全 文 :园艺学报,2016,43 (7):1295–1304.
Acta Horticulturae Sinica
doi:10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0652;http://www. ahs. ac. cn 1295
收稿日期:2016–04–08;修回日期:2016–06–02
基金项目:广东省自然科学基金团队项目(S2011030001410);广东省重点科技攻关项目(2015B020202004);广东省教育厅自然科学
特色创新项目(2014KTSCX033);广东省科技攻关项目(2015A020209154)
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:caobh01@163.com)
茄子调控抗青枯病反应信号基因的筛选和鉴定
肖熙鸥 1,2,蒋 晶 1,陈 娜 1,雷建军 1,吕玲玲 2,曹必好 1,*
(1 华南农业大学园艺学院,广州 510642;2中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,广东湛江 524091)
摘 要:以抗青枯病茄子自交系‘E-31’为材料,利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene
silencing,VIGS)技术沉默抗病材料中调控抗病相关的信号基因,研究其在茄子抗青枯病反应中的作用。
qRT-PCR 结果表明,与对照植株相比,VIGS 诱导基因沉默植株,目的基因的表达量均下降。MAPK 级联
途径相关基因 MKK2 和 MAPK6,SA 途径中的信号基因 PAD4、NPR1、SGT1、TGA 和 GluA,以及 WRRY
转录因子基因 WRKY70 沉默,接种青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)后植株出现不同程度的枯萎,
而对照植株无变化。MAPK 级联途径相关基因 MAPK3 和 MAPK4,SA 途径中的信号基因 NDR1,ET 途
径中的信号基因 EIN2 和 EIL1,JA 途径信号基因 JAR1 沉默后,植株均未出现萎蔫症状。研究结果表明,
MKK2、MAPK6、PAD4、NPR1、SGT1、TGA、GluA 和 WRKY70 等基因在茄子调控抗青枯病反应中起正
调控作用,而 MAPK3、MAPK4、NDR1、EIL1、EIN2 和 JAR1 等基因可能未参与或起负调作用,推断茄
子‘E-31’调控青枯病信号途径可能主要依赖于 SA 途径。
关键词:茄子;青枯病;信号基因;SA;VIGS
中图分类号:S 641.1 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2016)07-1295-10
Identification of Key Signal Gene Involved in Eggplant Bacterial
Wilt-resistance
XIAO Xi-ou1,2,JIANG Jing1,CHEN Na1,LEI Jian-jun1,Lü Ling-ling2,and CAO Bi-hao1,*
(1Horticultral College,South China Agriculture University,Guangzhou 510642,China;2South Subtropical Crop Research
Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang,Guangdong 524091,China)
Abstract:To identify the function of signal gene in the eggplant bacterial wilt-resistance,the
transcription of 14 genes were silenced by virus induced gene silencing(VIGS)in bacterial wilt resistant
eggplant‘E-31’. After the VIGS eggplant was challenged by Ralstonia solanacearum,qRT-PCR result
showed that the expression levels of 14 genes was reduced compared with the control. The inoculation
results showed that after the silence of MKK2,MAPK6,PAD4,NPR1,SGT1,TGA,GluA and WRKY70
in the resistant eggplant,the eggplant displayed the wilt symptom. While the expression levels reducing of
MAPK3,MAPK4,NDR1,JAR1,EIN2 and EIL1 in the‘E-31’eggplant did not cause the bacterial wilt
resistance down. The resulted suggested MKK2,MAPK6,PAD4,NPR1,SGT1,TGA,GluA and WRYK70
positively regulated the resistance of bacterial-wilt in the eggplant. However,MAPK3,MAPK4,NDR1,
Xiao Xi-ou,Jiang Jing,Chen Na,Lei Jian-jun,Lü Ling-ling,Cao Bi-hao.
Identification key signal gene involved in eggplant bacterial wilt-resistance.
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EIL1,EIN2 and JAR1 was not involved in the bacterial wilt-resistance or negatively regulated the
resistance. The result indicated that the regulation of bacterial wilt-resistance involved in eggplant may
mainly rely on SA signal way.
