在一定的差异。目前虽
然已对桂花中类黄酮的物质成分及含量有所了解，但对其生物合成分子机制的研究并不多。
类黄酮化合物通过苯丙烷代谢路径实现生物合成（Tanaka et al.，2008）。在拟南芥、矮牵牛等
植物中，苯丙烷代谢路径除了参与合成类黄酮等色素成分，还与木质素和花香物质的生物合成有关
（Barber & Mitchell，1997；Winkel-Shirley，2001；李波 等，2006；Dudareva et al.，2013）。苯丙
烷代谢路径中的第 1 步酶反应由苯丙氨酸解氨酶（PAL）完成，张威威等（2010）已完成了对桂花
中 PAL 基因全长的克隆。肉桂酸–4–羟基化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H）是苯丙烷代谢途
径中的第 2 步关键酶，其催化肉桂酸羟化作用产生 4–香豆酸，被锚定在内质网外膜上，通过 N–
末端的疏水螺旋区与苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4–香豆酰辅酶 A 连接酶（4CL）形成多酶复合体，
进而高效调控苯丙烷代谢路径（Winkel-Shirley，1999）。C4H 是细胞色素单加氧酶 P450 超家族
（CYP73）的成员之一，具有 C4H/CYP73A5 保守的 5 个特征性底物结合位点基序（SRS）和细胞
色素 P450 保守域，如富含苏氨酸结合槽基序、E-R-R 三联体和血红素结合域（Teutsch et al.，1993）。
Nedelkina 等（1999）依据系统进化树分析，首次提出应该将 C4H 分为 ClassⅠ和 ClassⅡ两种类型，
两类 C4H 的同源性较低。Betz 等（2001）发现甜橙（Citrus sinensis）中的两类 C4H 具有不同的生
理功能。目前，虽然已有拟南芥（Arabidopsis thaliana）、矮牵牛（Petunia hybrida）和茶树（Camellia
sinensis）等植物的 C4H 基因被报道（Mizutani et al.，1997；Ryan et al.，2002；姚胜波 等，2015），
且最近在金银花（Lonicera macranthoides）（Chen et al.，2015）和茶（Camellia sinensis）（Liu et al.，
2015）的研究中发现，叶片中的类黄酮物质绿原酸和儿茶素含量与 C4H 基因表达量密切有关，但有
关两类 C4H 与类黄酮合成关系的研究并不多。
在桂花中，张园（2009）利用 cDNA-AFLP 分离出 1 个 C4H 的短片段标签序列，但未对其进行
深入研究。本研究中根据转录组测序获得的短片段标签序列，通过 RACE-PCR，首次从桂花中克隆
到两个完整的 C4H，对其进行了序列比对、基因结构和功能特点分析，并利用 Real-time PCR 分析
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其表达模式，探讨桂花中 C4H 与黄酮类物质合成之间的关系，为从分子水平研究桂花中黄酮类物质
代谢奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以华中农业大学校园内树龄约 50 年的‘柳叶金桂’、‘厚瓣银桂’和‘镉橙丹桂’为材料，根
据杨康民（2011）对桂花开花物候的划分，参考 Zou 等（2014）的方法，于 2014 年 10 月采集铃梗
期（花朵开放的前 1 d）、初花期（花朵开放的第 1 天，花朵为完全展开）、盛花期（开放的第 2 天，
花瓣完全展开）和末花期（开放的第 4 天，花瓣明显脱落）的花瓣（又称花冠裂片），立即置于液氮
中进行速冻。取‘柳叶金桂’盛花期的花朵进行花器官组织部位的分离，将整个花朵分为花瓣、雄蕊
和去掉花瓣与雄蕊之后还剩下花梗和雌蕊共 3 个部分，迅速置于液氮中速冻。于 5 月采集‘柳叶金桂’
当年生枝条上的幼叶，迅速置于液氮中速冻。最后将速冻的样品放置于–80 ℃冰箱进行长期贮存。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取及 cDNA合成
分别取 0.2 g 幼叶及不同时期的花瓣样品用液氮进行磨样，主要步骤参考 Trizol 试剂盒说明书进
行。参考 Smart RACE（Clontech）的操作说明书，取不同开花时期的 RNA 等量混合后，用 2 μg 混
合后的 RNA 进行反转录获得 5′RACE 和 3′RACE cDNA。
1.2.2 3′RACE和 5′RACE扩增
根据转录组测序的 C4H 短片段标签序列设计两条正向特异引物（表 1），以 3′RACE cDNA 为模
板进行 3′RACE-PCR。参考 Smart RACE（Clontech）的操作说明书稍作改进，反应体系共 50 μL：
10× Advantage® 2 PCR Buffer 5 μL，10 mmol · L-1 dNTP Mix 1 μL，特异引物（10 μmol · L-1）1 μL，
UPM （10×）5μL，50× Advantage® 2 Polymerase Mix（Clontech）1 μL，3′RACE cDNA 2.5 μL 为模
板，加水至 50 μL。反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃预变性 30 s，72 ℃退火加延伸 3 min，5
个循环；94 ℃预变性 30 s，70 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 3 min，5 个循环；94 ℃预变性 30 s，68 ℃
