全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（1）：157–164 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–07–17；修回日期：2013–12–20
基金项目：国家自然科学基金项目（31070620）；洛阳市科技攻关项目（1102061A）；河南省高校科技创新人才支持计划项目
（13HASTIT004）；河南省重点科技攻关项目（132102110029）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hkdhxg@126.com）
牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列的克隆及分
析
宋程威 1，郭大龙 2,3，张 曦 1，郭丽丽 1,3，侯小改 1,3,*
（1 河南科技大学农学院，河南洛阳 471003；2 河南科技大学林学院，河南洛阳 471003；3 河南省高校牡丹工程技术
中心，河南洛阳 471003）
摘 要：利用 LINE 简并引物从中原牡丹品种‘洛阳红’中扩增出 580 bp 左右的目的条带，对其回
收、克隆、测序及相关生物信息学软件分析后获得 32 条 LINE 类牡丹反转录转座子 RT（反转录酶）序列。
这些序列长度为 547 ~ 593 bp，主要表现为点突变，经 Clustal W 比对其同源性为 25.7% ~ 94.2%。将其核
苷酸序列经聚类后可分为 4 个家族，其中家族Ⅰ和 Ⅲ 分别占总序列数的 50%和 28%。将 32 条 RT 序列翻
译成氨基酸序列，在第 18 氨基酸序列处有 1 个非常保守的的甘氨酸（Gly），在 138 氨基酸序列处有 1 个
半保守的赖氨酸（Lys）位点。32 条序列均发生较多的终止密码子突变和移码突变。与其他物种的系统进
化树分析，表明牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列既有一定的保守性，同时也与其他物种间存在一定的
同源性。
关键词：牡丹；非 LTR 类反转录转座子；反转录酶
中图分类号：S 685.11 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）01-0157-08

Cloning and Analysis of Reverse Transcriptase of LINE-retrotransposons
of Tree Peony（Paeonia）
SONG Cheng-wei1，GUO Da-long2,3，ZHANG Xi1，GUO Li-li1,3，and HOU Xiao-gai1,3,*
（1College of Agriculture，Henan University of Science & Technology，Luoyang，Henan 471003，China；2College of
Forestry，Henan University of Science & Technology，Luoyang，Henan 471003，China；3Engineering Technology Research
Center of Tree Peony of Henan Province University，Luoyang，Henan 471003，China）
Abstract：A fragment of 580 bp was amplified by PCR from the genomic DNA of tree peony
（Paeonia suffruticosa Andrews.‘Luoyanghong’）using the degenerate oligoncleotide primers. The
amplicons were recovered，purified and cloned. Positive clones were identified and sequenced. Finally，
32 different sequences of reverse transcriptase from tree peony‘Luoyanghong’LINE retrotransposons
were obtained. The length of the nucleotide sequences varied from 547 to 593 bp. The homology ranged
from 25.7% to 94.2% by Clustal W and the variations were characterized by point mutation. Four clusters
were identified with high heterogeneity through phylogenic analysis of their nucleotide sequences. Family
Ⅰand Ⅲ，respectively accounted for 50% and 28% of the total number of clones. There is a very

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conservative point in the 18th amino acid sequence of glycine（Gly）in the translated sequence，at the same
time，a conservative point in 138th amino acid sequence of lysine（Lys）. More termination codon mutation
and frameshift mutations were presented in 32 sequences. A phylogenic tree was constructed based on the
amino acid sequences from other species， indicating that the RT sequences from Peony LINE
retrotransposons have certain homology with other species.
Key words：tree peony；non-LTR retrotranspson；reverse transcriptase