Key words:eggplant;bacterial wilt;signal gene;SA;VIGS
植物防卫反应是一系列复杂的信号途径相互作用的结果,涉及到激酶、激素和活性氧的相互作
用,导致植物下游基因的转录,产生防卫化合物,最终形成相应的抗性。植物的激素类物质及信号
传导途径在植物适应胁迫过程中起着至关重要的作用,如水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)
以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等(Loake & Grant,2007;Koornneef & Pieterse,2008;Rivas-San
& Plasencia,2011;Chehab & Braam,2012)。
目前关于茄子抗青枯病的研究主要集中在抗病材料的鉴定(封林林 等,2000),抗性遗传规律
分析(杨建国 等,2006)以及分子标记上(Lebeau et al.,2013),而其抗病机理研究相对滞后。
利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术开展茄子调控抗青枯病信号途径的相关研究,对于阐明茄
子调控青枯病抗性分子机制和开展茄子抗病基因工程育种有重要的理论意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料‘E-31’为栽培茄(Solanum melongena L.)和水茄(S. torvum Sw.)杂交后经过多代
自交获得的高抗青枯病材料。VIGS 病毒载体 pTRV-1、pTRV-2 以及农杆菌 GV3101 由重庆大学生命
工程学院杨迎伍老师惠赠。pMDT-19、SYBR Premix Ex 等试剂均购自 TaKaRa 公司。RNA 提取试剂
盒购自华越洋公司。
1.2 目的基因片段的克隆
根据文献查找了与 MAPK、SA、JA 以及 ET 信号途径相关的基因。根据 GenBank 中马铃薯、
番茄、烟草和矮牵牛等同源基因设计引物,以茄子叶片 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,克隆目的基因
片段。PCR 反应所用引物及体系见表 1。
将 PCR 产物经检测纯化后,连接到克隆载体 pMDT-19,通过热激法导入大肠杆菌中,挑选白
斑送往上海生工进行测序。将获得的序列在 GenBank 中进行分析确认。
1.3 VIGS 载体的构建
根据 pTRV-2 中 MCS 中的酶切位点,设计含相应酶切位点的引物构建载体。构建载体所使用的
引物及酶切位点见表 2。
酶切方法参考 TaKaRa 内切酶说明书,使用 TOYOBO ligation high 高效连接酶进行连接。将连
接的产物导入大肠杆菌中,经过测序确认 N:pTRV-2 重组载体。最后将构建成功的 N:pTRV-2 重
组载体通过热激法导入农杆菌 GV3101 中。
肖熙鸥,蒋 晶,陈 娜,雷建军,吕玲玲,曹必好.
茄子调控抗青枯病反应信号基因的筛选和鉴定.