退火 30 s，72 ℃延伸 3 min，25 个循环；72 ℃延伸 10 min。根据 3′RACE 测序信息设计两条反向
特异引物（表 1），以 5′-RACE cDNA 为模板进行 5′RACE-PCR。PCR 反应体系和反应程序同 3′RACE
扩增。
1.2.3 C4H基因 ORF扩增
以拼接测序所得的 C4H 信息预测 ORF 序列，在起始密码子和终止密码子附近设计上下游特异
引物扩增 C4H 基因的整个 ORF 区域（表 1）。以 3′或 5′RACE cDNA 为模板进行 PCR 反应。反应体
系共 50 μL：10× Advantage® 2 PCR Buffer 5 μL，10 mmol · L-1 dNTP Mix 1 μL，上游特异引物（10
μmol · L-1）2.5 μL，下游特异引物（10 μmol · L-1）2.5 μL，50× Advantage® 2 Polymerase Mix（Clontech）
1 μL，3′或 5′RACE cDNA 2.5 μL 为模板，加水至 50 μL。反应程序同 RACE-PCR。
1.2.4 亚克隆和测序
将胶回收的 DNA 片段按说明操作连接重组到 pEASYTM-T1 Simple 载体上，然后转化到大肠杆
菌克隆感受态细胞 Trans1-T1，涂布含 100 mg · L-1 Kan 的 LB 平板。以 M13R 和 M13F 为引物进行
PCR 阳性检测，将检测的阳性克隆送公司测序。
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表 1 桂花 OfC4H 基因克隆、载体构建及表达分析所用引物
Table 1 Primers used for cloning，construction of vector and gene expression of OfC4Hs in Osmanthus fragrans
引物用途
Primer use
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence（5′–3′）
3′RACE C4H1-3′-1
C4H1-3′-2
5′-AAGCAGGTTAAGGACAGAAGATTACAGC-3′
5′-CCCACATGAACCTCCACGATGCC-3′
C4H2-3′-1
C4H2-3′-2
5′-AGGCCGGCCGGTAACAGAATCGAACCC-3′
5′-GCCACAGTGTATGAAACACTACGGTTGC-3′
5′RACE C4H1-5′-1
C4H1-5′-2
5′-GGCTTTAGCACAATGGTGGAATG-3′
5′-GGCATCGTGGAGGTTCATGTGGG-3′
C4H2-5′-1
C4H2-5′-2
5′-AACCGCCGCCTCTGTTCCGTTCTCCTCT-3′
5′-CAGCCACCAAGCATT CACCACCACTTTT-3′
RACE 通用引物 RACE universal primer UPM 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′
UPN 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′
基因 ORF 克隆 Cloning the full-length ORF C4H1-LR
C4H1-LF
5′-ATGGATCTTCACCTTCTAGAGAAGACCC-3′
5′-TTAAAAGGATCTTGGCTTTAGCACAATG-3′
C4H2-LR
C4H2-LF
5′-CATGGGCAGTCTTCTCAACAAAACC-3′
5′-TGTATCCAAGTGACCTGTCTATGCC-3′
原核表达载体构建
Constructing the prokaryotic expression vector
C4H1-Sal I
C4H1-Not I
5′-ACGCGTCGACGATCTTCACCTTCTAGAGAAG-3′
5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAAAAGGATCTTGGCTTTAG-3′
C4H2-Stu I
C4H2-Xba I
5′-GAAGGCCTGGCAGTCTTCTCAACAAAACC-3′
5′-GCTCTAGACTATGCCACGACAACAGAATG-3′
基因表达分析 Gene expression qC4H1-R
qC4H1-F
5′-AAACCGTGCTCGGACCAGG-3′
5′-GGTTCATGTGGGGGACCAGA-3′
qC4H2-R
qC4H2-F
5′-CCAGGTTTGGAAAAGATAGATGTGA-3′
5′-TATGCCTTGATTGGTTTAAAGACGA-3′
qactin-R
qactin-F
5′-ATTAGTCCTCTTCCAGCCTTCTTTG-3′
5′-ATTATTTCCTTGCTCATACGGTCAG-3′
阳性克隆检测 Detecting positive colony M13-R
M13-F
5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′
5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′
pET-R
pET-F
5′-AGCAAAAAACCCCTCAAGACCCG-3′
5′-TCGATCCCGCGAAATTAATACGAC-3′