牡丹组植物具有丰富的种质资源，近年来不同研究者采用形态学、细胞学和分子生物学等手段
已对牡丹种质资源遗传多样性进行了分析（刘萍 等，2006；Zhang et al.，2009）。牡丹的花色、花
型各异（张晶晶 等，2006；Shu et al.，2012），但对于这些性状形成机制的研究并不多。前人的研
究表明，反转录转座子在葡萄果皮颜色形成（Carrier et al.，2012）和菜豆花色的形成（Erdmann et al.，
2002）等方面发挥着至关重要的作用。
根据反转录转座子结构特点可分为 LTR 和非 LTR 两类，LTR 反转录转座子包括 Tyl-copia 和
Ty3-gypsy 两个亚家族，非 LTR 类包括 LINEs（the long interspersed nuclear elements）和 SINEs（short
interspersed nuclear elements）两个亚家族（Pritham & Feschotte，2007；Pagan et al.，2010）。关于
LTR 类反转录转座子在植物方面的研究已比较多，牡丹方面的研究也有报道（侯小改 等，2013），
非 LTR 类反转录转座子也已在部分植物中进行研究，并且开发出不同的分子标记技术（Hill et al.，
2005；Kalendar et al.，2010；Martin，2010； Seibt et al.，2012）。而牡丹 LINE 类反转录转座子的
RT 序列的分离尚未见报道。
本研究中利用简并引物，采用 PCR 方法从中原牡丹‘洛阳红’基因组 DNA 中分离得到反转录
转座子 LINE 部分反转录酶（reverse transcriptase，RT）序列，并利用 DNAman 和 DNAstar 等软件
对这些序列进行分析，研究其序列变化特点，以期为牡丹基因组进化和种质资源研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料及 DNA 提取和 RT 序列扩增
试验材料为中原牡丹品种‘洛阳红’幼叶，于 2012 年 3 月份取自中国洛阳国家牡丹基因库。
采用 CTAB 法提取牡丹‘洛阳红’基因组 DNA。参照 Hill 等（2005）扩增 RT 序列的引物。引
物序列为 DVO144：5′-GGGATCCNGGNCCNGAYGG NWT-3′；10712：5′-SWNARNGGRTCNCCY
TG-3′，其中：R = A/G，Y = C/T，S = C/G，W = A/T，N = A/C/G/T。PCR 反应体系为：2.0 mmol · L-1
Mg2+，1× PCR buffer（TaKaRa），87.5 μmol · L-1 dNTPs，0.8 μmol · L-1 引物（DVO144 和 10712），
2.0 mg · L-1 模板 DNA，1.0 U Taq 酶（TaKaRa），灭菌双蒸水补足至 20 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃
5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min；35 个循环；最后 72 ℃ 8 min。
1.2 PCR 产物的回收、克隆及转化
用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并用 BioTeke 胶回收试剂盒回收纯化 PCR 产物。回收
产物连接于 pMD-18T 载体上，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞、涂板、摇菌培养后，挑取克隆菌，
提取质粒，阳性质粒送北京英潍捷基生物技术有限公司测序。
1.3 RT 序列分析
测序后得到序列经 DNAman 和 DNAstar 软件进行进一步分析，用 MEGA5.0 软件邻接法构建系
统发育进化树（侯小改 等，2012）。
1 期 宋程威等：牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列的克隆及分析 159

图 1 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 序列的 PCR 扩增
Fig. 1 The PCR-amplified of reverse transcriptase of
LINE-retrotransposons in tree peony
2 结果与分析
2.1 牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列的分离
利用引物在‘洛阳红’中扩增检测到 LINE 类
反转录转座子 RT 序列，长度约为 580 bp（图 1）。
将扩增得到的片段回收纯化，克隆测序后，共
得到 60 条序列。经 DNAman 和 DNAstar 等软件分
析，去除重复及过短序列，得到 32 条不同序列，依
次 命 名 为 PTLRT01 ~ PTLRT32 ， 并 提 交 到
GenBank，登录号为 KC454401 ~ KC454432。
2.2 牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列同源性
将获得的 32 条序列与 NCBI 数据库进行序列比对，结果显示它们与已报道的其他植物的 LINE
类反转录转座子的反转录酶序列有很高的同源性，说明本研究中克隆到了牡丹 LINE 类反转录转座
子的反转录酶序列。经 DNAMAN 软件对这些序列分析，其富含碱基 AT，AT 与 GC 的比例为 1.09 ~
1.81，其核苷酸序列长度为 547 ~ 593 bp，其中序列 PTLRT23 长 547 bp，PTLRT18 长 593 bp，其余
序列集中在 571 ~ 583 bp。从表 1 可以看出牡丹反转录酶序列间同源性范围为 25.7% ~ 94.2%，其中
序列 PTLRT09 与 PTLRT20 的同源性最高，为 94.2%，序列 PTLRT04 与 PTLRT30、PTLRT05 与
PTLRT15 的同源性最低，仅为 25.7%。由此得出，同一简并引物获得的反转录转座子反转录酶序列
并不相同，其在序列长度、序列同源性、碱基变化上存在多态性（Ungerer et al.，2009）。这与在甜
菜中的研究结果比较一致，同样表明即使来自同一物种的同一反转录转座子的 RT 序列仍具有较高
的异质性（Kubis et al.，1998；Noma et al.，1999）。

