全 文 ：园艺学报，2016，43 (6)：1117–1125.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0301；http：//www. ahs. ac. cn 1117
收稿日期：2016–04–21；修回日期：2016–06–06
基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（31501776）；江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20140752）；江苏省农业科学院基本
科研业务专项[ZX（15）4014]
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yinjm2006@sohu.com）
芋淀粉合成酶 AGPase 基因的克隆及表达分析
王 立，殷剑美*，韩晓勇，张培通，郭文琦，李春宏
（江苏省农业科学院经济作物研究所，南京 210014）
摘 要：通过对‘靖江香沙芋’转录组数据进行功能注释，克隆获得‘靖江香沙芋’淀粉合成酶
AGPase 的基因，序列全长为 1 596 bp，命名为 CeApS1（NCBI：Colocasia KU288757，未公布）。该基因
编码 532 个氨基酸，蛋白含有 1 个 NTP_transf_3 结构域（Gly104 ~ Pro306）和 1 个 PbH1 结构域（Gly473 ~
Ser515），编码产生 AGPase 小亚基，等电点和分子量分别为 6.73 和 57.6 kD。ApS1 在单子叶和双子叶植物
中广泛存在，CeApS1 与紫萍（AIZ00992.1）中相应蛋白的亲缘关系最近，相似性为 83.4%，与草莓
（AAS00541.1）、苜蓿（XP_003617925.1）、水稻（AAK27313.1）和小麦（CAA46879.1）等植物中相应
蛋白的亲缘关系较远。CeApS1 在‘靖江香沙芋’的母芋和子孙芋中表达量较高，在叶片、叶柄和根中低
表达。芋球茎中的 CeApS1 表达水平与球茎发育密切相关，在播种 160 d 后达到最大值。该基因的表达模
式与球茎淀粉含量的积累显著正相关。
关键词：芋；淀粉合成酶；基因克隆；表达分析
中图分类号：S 632.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）06-1117-09

Gene Cloning and Expression Analysis of ADP-glucose Pyrophosphorylase
in Colocasia esculenta
WANG Li，YIN Jian-mei*，HAN Xiao-yong，ZHANG Pei-tong，GUO Wen-qi，and LI Chun-hong
（Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）
Abstract：Based on the transcriptome data of Colocasia esculenta（L.）Schott，full-length cDNA of
ApS1（ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit 1）gene was cloned from‘Jingjiang Xiangsha Taro’，
which consisted of 1 596 bp and encoded a protein of 532 amino acids，and tentatively designated as
CeApS1（NCBI：Colocasia KU288757，unreleased）. CeApS1 contained a NTP_transf_3 domain（Gly104–
Pro306）and a PbH1 domain（Gly473–Ser515）. This gene encoded a small subunit of ADP-glucose
pyrophosphorylase，and isoelectric point and molecular weight were 6.73 and 57.6 kD，respectively.
Results displayed ApS1 existed in monocotyledons and dicotyledons. BlastX showed that ApS1 in
Colocasia esculenta shared 83.4% identity with Landoltia punctate，and showed farther phylogenetic
relationships with Fragaria ananassa（AAS00541.1），Medicago truncatula（XP_003617925.1），Oryza sativa
（AAK27313.1）and Triticum aestivum（CAA46879.1）. The CeApS1 transcript widely presented in the
main corm，lateral cormels，leaves，petioles and roots of Colocasia esculenta，and displayed higher


Wang Li，Yin Jian-mei，Han Xiao-yong，Zhang Pei-tong，Guo Wen-qi，Li Chun-hong.
Gene cloning and expression analysis of ADP-glucose pyrophosphorylase in Colocasia esculenta .
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expression levels in taro corms than those in leaves. The results indicated that there was a significantly
positive correlation between CeApS1 transcript expression and starch contents in taro corms.