1.2.5 生物信息学分析
用DNAMAN进行序列拼接和比对，序列BLAST在NCBI（http：//www.ncbi.nLm.nih.gov/BLAST/）
上进行，用开放读码框（ORF）预测在 ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）上
进行，Bootstrap 检测和 Neighbor-Joining 法分子进化树的构建用 MEGA6.1 软件进行，蛋白质结构预
测根据 Expasy 网站（http：//www.expasy.org/tools/）提供的连接进行。
1.2.6 C4H的 Real-time分析
分别提取幼叶及不同时期花瓣样品的总 RNA，Dnase 1（Rnase-free）（Fermentas 公司）处理后，
用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas 公司）进行反转录合成 cDNA 第 1 链。以组
成型表达的细胞激动蛋白基因（β-actin）作为内参基因，在 ABI PRISM® 7500 荧光定量 PCR 仪上进
行扩增，反应体系及程序参考 TaKaRa 公司的 SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）操作
说明书，每个样品 3 次重复，用 2-∆∆Ct 法进行相对表达量分析（表 1）。
1.2.7 C4H原核表达载体的构建
根据原核表达载体 pET6xHN（Clontech）上的序列信息以及基因的序列信息选定酶切位点，
OfC4H1 选择 SalⅠ和 NotⅠ进行双酶切，OfC4H2 选择 StuⅠ和 XbaⅠ进行双酶切。根据 ORF 的序列
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信息设计特异引物，其中上游的特异引物不含 ATG 起始密码子，之后在特异引物的 5′端加上特定的
酶切位点（表 1）。以 ORF 区域测序正确的平板菌落为模板，利用加了酶切位点的特异引物进行 PCR，
对获得的目的片段进行切胶回收，用选定的内切酶对回收后的目的片段进行双酶切，用 T4 连接酶
连接到同样双酶切的原核表达载体上，转化 Trans1-T1，在 Amp 抗性的平板上挑去单克隆，利用
pET-F/pET-R 引物（表 1）进行 PCR 鉴定，阳性菌落利用 pET-F/pET-R 引物进行测序，测序完全正
确的菌落进行甘油菌的保存。将构建正确的表达载体命名为 pET6xHN-C4H1 和 pET6xHN-C4H2，
转化 Transetta（DE3）（全式金公司）感受态细胞。
1.2.8 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及 SDS-PAGE分析
挑测序正确的单克隆接种到 2 mL LB（100 μg · mL-1 Amp）培养基中，37 ℃ 200 r · min-1振荡
培养 12 h 后，将菌液按 1︰50 的比例加入到 100 mL LB（100 μg · mL-1 Amp）培养基中，37 ℃ 200
r · min-1 振荡培养至 OD600 为 0.6 ~ 0.8 时，加入 IPTG 至终浓度为 0.2 mmol · L-1，在 18 ℃ 250 r · min-1
的条件下诱导表达 14 ~ 16 h 后收集菌液。以不含目的基因的 pET6xHN 空载转化的 Transetta（DE3）
大肠杆菌为阴性对照。取收集的菌块加入 1/10 原菌液体积的 1× PBS 缓冲液，加入溶菌酶至终浓度
0.75 mg · mL-1，并加入 DNase I 至 1 unit · mL-1，重悬，超声波 3 次，每次 10 s，期间在冰上放置 30
s。4 ℃ 12 000 r · min-1 离心 20 min，取上清液至干净的离心管中，再用 1/10 原菌液体积的 1× PBS
缓冲液重悬沉淀。在得到的上清液和沉淀悬浮液中分别加入等体积的 2× SDS上样缓冲液混匀，95 ℃
加热 3 ~ 5 min，12 000 r · min-1 离心 2 min，上样进行 SDS-PAGE（5%浓缩胶，12%分离胶），然后
分析蛋白表达结果。
1.2.9 总黄酮的提取与含量测定
将幼叶及不同时期的花瓣样品干燥、粉碎，准确称取粉末 0.1 g，以 1︰40 的固液比分别加入 80%
的乙醇溶液，于 70 ℃浸提 3 h，12 000 r · min-1 离心 10 min，取上清液用于总黄酮含量的测定。按
照蔡健和王薇（2007）的方法制作芦丁标准溶液的标准曲线，得到吸光值 A 与芦丁标准溶液浓度（C，
μg · mL-1）之间的回归方程：C = 93.4031A + 0.28916，R2 = 0.9997。以 1 mL 提取液代替芦丁标准溶
液进行测定，根据回归方程计算提取液的 C 值。样品中总黄酮含量（mg · g-1DW）= 50 × C × V/M。
C 为测定样品液中总黄酮浓度（mg · mL-1）；M 为样品干样质量（g）；V 为样品最后定容体积（mL）；
50 为测定时提取液的稀释倍数。
2 结果与分析
2.1 OfC4Hs cDNA 全长的克隆及序列特征
根据转录组测序获得的短片段表达标签设计引物，以 cDNA 为模板，通过 RACE-PCR 方法获得
两个完整的基因，开放阅读框（ORF）的碱基数分别为 1 518 bp 和 1 611 bp，各自编码 505 和 536
个氨基酸，命名为 OfC4H1（登录号为：KR861466）和 OfC4H2（登录号为：KF254842）。OfC4H1
编码产物的分子式为 C2635H4155N713O725S16，分子量为 57.94 kD，理论等电点（pI）为 8.97，含负电
荷氨基酸残基（Asp + Glu）共 60 个，正电荷氨基酸残基（Arg + Lys）共有 67 个。OfC4H2 编码产
物的分子式为 C2805H4373N749O767S22，分子量为 61.66 kD，理论等电点（pI）为 8.40，含负电荷氨基
酸残基（Asp + Glu）共 57 个，正电荷氨基酸残基（Arg + Lys）共有 60 个。
蛋白质亚细胞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析表明这两个蛋白均为分泌蛋
白。
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2.2 OfC4Hs 编码蛋白的同源性分析
同源性比较分析发现，从桂花中克隆的两个 C4H 基因的相似性很低，核苷酸序列与推测的氨
基酸序列的一致性分别仅为 59%和 58%。将 OfC4H 蛋白序列与其他物种进行同源性比较得知，
OfC4H1 与矮牵牛（C4H1 ADX33332.1 和 C4H2 ADX33333.1）、长春花（CAA83552.1）、藿香
（AAU09021.1）等序列有很高的同源性，达到了 90%以上。而 OfC4H2 与金银花（AGE10593.1）、
甜橙（AAF66065.1）和毛果杨（ACC63872.1）等序列的同源性较高，分别为 82%、81%和 80%。
用 MEGA6.1 对桂花、拟南芥、矮牵牛和苹果等 21 个物种的 C4Hs 蛋白的氨基酸序列构建系统进化
树（图 1）。结果表明，整个进化树分为两个主枝，OfC4H2 与金银花（AGE10593.1）、甜橙（C4H1
AFF66065.1）、毛果杨（ACC63872.1）和冰叶日中花（AAD11427.1）亲缘关系较近，聚在一类，
属于 ClassⅡ类型；OfC4H1 与余下的矮牵牛（C4H1 ADX33332.1 和 C4H2 ADX33333.1）、长春花
（CAA83552.1）和藿香（AAU09021.1）等聚为一类，属于 ClassⅠ类型（图 1）。