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表 1 目的基因片段克隆引物及反应体系
Table 1 Primers for cloning signing gene and PCR reaction system
信号途径 Signal pathway 目的基因 Gene 引物序列(5′–3′)Sequence of primer 反应程序 Reaction system
MAPK MKK2 F:GCTTCCTACCCCTTTACATTTC
R:CAGGAGGCTGAGACATACAAAT
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
MAPK3 F:TTCGCCATTTAGACCAT
R:CCTATCCCTTGTTGCTC
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
MAPK4 F:TACGGAATCGTCTGCTGTGCTA
R:GGGAAATGCTCGGAAAATGGT
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
MAPK6 R:ATGGCTGCTCAAAATCCAAACTG
F:GCTTCCTACCCCTTTACATTTC
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
SA PAD4 F:GAATTCCGAAGATGCTAAGGAAGCCC
R:AAGGAAACTGAGGTTGGAGCAGCT
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
TGA F:GAAGGCCTCCCAGAAACAAGACTCG
R:CCGATTCTGGTTCTCGCACT
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
NPR1 F:ATTGTGACCCCAAGGTTGTTACTG
R:TTTTGTTCCTCTGGAGTGCCC
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
SGT1 F:AATCAACTGTCACCCTGTCCC
R:GCTCTTCTGGTGTCCTCGTCA
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
GluA F:TACTGAGTGGTGGAGGAAGTGTGC
R:GTCGAGTCCAGCAAGAACTCCAG
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
NDR1 F:CAAAGGTGTTCGTTACGATG
R:CCTGAACCTGCAATTGTAAAAC
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
ET EIL1 F:CCACCCTTGGTTCGTT
R:TGGCTGAGCAGGTAGTT
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
EIN2 F:TGGAAATGTCCCTGTA
R:CCCATCATCTTGCCTA
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
JA JAR1 F:GCAGCTATGGGGTTTGAATGGCAGA
R:AAGAGGTCAGGAATCAAGCCGTACC
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,
30 cycles;72 ℃ 10 min
WRKY70 F:CCCTCGCCGCCGTTGAGGGATCTCA
R:CGCCGCCACCTCCAAACACCATGAG
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,
30 cycles;72 ℃ 10 min
表 2 N:pTRV-2 载体构建引物
Table 2 Primers for construction of N:pTRV-2 vector
信号途径
Signal pathway
目的基因
Gene
引物序列(5′–3′)
Sequence of primer
片段大小/bp
Fragment length
酶切位点
Restriction enzyme site
MAPK
MAKK2 F:CCGGAATTCGCTTCCTACCCCTTTACATTTC
R:CCGGAATTCCAGGAGGCTGAGACATACAAAT
184 BamHⅠ
E + MAPK3 F:CCGGAATTCAACTGCTTGCGTGGATGT
R:CGCGGATCCTGTTTGGTCTGTGGGTTG
480 BamHⅠ
EcoRⅠ
E + MAPK4 F:GCTCTAGACCACTCGTTCCTGGATTGT
R:TCCCCCGGGTAATACGCTCGTCACAGGC
439 XbaⅠ
SmaⅠ
E + MAPK6 F:GCTCTAGAGAAACCCAAGACTGGCATC
R:TCCCCCGGGATTCATTCCAACCAAGAGC
400 XbaⅠ
SmaⅠ
SA E + PAD4 F:GCTCTAGAGCCAAAACATCGGCTGAAACC
R:TCCCCCGGGGTAATACAGGAAAGGGAAGCATCG
300 XbaⅠ
SmaⅠ
E + NPR1 F:GCTCTAGAATGGGGGAAGAAAATAGTGC
R:TCCCCCGGGCTTGGACTGGGTGTTGCTAA
308 XbaⅠ
SmaⅠ
E + SGT1 F:CCGGAATTC CTCGGTTTTGAGGAAGGGTA
R:CGCGGATCC AATCAACCTGGTCACCCTGT
390 BamHⅠ
EcoRⅠ
E + TGA F:CCGGAATTCCAAGTGACCCTGAACTACGA
R:CGCGGATCCAACGCCTCCATACCTTGT
295 BamHⅠ
EcoRⅠ
E + GluA F:CCGGAATTCTCAACACGCCTTGGTATTCC
R:CGCGGATCCCATCAATGCCCCTCGTAGTG
418 BamHⅠ
EcoRⅠ
E + NDR1 F:CGGGATCCAAGAAAGCACATAAAAAAGG
R:GGAATTCCAATCAACTGAGTCCAACAT
442 XbaⅠ
SmaⅠ
ET
E + EIL1 F:CCGGAATTC TTGAACGACAGCCCTGAGTA
R:CGCGGATCC CAGGCAGAGCAGATGACTTT
436 XbaⅠ
SmaⅠ
E + EIN2 F:GGAATTCCCTATGTTCCTCGCCAAGATTC
R:TCCCCCGGG CCAAGTCAACCGTAGATGTA
334 EcoRⅠ
Sma I
JA E + JAR1 F:CGGGATCCACAAAGGGAGGTTTAGCAGC
R:GGAATTCCACACAAAAGGTGGCAGTAT
160 BamHⅠ
EcoRⅠ
E + WRKY70 F:CGGGATCCGAATTGTTTGCGACCCGTTA
R:GGAATTCTGGACTTGCTTTGTTGCCTT
210 BamHⅠ
EcoRⅠ
Xiao Xi-ou,Jiang Jing,Chen Na,Lei Jian-jun,Lü Ling-ling,Cao Bi-hao.