Key words：Colocasia esculenta；starch synthase；gene cloning；expression analysis

芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]的球茎淀粉含量很高，可达干物质量的 70% ~ 80%，其淀粉
颗粒较小，直径一般小于 5 μm（Agama-Acevedo et al.，2011），且易于消化，具有较好的食疗保健
功能。芋的淀粉在食品工业中的用途也很广泛（曹新志 等，2012）。
淀粉的生物合成过程十分复杂，参与淀粉合成代谢的酶主要有 5 大类：ADP–葡萄糖焦磷酸化
酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）、颗粒结合淀粉合成酶（granule binding starch synthase，
GBSS）、可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SSS）、淀粉分支酶（starch branching enzyme，
SBE）和脱分支酶（debranching enzyme，DBE）（Carciofi et al.，2012；Abe et al.，2014）。虽然参与
淀粉合成的主要基因已经被陆续发现，但是关于这些基因在淀粉合成途径中的功能还存在着争议
（Nakamura et al.，1996；Carciofi et al.，2012）。随着基因组和转录组测序成本的降低和生物信息学
技术的发展，关于植物淀粉生物合成途径的研究也在不断深入和完善。目前关于淀粉形成机制的研
究主要集中于拟南芥、水稻、小麦等植物，其中关于水稻淀粉合成途径的研究比较清楚（Carciofi et
al.，2012；Teng et al.，2012；Abe et al.，2014）。但是在块茎类植物，尤其是芋中，在淀粉合成途
径方面还缺乏相关研究，关于芋淀粉合成酶 AGPase 类基因的分子研究未见报道。
AGPase 是淀粉合成过程涉及的第 1 个酶，也是其中的限速酶，其活性直接影响淀粉合成的速率
（Parada & Aguilera，2011）。AGPase 在植物中广泛存在，在水稻中共检测到 7 个编码 AGPase 的基
因，在马铃薯和甘薯中也存在着类似的基因（Nakata et al.，1994；Akihiro et al.，2005；Zheng et al.，
2015）。Song 等（2005）将 AGPase 基因导入马铃薯，明确了该基因能提高马铃薯块茎淀粉含量。
Li 等（2011）发现 AGPase 的过量表达可以提高玉米籽粒的淀粉含量。
本研究中以‘靖江香沙芋’为材料，该材料于 2014 年在 Illumina Hiseq2000 平台上完成转录组
测序工作，共获得 54 180 410 个 Clean Reads，组装后总长为 54 242 914 nt，平均长度为 823 nt；检
测到 65 878 个 Unigene，平均序列长度为 823 bp。在此基础上，通过对‘靖江香沙芋’转录组数据
进行功能注释，克隆获得芋淀粉合成酶 AGPase 的基因全长序列，对其基因序列结构和系统进化进
行了分析；通过检测该基因在芋不同组织和不同发育时期的表达水平，分析了基因表达模式与淀粉
含量积累的相关性，为芋淀粉形成机制的研究提供理论基础，进而为芋淀粉资源的充分开发利用提
供保障。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为本课题组保存的‘靖江香沙芋’，2015 年 4 月种植于江苏省农业科学院六合动物科
学基地。根据芋生长时期，分别于播种后 40、70、100、130、160 和 190 d 进行地上部和地下部取
样。地上部分为叶片和叶柄，分别采用打孔和切段取样；地下部分为球茎（母芋、子孙芋）和根，
母芋和子孙芋去皮后切片，根洗净后取样。每次取样约 2 g，立即用液氮速冻，3 次重复。最后将速
冻样品放置于–80 ℃冰箱贮存。
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1.2 RNA 提取与 cDNA 合成
采用 Tiangen（北京）公司的植物 RNA 提取试剂盒，分别从播种后不同时期的叶片和球茎以及
播种后 130 d 的各组织样品中提取总 RNA，提取方法参照试剂盒说明书。采用 PrimeScript RT reagent
Kit 将提取的总 RNA 反转录成 cDNA 第 1 链。cDNA 合成反应参照 Tiangen（大连）公司的 RNA PCR
Kit（AMV）试剂盒说明书进行。
1.3 CeApS1 基因克隆
以芋叶片 cDNA 为模板，根据本课题组芋转录组测序获得的 Unigene 数据，通过 blastX 方法在
蛋白数据库 NR、Swiss-Prot、KEGG 和 COG 中比对获得芋 AGPase 的基因序列信息，设计特异克隆
引物 ApS1-F（5′-ATGGCGATGGCGGCAGCGAGG-3′）和 ApS1-R（5′-GATCCCGAGTGGAACTG
TCATC-3′）。
PCR 扩增反应体系为 20.0 μL。10 × PCR Buffer（不含 Mg2+）2.0 μL，MgCl2（25 mmol · L-1）
2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol · L -1）2.0 μL，上下游引物（10 μmol · L -1）各 1.0 μL，Ex Taq 酶（5 U · μL-1）
0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 补至 20.0 μL。PCR 反应 35 个循环，程序如下：94 ℃预变性 5 min，
每循环 94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1.5 min；最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。