图 1 OfC4Hs 与其他植物 C4H 的同源性和系统发育树
Fig. 1 Homology tree and phylogenetic tree of OfC4Hs and C4Hs from other plants

多重比对分析发现（图 2），OfC4H1 和 OfC4H2 的 SRS2、SRS3 和 SRS5 等 3 个特征性底物结
合位点基序与其他物种保持一致。而 SRS1 和 SRS4 基序存在两种不同的情况，以 OfC4H1 为代表的
ClassⅠ类型的 SRS1 基序为 SRTRNVVFDIFTGKGQDMVFTVY，而与 OfC4H2 聚在一起 ClassⅡ类
型的 SRS1 基序为 SRPRNVVFDIFTGNGQDMVFTI(V)Y；SRS4 在 ClassⅠ类型中的序列为
RMAIPLLVPH，而 ClassⅡ类型为 HTPIPLLVPH。
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图 2 OfC4H 与其他植物 C4H 蛋白的多重比对
黑色方框：底物结合位点基序；虚线：富含苏氨酸结合槽基序；双黑线：E-R-R 三联体；
虚线方框：血红素结合域；单黑线：酶正确定向必需的铰链基序。
Fig. 2 Protein multi-alignment of OfC4Hs with C4Hs from other plants
Substrate recognition sites（SRS）are highlighted in black box；T-containing binding pocket motif is shown with dotted line；
ERR triad is marked by double black line；Heme domain is indicated by dotted box；
Single black line stands the hinge region.