表 1 牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列同源性比较
Table 1 The comparison of reverse transcriptase of LINE-retrotransposons of tree peony
PTLRT 序列号
No. 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11
PTLRT 12 44.6 45.6 31.6 34.9 37.1 29.4 38.6 35.1 42.7 32.5 26.0 34.4 33.6 33.4 34.9 31.3 34.9 46.8 67.3 33.0 30.1 36.1 33.6 30.5 32.9 31.3 33.4 43.7 34.6 31.7 32.9
PTLRT 13 48.4 35.3 37.9 30.6 29.8 40.8 47.5 39.0 49.4 31.1 38.9 42.5 41.2 46.5 31.9 38.3 37.8 44.7 45.5 31.7 35.1 40.0 31.7 41.3 38.3 41.5 40.9 47.9 37.7 38.4
PTLRT 14 35.9 31.5 31.3 31.5 46.8 33.2 43.2 33.2 28.0 29.8 28.9 27.2 31.3 29.8 31.2 44.3 44.6 30.8 28.6 33.3 28.9 26.5 29.4 28.7 25.8 40.1 32.2 29.3 32.0
PTLRT 15 28.4 32.7 30.7 47.4 31.0 34.3 31.2 32.0 27.9 28.1 27.8 31.2 32.6 28.8 30.5 29.5 28.8 34.3 32.6 25.9 29.7 25.7 27.9 27.9 33.1 30.9 28.4 28.6
PTLRT 16 39.3 40.1 32.4 49.7 32.8 49.2 30.0 69.5 45.3 47.7 52.3 45.5 94.5 28.4 32.5 49.4 37.8 38.7 47.3 33.3 46.1 72.6 49.4 31.8 51.1 72.7 66.0
PTLRT 17 40.8 33.2 39.8 30.6 39.6 29.4 43.9 37.7 36.7 37.4 40.7 39.4 32.0 29.4 36.0 43.2 37.0 36.3 33.6 36.0 39.4 37.9 29.9 39.8 39.8 41.2
PTLRT 18 30.5 34.6 31.4 36.5 31.4 44.4 34.3 35.3 38.9 43.3 41.0 27.5 30.1 36.9 39.0 37.3 35.2 31.5 34.8 40.7 36.2 31.1 34.8 41.2 41.7
PTLRT 19 34.6 40.1 32.0 29.3 33.4 29.9 27.2 30.8 29.3 33.0 37.0 35.6 31.3 30.8 38.7 27.4 27.5 27.2 31.7 26.2 41.0 34.6 31.5 32.4
PTLRT 20 30.8 75.5 30.2 50.6 56.9 54.4 65.4 41.0 49.1 31.5 32.8 61.7 36.9 38.9 56.1 31.9 56.6 51.8 55.4 31.1 94.2 52.0 49.1
PTLRT 21 31.8 27.8 33.8 29.7 29.9 30.8 28.7 33.0 35.9 45.9 29.4 31.5 31.9 29.0 28.5 29.9 30.6 30.2 71.5 30.6 30.2 35.7
PTLRT 22 31.3 49.6 56.1 55.2 61.6 41.5 48.4 29.9 30.2 60.9 36.9 36.6 54.0 32.9 57.1 49.4 56.6 30.6 76.3 49.9 47.0
PTLRT 23 30.3 28.0 29.3 30.7 28.9 29.4 26.3 26.1 32.2 30.0 26.9 29.3 30.3 28.5 31.1 29.6 26.3 29.6 31.4 30.5