Identification key signal gene involved in eggplant bacterial wilt-resistance.
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1.4 目的基因的沉默及青枯菌的分离与接种
在茄子幼苗 4 片真叶(苗龄约为 4 周)时进行侵染,侵染过程参照李媛(2007)的方法略有改
动。将含有靶标片段和 pTRV-1 的农杆菌 GV3101 菌株分别接种于 YEP 液体培养中,28 ℃恒温振荡
培养至其 OD600 值达到 0.8 ~ 1.0。离心收集菌体,用等体积的侵染缓冲液(10 mmol · L-1 MgCl2,10
mmol · L-1 MES,200 μmol · L-1 As)进行悬浮,然后将悬浮菌液在 22 ~ 25 ℃下振荡培养 5 h,最后
将 pTRV1 菌株悬浮液与含有靶标片段的悬浮菌液按 1︰1(体积比)混合。以空载 pTRV-2 与 pTRV-1
混合作为对照。
青枯菌生理小种 1 号从田间茄子发病植株上分离,分离及接种参考曹必好等(2010)的方法。
接种前 2 d 将茄子幼苗进行脱水处理,断根后在土壤中注射 3 ~ 5 mL 混合液。将植株在 16 ℃ 60%
相对湿度下黑暗培养 1 d 后,置于 25 ℃,16 h 光照/8 h 黑暗条件下培养 10 d,最后接种 Ralstonia
solanacearum。每个处理接种 10 株幼苗,至少 2 次重复。
1.5 qRT-PCR 检测
接种 R. Solanacearum 7 d 后,提取茎基部 RNA,利用 qRT-PCR 检测目的基因的表达量,所用
引物及反应体系见表 3。
表 3 qRT-PCR 分析所用引物
Table 3 Primers for qRT-PCR analysis
引物序列(5′–3′)Sequence of primer 引物名称
Primer 正向 Forward 反向 Reverse
片段/bp
Fragment length
qMKK2 CCACAGGCGTAAGATTGTTCAC TAGGATGCTCACCCCAAGACT 241
qMAPK3 CGATGGCTAATGGATTCACATGAGG GCTTCTTGGCACCCCTACAGAGTCT 137
qMAPK4 TCGTTCCTGGATTGTCACTTCTTAG AGTACGTTGTTACCCGCTGGTATAG 231
qMAPK6 TCTCAGTTGTTGTCCTTGCTAGCC ACTCCGTCAATATCTTGCACCGTG 108
qNPR1 CTTGGACTGGGTGTTGCTAATG TGCCCATCCAATGTAATGTCTG 146
qTGA GCAAGTGACCCTGAACTACGAAG GGGTTTTCCACATCCCTGACAAG 127
qGluA GCCGACTGGGTGAGATGGTAA ACATTGTTGTGCCCGTGGAC 106
qPAD4 ACATCGGCTGAAACCTCCTTATT TTTGATAAGTGGTGGGGAAATGA 215
qSGT1 TTCTCGGTTTTGAGGAAGGG GCAGATACCAAGTGATGTCTACCA 162
qNDR1 ATGTCAGACTATGGATCCAA TGTCATCGAACACC 250
qEIL1 TTGAACGACAGCCCTGAGTATG AGGTGTCCAGTTCTTCTTTGTTCG 172
qEIN2 GGGACGAACGGGCACTGCAGCA GTGATGAGGCAGACAGCGTTACT 190
WRKY70 CCTCATCGTCATCATGGTTCGTCC AGATAGATTCGAACATGAACTG 228
ACTIN TATTGTGGGTCGTCCTCG TCTCTCTGTTGGCCTTGG. 150
2 结果与分析
2.1 抗病相关信号基因的克隆
根据表 1 中引物和反应体系,以 cDNA 为模板,进行 PCR 扩增。对 PCR 扩增产物进行测序和
blast 分析,结果表明,获得的 PCR 扩增产物与目的基因具有 87%以上的相似性(表 4),因此获得
的基因片段可以用于后续相应信号基因的功能研究。
肖熙鸥,蒋 晶,陈 娜,雷建军,吕玲玲,曹必好.