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另外，OfC4H1 蛋白的富含苏氨酸结合槽基序、E-R-R 三联体和血红素结合域与金银花
（AGE10593.1）、甜橙（AAF66065.1）和毛果杨（ACC63872.1）等物种的基本一致，但 OfC4H2 血
红素结合域中的缬氨酸（V）被甲硫氨酸（M）替代。而酶正确定向必需的铰链基序也同 SRS1 一样
存在两种情况，包括 OfC4H1 在内的 ClassⅠ类型保守性更高，而 ClassⅡ类型的 C4H 蛋白在该区域
存在更多的变异。
以上结果表明，从桂花中克隆的两个 C4H 基因确实是肉桂酸 4–羟化酶的典型成员，但分别属
于两种不同的类型，而且两种类型的 C4H 在一些保守结构域存在一定差异。
2.3 OfC4Hs 表达特征分析
用 Real time PCR 检测了‘柳叶金桂’盛花期不同组织 OfC4H1 和 OfC4H2 基因的表达水平。结
果发现，OfC4H1 在花瓣中的表达量最高，其次是花梗和雌蕊，最后是在雄蕊和幼叶中（图 3，A）；
OfC4H2 在花瓣中的表达量却最低，在幼叶中的表达量有所增加，仅次于花梗和雌蕊，但高于雄蕊
（图 3，B）。


图 3 OfC4H1（A）和 OfC4H2（B）在‘柳叶金桂’盛花期不同组织部位的表达水平
不同小写字母代表单因素方差分析的显著性差异（P < 0.05）。
Fig. 3 Expression levels of OfC4H1（A）and OfC4H2（B）in different tissues of Liuye Jingui
at full flowering stage
Means labeled without a common letter are significantly different（P < 0.05）
based on LSD of One-way ANOVA.

此外，比较分析了 OfC4Hs 在‘厚瓣银桂’、‘柳叶金桂’、‘镉橙丹桂’中 4 个开花阶段的表达
模式。结果表明，OfC4H1 的表达量（图 4，A）在 3 个品种中的变化趋势基本一致，在铃梗期较低，
至盛花期维持在一定的水平，到末花期迅速增加。
OfC4H2 的表达量（图 4，B）在铃梗期较高，之后随着花朵的开放逐渐下降，至盛花期之后维
持在一定的水平。铃梗期 3 个品种的 OfC4H2 表达量差异较大，‘厚瓣银桂’最高，其次是‘柳叶金
桂’，‘镉橙丹桂’最低；初花期‘厚瓣银桂’高于‘柳叶金桂’和‘镉橙丹桂’；盛花期 3 个品种没
有明显的差异；末花期‘厚瓣银桂’略高于‘柳叶金桂’和‘镉橙丹桂’。
两个 C4H 基因表达模式的差异说明二者可能行使不同的生理功能。



曾祥玲，郑日如，罗 靖，王彩云.
桂花 C4H 基因的克隆与表达特性分析.
园艺学报，2016，43 (3)：525–537. 533



图 4 OfC4H1（A）和 OfC4H2（B）在 3 个桂花品种盛花期花瓣中的表达水平
Fig. 4 Expression levels of OfC4H1（A）and OfC4H2（B）in three cultivars of O. fragrans
at different flowering stages