PTLRT 24 44.3 46.8 52.1 46.1 69.3 31.3 33.5 49.2 39.0 40.8 46.7 33.3 44.3 64.8 47.9 33.8 50.8 65.0 70.2
PTLRT 25 65.0 55.4 36.7 45.3 32.2 32.5 53.3 37.3 34.5 66.2 29.8 67.2 44.6 65.5 29.2 58.0 44.6 44.8
PTLRT 26 54.7 40.0 48.0 29.2 32.3 54.7 36.4 35.6 74.4 32.8 72.6 49.9 93.0 28.9 55.2 47.9 46.1
PTLRT 27 39.6 51.6 30.6 32.1 80.4 39.4 35.8 55.7 35.5 56.3 50.3 57.1 30.4 65.9 49.7 48.7
PTLRT 28 45.5 29.8 31.8 37.9 37.6 35.8 37.4 32.3 37.9 45.8 40.3 28.7 72.2 44.6 44.9
PTLRT 29 28.9 32.8 49.9 36.8 37.3 46.5 32.2 47.3 72.7 49.2 32.0 50.4 72.2 67.4
PTLRT 30 52.9 29.6 30.5 32.6 29.9 25.7 29.1 28.5 29.8 38.5 32.0 29.4 29.2
PTLRT 31 30.4 30.3 33.5 31.8 28.2 31.3 30.8 33.3 49.0 32.1 31.3 31.3
PTLRT 32 38.5 36.8 53.3 32.4 54.7 49.6 57.1 29.4 63.5 49.6 49.2
PTLRT 01 36.9 35.5 30.1 34.3 35.9 36.1 29.5 31.9 35.5 36.1
PTLRT 02 36.8 32.1 34.5 36.5 35.8 34.0 39.4 36.3 38.2
PTLRT 03 30.5 80.1 46.8 74.4 27.7 56.4 44.9 46.5
PTLRT 04 31.0 30.4 32.2 27.5 32.4 30.2 31.2
PTLRT 05 46.3 73.8 27.5 57.3 44.9 46.5
PTLRT 06 51.5 28.0 52.3 92.3 66.7
PTLRT 07 29.2 55.9 50.3 47.0
PTLRT 08 31.6 28.5 34.9
PTLRT 09 51.6 50.8
PTLRT 10 66.4
PTLRT 11
160 园 艺 学 报 41 卷
2.3 牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列聚类分析
利用 DNAstar 对分离得到的 32 条 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 序列进行聚类分析，构建牡丹
中 LINE 类反转录转座子 RT 序列的系统发育进化树，从而明确所获得的 LINE 类牡丹反转录转座子
RT 序列间的相互关系。
经 Clustal W 比对后将这 32 条 RT 序列分成了Ⅰ~Ⅴ4 组，每组代表遗传距离比较近的遗传家族。
Ⅳ家族只含有 1 条序列 PTLRT18，其序列长度为 593 bp，与其余家族的遗传距离较大，这可能是由
于核苷酸序列间碱基的缺失突变造成的。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ家族分别有 16、6 和 9 条序列，其中家族Ⅰ和
家族Ⅲ分别占所分离出总序列数的 50%和 28%，这 2 个家族是克隆所得到的牡丹 LINE 类反转录转
座子 RT 序列的主要成分。家族Ⅰ中 16 条序列的相似性为 71.55%，核苷酸序列长度比较一致，同
时表现出一定程度上的碱基替换、点突变和缺失突变导致的差异性。另外家族Ⅰ可以分为两个亚家
族，两个亚家族的一致性分别为 78.16%和 82.87%，这可能是两个亚家族在进化过程中由一类反转
录转座子发生突变等造成。家族Ⅱ的 6 条序列的一致性为 77.89%，其中表现的有碱基替换、点突变
和缺失突变。家族Ⅲ的 9 条序列的一致性为 78.16%，同样表现的有碱基替换、点突变和缺失突变。
可见碱基替换、点突变或缺失突变都可能是同一家族的反转录转座子产生多拷贝群的原因（Wang et
al.，2010）。