扩增产物在 1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测。目的片段回收后，连接到 pMD18-T 载体上，然后转化大
肠杆菌感受态细胞 DH5α，涂布在含 100 mg · L -1 Kan 的 LB 平板上。挑取单克隆，以克隆引物 ApS1-F
和 ApS1-R 进行 PCR 阳性检测，将阳性克隆送到北京鼎国科技公司测序。
1.4 序列分析
相似性比较在 NCBI 站点上用 BLAST 完成，开放阅读框在 NCBI 站点上用 ORF finder 分析，氨
基酸序列的同源性比较采用 DNAman 完成。蛋白结构域通过 ExPASy（http：//www.expasy.org/prosite/）
和 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/job）在线数据库进行预测分析。利用 Clustal X2
软件进行序列相似性分析，MEGA v4.0 软件构建系统进化树，等电点和分子量通过 ExPaSy website
（http：// web.expasy.org/compute_pi/）计算。
1.5 基因表达分析
使用 BEACON DESIGNER 软件（PREMIER）设计荧光定量引物，选择 Actin 作为内参基因
（Actin-F：5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′，Actin-R：5′-GACACACCGTCACCAGAGTC-3′），
与目标基因一起扩增（ApS2-F：5′-TTGTGTGGTTGGTTTACGCT-3′，ApS2-R：5′-GTGTGTGTTCT
TCCCAATGC-3′）。
采用 ABI 7500 Real-Time PCR System 和 7500 System software version 1.2.3 检测基因表达水平。
定量 RT-PCR 使用 SYBR Premix Ex Taq Kit，操作按照试剂盒说明书进行，反应体系 20 µL。定量
RT-PCR 反应 40 个循环，程序如下：95 ℃ 30 s，每循环 95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，最后 95 ℃ 15 s，
60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，每个样品设置 3 次重复。采用参照基因的 ΔΔCT 法计算相对表达量（Livak
& Schmittgen，2001）。
1.6 淀粉提取和含量测定
取芋球茎 0.1 g，用 5 mL 80%乙醇研磨离心后，分别用 5 mL 蒸馏水和 5 mL 80%乙醇悬浮 1 次，
沸水浴 10 min，4 000 r · min -1 离心 4 min，上清液用 80% Ca(NO3)2 提取 2 次，合并后定容至 20 mL，
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测定淀粉含量。按照徐昌杰等（1998）的方法制作淀粉标准溶液的标准曲线，得到吸光值 A 与淀粉
标准溶液浓度（C，μg · mL -1）之间的回归方程：C = 0.0061A + 0.0163，R2 = 0.9966。以 1 mL 提取
液代替淀粉标准溶液进行测定，根据回归方程计算提取液的 C 值。样品中淀粉含量（mg · g-1FW）=
10 × C × V/M/1 000。10 为测定时提取液的稀释倍数，C 为测定样品液中淀粉浓度（μg · mL-1），V
为样品最后定容体积（mL），M 为样品鲜样质量（g）。
2 结果与分析
2.1 CeApS1 基因全长克隆
以叶片 cDNA 为模板，克隆获得的 ApS1 序列全长为 1 596 bp，命名为 CeApS1（登录号为：
Colocasia KU288757，未公布）。通过 NCBI 站点的 ORF finder 查找分析，CeApS1 的 cDNA 序列包含
1 个完整的开放阅读框（1 596 bp），编码 532 个氨基酸（图 1）。根据 ExPASy 在线数据库分析，该
蛋白含有 1 个 NTP_transf_3 结构域（Gly104 ~ Pro306）和 1 个 PbH1 结构域（Gly473 ~ Ser515）。序列结
构显示 CeApS1 编码 AGPase 小亚基，等电点和分子量分别为 6.73 和 57.6 kD。






















图 1 CeApS1 基因全长序列及编码氨基酸序列
Fig. 1 Full-length cDNA sequence and amino acid sequence of CeApS1
2.2 CeApS1 的系统进化分析
系统进化结果表明，ApS1 在单子叶和双子叶植物中普遍存在，具有较强的保守性（图 2）。其
中，芋的 CeApS1 与紫萍（AIZ00992.1）相应蛋白的亲缘关系最近，相似性为 83.4%，其次是莲
（AHZ08828.1），相似性为 82.6%；与草莓（AAS00541.1）、苜蓿（XP_003617925.1）、水稻
（AAK27313.1）和小麦（CAA46879.1）等相应蛋白的亲缘关系较远，相似性分别为 78.4%、77.0%、
73.4%和 71.7%（图 2，图 3）。
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图 2 不同植物 ApS1 氨基酸序列同源性比较
黑色实线方框：催化位点基序；黑色虚线方框：变构位点基序；星形：调控位点；三角形：ATP 结合位点。
Fig. 2 Alignment of predicted amino acid sequences of ApS1 from different plants
Black box indicates the catalysis regulation motif；Black dotted line indicates the allosteric regulation motif；
Stars indicate enzyme regulatory sites；Triangles indicate ATP binding sites.