2.4 不同品种开花过程中总黄酮含量变化
以芦丁为标准品，采用 Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 法建立标准曲线、回归方程和相关系数，分析了
‘厚瓣银桂’、‘柳叶金桂’、‘镉橙丹桂’开花阶段花瓣中的总黄酮含量。
结果（图 5）表明，‘柳叶金桂’和‘厚瓣银桂’花瓣中总黄酮含量的变化趋势基本一致，先升
后降，初花期达到峰值；而‘镉橙丹桂’在铃梗期就较高，到初花期反而降低，盛花期稍微上升，
至末花期又下降。铃梗期‘镉橙丹桂’中的总黄酮含量最多，其次为‘柳叶金桂’，‘厚瓣银桂’最
少；初花期‘柳叶金桂’最多，‘厚瓣银桂’次之，‘镉橙丹桂’最少；盛花期‘镉橙丹桂’最多，
‘厚瓣银桂’略高于‘柳叶金桂’；末花期与铃梗期的情况相同，‘镉橙丹桂’最多，‘厚瓣银桂’最
少。


图 5 3 个桂花品种不同开花时期花瓣总黄酮含量变化
Fig. 5 Changes of total flavoniod content in three cultivars of O. fragrans during flowering

2.5 OfC4H 基因的原核表达分析
重组质粒 pET6 × HN-C4H1 和 pET6 × HN-C4H2 转化感受态细胞 Transetta（DE3）后，用 IPTG
诱导重组蛋白的表达，进行 SDS-PAGE 电泳检测。为了尽可能多地获得可溶性蛋白，选用了较低的
诱导温度（18 ℃）和 IPTG 浓度（0.2 mmol · L-1）。
结果表明，与阴性对照 pET6 × HN 空载相比，含重组质粒的大肠杆菌的包涵体内，在 50 ~ 70 kD
Zeng Xiang-ling，Zheng Ri-ru，Luo Jing，Wang Cai-yun.
Cloning and characterization of cinnamate 4-hydroxylase（C4H）genes from Osmanthus fragrans.
534 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (3)：525–537.
之间存在明显的特异蛋白质条带，与理论分子质量基本一致，表明重组质粒在大肠杆菌 Transetta
（DE3）中诱导表达了桂花 C4H 蛋白，但是诱导的 OfC4H 融合蛋白主要以包涵体形式存在，上清
液中的表达不明显（图 6）。









图 6 桂花肉桂酸 4–羟基化酶（C4H）重组蛋白在大肠杆菌中的表达
M：蛋白 marker；1：包涵体沉淀；2：上清液。
Fig. 6 Expression of recombinant pET6xHN-OfC4H proteins in Transetta（DE3）
M：Protein marker；1：Inclusion body；2：Supernatant.
3 讨论
本研究中从桂花中克隆出两个完整的 C4H 基因。其中 OfC4H2 与张园（2009）利用 cDNA-AFLP
分离出的 3′端 C4H 片段存在较高同源性，而 OfC4H1 与其不存在同源性。OfC4H1 和 OfC4H2 的同
源性不到 60%，说明在桂花基因组中至少存在两个 C4H 基因拷贝。不同物种 C4H 基因拷贝数可能
不同，如豌豆中只有一个拷贝（Frank et al.，1996），苜蓿、亚洲棉、矮牵牛和甜橙中存在两个拷贝
（Dixon & Paiva，1995；Betz et al.，2001；骆萍 等，2001；Colquhoun et al.，2011），而绿豆、长
春花和甘蓝中的 C4H 是由多个拷贝形成的一个小基因家族（Mizutani et al.，1993；Hotze et al.，1995；
Fourmann et al.，2002），基因多拷贝的存在有利于植物进行复杂的代谢调控。依据系统进化树和 C4H
蛋白的保守结构域，将 OfC4H1 和 OfC4H2 分别归于 ClassⅠ和 ClassⅡ类型。至今在一个物种中同
时发现两类 C4H 的报道并不多见。Betz 等（2001）报道甜橙中存在两种类型的 C4H，ClassⅠ类型
的 C4H2 在橙皮中组成型表达，而 ClassⅡ类型的 C4H1 经损伤诱导后在橙皮中表达，说明两类基因
响应不同的生理机制。桂花中 OfC4H1 和 OfC4H2 在不同组织部位以及 3 个品种各开花阶段的不同
表达模式说明二者具有不同的生理功能。OfC4H1 在花瓣中的表达量更高，而 OfC4H2 在绿色组织
花梗与雌蕊以及幼叶中的表达量更高，说明花瓣中黄酮类物质的合成可能主要受 OfC4H1 的影响；
而 OfC4H2 则可能主要负责绿色组织中类黄酮的合成。王玉婵等（2011）的报道说明，‘柳叶金桂’
叶片中确实含有黄酮类物质槲皮素、芦丁和绿原酸，具有很高的药用价值。
分析了 3 个桂花品种花瓣中总黄酮含量的变化，结果发现，除了铃梗期和末花期外，初花期和
盛花期花瓣中总黄酮含量与花瓣颜色的深浅并不一致。侯丹（2014）分析 23 个桂花主要栽培品种盛
花期花瓣中的总黄酮含量，数据也显示总黄酮含量与花瓣颜色存在不一致的情况，类胡萝卜素对桂
花花色的形成起决定性的作用。因此得出结论，类黄酮对桂花花色有一定的影响，但是作用不及类
胡萝卜素明显，因此造成总黄酮含量虽低但花瓣颜色却深的情况。C4H 是参与黄酮类物质合成的第
2 步关键酶，在矮牵牛叶片、黑莓果实和苦荞子叶与胚轴中，黄酮积累量与 C4H 表达量呈现同步增
曾祥玲，郑日如，罗 靖，王彩云.
桂花 C4H 基因的克隆与表达特性分析.
园艺学报，2016，43 (3)：525–537. 535