茄子调控抗青枯病反应信号基因的筛选和鉴定.
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表 4 信号基因克隆分析
Table 4 Analysis of signal gene
信号途径
Signal pathway
目的基因
Gene
片段大小/bp
Fragment length
同源基因登录号
GenBank access No.
覆盖率/%
Query coverage
一致性/%
Identity
MAPK MKK2 637 NM_001247659.1 100 92
MAPK3 930 GU086227.1 71 92
MAPK4 602 NM_001246838.1 98 95
MAPK6 875 NM_001247731.1 93 91
SA PAD4 725 AY753546.1 95 87
TGA 778 GQ386946.1 100 94
NPR1 630 NM_001247633.1 99 93
SGT1 478 NM_001247758.1 97 91
GluA 1 456 AB017502.1 42 87
NDR1 604 AY438029 85 100
ET EIL1 910 NM_001247612.1 100 90
EIN2 568 AY566238 70 100
JA JAR1 870 DQ359730.1 25 94
WRKY70 630 AF421157 80 97
2.2 各信号基因在调控茄子青枯病抗性中的作用
为验证克隆的信号基因在调控茄子青枯病抗性中的作用,利用 VIGS 技术沉默抗青枯病茄子自
交系‘E31-1’相关基因,接种青枯菌 R. solanacearum 7 d 后调查植株的发病情况。
试验结果表明,空载 pTRV-2 与 pTRV-1 混合后接种的植株未出现萎蔫症状(图 1,o),即空载
pTRV-2 和 pTRV-1 未影响茄子对青枯病的抗性,因此可以利用 pTRV-1 和 pTRV-2 系统进行基因功能
的研究。
同时 qRT-PCR 结果表明,与对照植株相比,14 个目的基因在沉默植株中的表达量均表现为下
降趋势,其中 MAPK3、MAPK4、NPR1 和 WRKY70 等 4 个基因的表达量差异不显著(图 2)。
MAPK 级联途径中的 MKK2 和 MAPK6 在沉默处理后分别有 5 株和 4 株出现萎蔫现象(图 1,a、
d;表 5)。而 MAPK3 和 MAPK43 沉默植株未出现感病症状(图 1,b、c)。试验结果表明,MAPK
途径 MKK2 和 MAPK6 基因起着正调控作用,而 MAPK3 和 MAPK4 未发挥正调控作用。
SA 信号途径中 GluA、NPR1、TGA、SGT1、PAD4 等 5 个基因沉默后接种 R. solanacearum,7 d
后表现出枯萎症状(图 1,e、f、g、h、i)。GluA、NPR1、TGA、SGT1、PAD4 接种的 10 株材料中
分别有 5、6、5、7、6 株材料表现出不同程度的萎蔫症状(表 5),表明这 5 个基因在抗青枯病的过
程中起着正调控作用。
而 NDR1 沉默后,接种青枯病病原菌后植物不表现萎蔫症状(图 1,j),其可能未参与抗青枯
病调控过程。
ET 信号途径中的 EIN2、EIL1 和 JA 信号途径中的 JAR1 在基因沉默后接种 R. solanacearum,7 d
后植株均不表现出萎蔫症状(图 1,k、l、m)。因此推测其可能未参与茄子调控青枯病抗性的信号
途径。
WRKY 转录因子家族成员 WRKY70 沉默后接种 R. solanacearum,7 d 后 10 株沉默植株中 6 株叶
片出现了萎蔫症状(图 1,n;表 5),结果表明其在茄子对青枯病的抗性中起正调控作用。
Xiao Xi-ou,Jiang Jing,Chen Na,Lei Jian-jun,Lü Ling-ling,Cao Bi-hao.