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图 3 不同植物 AGPase 氨基酸序列的系统进化分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequences of AGPase in different species
2.3 CeApS1 的表达水平分析
荧光定量 PCR 结果显示，CeApS1 基因在‘靖江香沙芋’各组织中均能表达，播种后 130 d 在
母芋和子孙芋中的表达水平较高，在叶柄和根中低表达（图 4，A）。整个发育过程中，叶片中 CeApS1
的表达水平基本稳定，而球茎（母芋和子孙芋）中的表达水平始终高于叶片。播种后 70 d，球茎中
的表达量开始增加，在 100 d 后与叶片的基因表达水平出现较大差异，播种后 160 d CeApS1 的基因
表达水平最高，随后缓慢下降（图 4，B）。

图 4 CeApS1 的表达分析
不同小写字母分别表示不同组织（A）和同一组织不同时期（B）差异显著（P < 0.05）。
Fig. 4 Expression analysis of CeApS1 transcript
Different lowercase letters indicate significant differences（P < 0.05）among tissues（A）
and stages in the same tissue（B），respectively.
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2.4 CeApS1 表达与芋球茎淀粉含量相关性分析
芋球茎淀粉含量在生长初期出现下降，播种后 70 d 淀粉含量最低，随后开始增加，在播种后
160 ~ 190 d 达到较大值（图 5）。
相关性分析结果显示，芋球茎 CeApS1 表达水平与淀粉含量显著正相关（相关系数为 0.835）。

图 5 不同发育时期芋球茎淀粉含量变化
不同小写字母表示差异显著（P < 0.05）。
Fig. 5 Starch contents in corms of Colocasia esculenta at different development stages
Different lowercase letters indicate significant differences（P < 0.05）among stages in corms.
3 讨论
在淀粉合成过程中，AGPase 发生变构，将 G1P 中的葡萄糖残基转移到 ATP 上，形成焦磷酸（PPi）
和腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG），为淀粉的生物合成提供最初葡萄糖供体（Ballicora et al.，2004）。
AGPase 变构效应会被 3–磷酸甘油酯 3-PGA 激活，受到无机磷酸盐的抑制（Sivak & Preiss，1998）。
其中的催化和变构效应主要由保守的 GGXGXRL 基序和 PAV 基序调控（Wang & Messing，2012）。
高等植物中的 AGPase 是 1 个具有 α2β2 结构的异四聚体，由 2 种类型相近的大小亚基组成
（Ballicora et al.，2004）。研究显示 AGPase 的催化和调节功能是在各个亚基的协同作用下完成的
（Ventriglia et al.，2007）。Georgelis 等（2009）发现被子植物中 AGPase 的小亚基受到的进化压力
更大，因此与大亚基相比，AGPase 小亚基更加保守，表现为具有更多的组织特异性，因而能与多
种大亚基发生互作。Crevillen 等（2003）研究显示拟南芥中的 4 种 AGPase 由 4 种类型的大亚基组
成，而小亚基只有 1 种类型。
本研究中从‘靖江香沙芋’中克隆获得了 CeApS1 基因，编码产生 1 个 AGPase 小亚基，具有典
型的 NTP_transf_3 结构域和 PbH1 结构域。系统进化结果显示，芋 CeApS1 与紫萍中相应蛋白
（AIZ00992.1）的亲缘关系最近。芋和紫萍同属天南星科，其中芋属于天南星科芋属，紫萍属于天
南星科浮萍亚科紫萍属（Huang et al.，2015），说明 AGPase 小亚基在同科植物的进化过程中趋于保
守。而‘靖江香沙芋’中的 ApS1 与莲、唐菖蒲等单子叶植物中相应蛋白的相似性在 80%以上，也