加或减少的变化趋势（Ryan et al.，2002；Baek et al.，2008；陈鸿翰 等，2013）。在本研究中，虽
然 OfC4H1 更趋于在花瓣中表达，但在不同开花阶段的花瓣中，其转录水平与总黄酮含量呈现相反
的变化趋势，而且在各时期不同品种的差异并不是很明显，由此说明，OfC4H1 不是引起品种间及
不同开花时期总黄酮含量差异的原因。OfC4H2 基因的表达量与总黄酮含量虽然呈现一致的变化趋
势，但其在花瓣中的表达量较低，而且铃梗期时与 3 个品种中的总黄酮含量呈反比，盛花期时在 3
个品种间的差异不明显，说明 OfC4H2 与桂花花瓣中总黄酮含量的变化关系不密切。另外，OfC4H2
在花朵开放之前的铃梗期花瓣以及幼叶中表达量较高，说明该基因可能参与木质素的合成，有利
于花瓣和叶片的延伸（Vincent et al.，1997；Schilmiller et al.，2009）。由此推测，不同品种及各开
花时期黄酮类物质的差异可能是由苯丙烷代谢路径上的其他基因引起的，后期将进行这方面的深
入挖掘。
本研究中首次探索了桂花 C4H 蛋白的原核表达体系，以期从蛋白水平了解桂花 C4Hs 的蛋白质
结构和生物学功能。张婷婷等（2011）以 pET32a 为载体，转化 BL21（DE3）大肠杆菌菌株，在 37
℃ IPTG 0.5 mmol · L-1 的条件下成功诱导表达了丹参的 C4H 蛋白，但是表达的 C4H 蛋白以包涵体
的形式存在。一般来说，较低的诱导温度和 IPTG 浓度有利于原核表达体系中可溶性蛋白的形成。
本研究以 pET6xHN 为载体，转化 Transetta（DE3）大肠杆菌菌株，采用了 18 ℃ IPTG 0.2 mmol · L-1
的诱导条件对 OfC4Hs 进行诱导，获得了与预测的目的蛋白分子质量一致的特异蛋白条带，但是蛋
白的溶解度仍然很低。大肠杆菌等原核生物中没有细胞器结构和催化反应必须的细胞色素 P450 还
原酶（Hotze et al.，1995）。因此，可能并不是诱导条件而是因为缺乏正确的蛋白折叠和加工修饰
从而导致了 OfC4Hs 在原核表达系统中形成大量包涵体。姚胜波等（2015）运用酵母真核表达系统
对茶树 C4H 基因成功地进行了表达并获得具有生物活性的 C4H 蛋白。因此，桂花 C4H 基因的蛋白
表达是否可以借鉴酵母真核表达系统有待进一步研究。该研究不仅为进一步认识 C4H 的基因特性
和功能、挖掘 C4H 基因成员提供了依据，也为深入研究黄酮类物质合成调控的分子机理奠定了基
础。

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