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图 1 基因沉默后接种 Ralstonia solanacearum 后茄子的抗性检测
a ~ n 表示 VIGS 沉默植株。a:MKK2;b:MAPK3;c:MAPK4;d:MAPK6;e:GluA;f:NPR1;g:TGA;h:SGT1;
i:PAD4;j:NDR1;k:EIN2;l:JAR1;m:EIL1;n:WRKY70;o:pTRV-2 空载与 pTRV-1(对照)。
红色箭头指示叶片枯萎症状,植株被 GV3101 菌株浸染后 10 d,再接种 R. solanacearum 7 d 拍照记录。
Fig. 1 Identification of bacterial wilt-resistance of VIGS silenced eggplant after inoculation Ralstonia solanacearum
a–n showing the VIGS silenced eggplant plant. a:MKK2;b:MAPK3;c:MAPK6;d:MAPK6;e:GluA;f:NPR1;g:TGA;
h:SGT1;i:PAD4;j:NDR1;k:EIN2;l:JAR1;m:EIL1;n:WRKY70;o:pTRV-2 empty vector and pTRV-1.
The arrow indicated the wilting symptoms. Ten days after agroinfiltration,the silenced plants and the control plants
(those infiltratesd with pTRV-2 empty vector)were inoculated with R. solanacearum.
Photos were taken at 7 days after inoculation with R. solanacearum.
肖熙鸥,蒋 晶,陈 娜,雷建军,吕玲玲,曹必好.
茄子调控抗青枯病反应信号基因的筛选和鉴定.
园艺学报,2016,43 (7):1295–1304. 1301
图 2 各信号基因 qRT-PCR 表达检测
Fig. 2 Detection expression level of signal genes by qRT-PCR
表 5 目的基因沉默后植株发病情况
Table 5 Number of wilt eggplant of VIGS gene silenced plant
目的基因
Gene
接种幼苗
Number of inoculation seedling
萎蔫幼苗
Number of wilt seedling
目的基因
Gene
接种幼苗
Number of inoculation seedling
萎蔫幼苗
Number of wilt seedling
MKK2 10 5 MAPK3 10 0
MAPK4 10 0 MAPK6 10 4
NPR1 10 6 PAD4 10 6
TGA 10 5 EIL1 10 0
NDR1 10 0 EIN2 10 0
SGT1 10 7 WRKY70 10 6
GluA 10 5 JAR1 10 0
Xiao Xi-ou,Jiang Jing,Chen Na,Lei Jian-jun,Lü Ling-ling,Cao Bi-hao.
Identification key signal gene involved in eggplant bacterial wilt-resistance.
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3 讨论
3.1 MAPK 级联途径信号基因在茄子抗病中的作用
MAPK 级联途径包含多个基因,其参与多重植物防卫反应,如抗性相关激素的合成,活性氧的
产生,气孔的关闭,防卫基因表达,植物毒素的合成,细胞壁的加厚以及 HR 等反应(Meng & Zhang,
2013)。MKK2通过与MAPK4/MAPK6互作磷酸化而调控MAPK4/MAPK6的功能(Kong et al.,2012)。
其在不同植物—病原菌互作中的作用不一致,一些表现为负调控作用(Kong et al.,2012),而另外
一些表现为正调控作用(Andreasson et al.,2005;Brader et al.,2007;Qiu et al.,2008,Chen et al.,
2009),并且在这些反应中都与 MAPK4/6 互作(Andreasson et al.,2005;Brader et al.,2007;Qiu et
al.,2008)。
在本研究中,MAPK 级联途径中的 MKK2 与 MAKP6 正调控茄子青枯病抗性,而 MAPK3 与
MAPK4 可能未参与其调控或者起负调控作用。但是本试验中仅仅对 MAPK 级联途径中的 4 个基因
进行初步分析,其他家族基因在茄子调控青枯病抗性中的功能,以及这些蛋白是否存在互作有待进
一步分析。
3.2 SA 信号途径相关基因在青枯病抗性中的作用
SA 及 SA 信号途径在植物—R. solanacearum 的互作中起着重要的作用。植物受到 R.