说明 AGPase 小亚基具有较高保守性（Crevillen et al.，2003）。但是，系统进化显示，CeApS1 蛋白
与魔芋中相应蛋白（AEH27531.1）的亲缘关系较远，这可能是由于魔芋的 AEH27531.1 蛋白属于
AGPase 大亚基，而 AGPase 大亚基与小亚基在进化过程中的复制次数不同，因此两者在氨基酸序列
和蛋白结构上存在较大差异（Georgelis et al.，2009）。
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荧光定量分析显示，CeApS1 在母芋、子孙芋、叶片、叶柄和根中均有表达，但表达量相对集中
在地下球茎和叶片中。Siedlecka 等（2003）研究显示 AGPase 小亚基基因的启动子转入拟南芥后，
能在叶片、茎、花和根等部位诱导 GUS 基因表达，显示出 AGPase 小亚基基因具有广泛的表达性。
与叶片相比，芋球茎中的 CeApS1 在播种 100 d 后表达量显著提高，仅在收获前缓慢下降，与之对应
的，芋球茎中的淀粉含量在播种 100 d 后开始增加，在播种 160 d 后达到较大值，随后增速减缓。
相关性分析结果也显示，芋球茎中 CeApS1 基因表达水平与同样部位的淀粉含量呈正相关。在马铃
薯中也发现了类似的结果（Nakata et al.，1994）。芋生长前期（40 ~ 70 d）球茎淀粉含量缓慢下降，
可能是由于铲除边荷造成的。边荷过多会消耗土壤养分，导致芋减产，因此一般会在播种后 70 d 左
右铲除大部分边荷。由于淀粉合成与光合作用密切相关，铲除边荷后导致有效功能叶减少，降低了
光合产物合成效率，进而影响了芋球茎的淀粉积累，而球茎中 CeApS1 的基因表达没有受到影响。
本研究中克隆获得了编码芋 AGPase 小亚基的 CeApS1 基因，明确了该基因在系统进化中的地位
和表达模式，为芋淀粉形成机制的研究提供了理论基础。但是，考虑到淀粉合成酶 AGPase 的结构
组成和进化保守性，芋中应该还存在着多种类型的 AGPase 大亚基，因此还需要对芋淀粉合成酶
AGPase 进行深入研究，以便更好地开发利用芋的淀粉资源。

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关于申报 2016 年度华耐园艺科技奖的通知
华耐园艺科技奖由中国园艺学会和北京华耐农业发展有限公司联合设立，经科技部国家科学技术奖励工作办公
室批准，对在国内园艺科技领域做出突出贡献的科研成果进行奖励，由中国园艺学会具体承办。2016 年度华耐园艺
科技奖开始申报，现将有关事项通知如下：
一、奖励范围：华耐园艺科技奖是奖励在全国园艺作物的种质资源、育种、生物技术、栽培、病虫害防治、贮
藏加工等科学研究，以及技术推广中取得突出成绩的科研成果。
二、申报条件：1. 属于华耐园艺科技奖奖励范围的科研成果。2. 不存在成果权属、完成单位、完成人等方面的
争议。3. 尚未获得国家、省部级科技奖励的科研成果。
三、评审标准：1. 华耐园艺科技特等奖：在基础性研究、应用基础研究或应用研究成果方面有重大发明或重大
发现，具有很强的创新性，总体水平达到国内领先、国际先进，并获得国内外社会公认，研究成果对推动行业科技
进步有非常显著的作用，并取得了显著的经济效益和社会效益。2. 华耐园艺科技奖：在基础性研究、应用基础研究
或应用研究成果方面具有较强的创新性，总体技术水平达到国内先进并得到国内同行公认，其成果取得了较大的经济
效益和社会效益。
四、奖励名额及奖金：华耐园艺科技奖每两年评选 1 次。本次奖励指标果树、蔬菜专业各 6 项，西甜瓜和观赏
园艺专业各 2 项。其中，华耐园艺科技特等奖 2 项，每项奖金 10 万元；华耐园艺科技奖 14 项，每项奖金 5 万元。
五、申报要求：1. 为了能有更多的成果申报，在原来自由申报的基础上增加了推荐申报。自由申报是由成果主
持完成单位直接向学会申报；推荐申报是由省级园艺学会（或省级果树、蔬菜、花卉学会等），以及中国园艺学会正
式批准成立的分会推荐申报。省级学会推荐的范围限于本省，每省推荐名额不超过两项。分会推荐的范围限于本学
科，每个分会推荐名额不超过两项。所有申报均须填写“华耐园艺科技奖申请表”，并提供相关的证明材料。2. 申
报截止时间 2016 年 8 月 10 日（以邮戳为准），过期不予受理。
详情请查询中国园艺学会网站：http：//cshs.org.cn
中国园艺学会
通 知