solanacearum 的侵染后,其内源 SA 的含量显著升高,同时 SA 信号途径中的相关基因表达,传递抗
病信号,最终使植株产生抗性。基因芯片数据表明,马铃薯接种青枯病病原菌后,SA 途径相关基
因的表达量上升(Narancio et al.,2013)。番茄 SA 途径中 GluA 和 PR1-a 的表达量受到 R. solanacearum
的诱导(Xie & Wang,2012)。Deslandes 等(2002)从拟南芥抗青枯病材料 Nd-1 中克隆了隐性抗病
基因 RRS1-R,发现该基因调控青枯病抗性部分依赖于水杨酸信号调控途径,在调控网络中 NDR1
是关键基因之一。而茄科调控青枯病抗性的网络途径可能与拟南芥不同(Lin et al.,2008)。Chen
等(2009)的试验结果表明,SA 途径中的 NPR1、TGA2.2 以及 TGA1α 在番茄对青枯病的抗病过程
中起正调控作用。在早期研究中,茄子在接种 R. solanacearum 后 PAD4、NPR1 和 SGT1 等基因的表
达量上升,并且抗病材料的表达量明显高于感病材料,推测‘E-31’茄子对青枯病的抗性可能依赖
于 SA 途径(肖熙鸥 等,2012)。
本研究中利用 VIGS 试验证明 SA 信号途径中的 NPR1、TGA、SGT1、PAD4 等基因正调控茄子
对青枯病的抗性,而 NDR1 对抗性的影响不大。同时已有的研究表明,在 SA 信号途径中可能存在
两种信号传导途径,即依赖于 NPR1 和不依赖于 NPR1 的途径(Cao et al.,1998;Kachroo et al.,2000),
因此可以推断茄子对青枯病的抗性可能依赖于 NPR1 途径。
3.3 ET/JA 相关基因级联途径在青枯病抗性中的作用
ET/JA 信号传导在植物的抗性中起着协同作用(Kunkel & Brooks,2002)。目前关于 ET/JA 在
植物青枯病抗性中作用的报道较少。Hirsch 等(2002)报道 ET 信号途径中的关键基因 EIN2 在拟南
芥的抗性中起着负调控作用。而 ET 信号途径在番茄的青枯病抗性网络中起正调控作用(Chen et al.,
2009)。番茄接种 R. solanacearum 后,ET 相关信号基因 PR-1b 和 Osm 的表达量在感病和抗病材料
中存在差异(Milling et al.,2011)。CaERF5 能够提高番茄对青枯病的抗性,并且可能激活 SA 信号
途径的 NPR1(Lai et al.,2014)。
肖熙鸥,蒋 晶,陈 娜,雷建军,吕玲玲,曹必好.
茄子调控抗青枯病反应信号基因的筛选和鉴定.
园艺学报,2016,43 (7):1295–1304. 1303
前期研究表明,接种 R. solanacearum 后,ET 途径中的 EIN2 基因表达量在感病和抗病材料中变
化均不大(肖熙鸥 等,2012),并且通过 VIGS 沉默 EIN2 后,植株未表现出萎蔫症状,因此 EIN2
可能未参与调控茄子对青枯病的抗性。同时 EIL1 基因沉默后,植株未出现萎蔫症状,该结果与 Chen
等(2009)的试验结果不一致,原因可能是材料或者病原菌的差异。
本研究中虽然筛选到了一些正调控茄子对青枯病抗性的信号基因,但是这些基因是如何参与调
控茄子对青枯病的抗性,以及之间是否存在相互调节的过程,还有待深入研究。
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