图 2 牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列聚类
Fig. 2 The cluster results of reverse transcriptase of LINE-retrotransposons of tree peony

2.4 牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 氨基酸序列分析
将得到的 32 条 RT 序列翻译成氨基酸序列（图 3），在第 18 氨基酸序列处有 1 个共同的甘氨酸
（Gly），推测此氨基酸位点可能是 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 序列中 1 个非常保守的位点，另外
在第 138 位点处也表现出 1 个半保守的赖氨酸位点（Lys）。32 条序列发生终止密码子突变的频率较
1 期 宋程威等：牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列的克隆及分析 161

高，其中 PTLRT03、PTLRT19 和 PTLRT27 有 5 个，PTLRT07、PTLRT22 和 PTLRT26 有 6 个，PTLRT14
和 PTLRT32 有 7 个终止密码子突变位点，其余均有 9 个及以上突变位点，因此推断，氨基酸点突变
和终止密码子突变可能是导致牡丹反转录转座子 LINE 异质性的重要原因。另外，此 32 条序列表现
出很高的不保守性，发生了大量的移码突变，表明移码突变也是导致牡丹反转录转座子 LINE 异质
性的主要原因之一。


图 3 牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 氨基酸序列比较
Fig. 3 The comparison of amino acid sequence of reverse transcriptase of LINE-retrotransposons of tree peony
162 园 艺 学 报 41 卷
2.5 系统进化树分析
将本研究中从牡丹中克隆的 32 条 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 序列，与从 GenBank 中搜索已
登录的不同生物来源的反转录转座子 LINE 中 RT 的氨基酸序列进行比较，并构建系统进化树（图 4），
进行分析。克隆得到的牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列聚类比较集中，其中家族Ⅰ、Ⅲ 和 Ⅳ 全
为 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 序列，其中 75%的牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列聚类在家族
Ⅰ中，表明 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 序列具有较高的同源性；同样，与拟南芥（Arabidopsis
thaliana）和鹿子百合（Lilium speciosum）遗传距离较远，具有一定的保守性。PTLRT14、PTLRT19
和 PTLRT30 此 3 条牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列与洋葱（Allium cepa）、白花甜菜（Beta
lomatogona）、蚕豆（Vicia faba）、金鱼草（Antirrhinum majus）和水稻（Oryza sativa）遗传距离较
近，聚在家族Ⅱ中，说明它们具有较高的同源性。反转录转座子作为基因组的重要组成部分，在生
物中广泛存在，它不仅可以在物种内纵向传递，而且可以在物种间进行横向传递（Kumar &
Bennetzen，1999），可能在牡丹的进化历史上与这几个物种的 LINE 类反转录转座子 RT 间存在这种
横向传递的现象。


图 4 牡丹与其他植物反转录酶的氨基酸序列进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of amino acid sequences of reverse transcriptase among tree peony and some other plants
1 期 宋程威等：牡丹 LINE 类反转录转座子 RT 序列的克隆及分析 163

3 讨论
牡丹具有很高的观赏价值、文化价值和经济价值，对牡丹进行种质资源评价在牡丹系统演化、
生物多样性保护和栽培牡丹品种培育和改良等一系列研究中具有重要的价值。目前牡丹的遗传多样
性研究主要是形态学、细胞学和分子生物学手段。然而传统的基于形态学、细胞学的分析很容易受
环境因素的影响（戴思兰 等，2002；侯小改 等，2006）。不同的标记方法各有其特异性（李保印 等，
2008）。本研究首次利用 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 的简并引物采用 PCR 技术从‘洛阳红’中扩
增分离出了牡丹相应的 RT 序列，长度为 547 ~ 593 bp。
反转录转座子广泛存在于真核生物中，对基因组的大小、结构、功能和进化都具有重要的作用，
近年来已经成为基因克隆、生物多样性及系统发育进化研究的重要工具。反转录转座子在种内和种
间表现出较高的序列差异性和丰富的插入多态性，因此在长期的进化过程中，反转录转座子形成了
高度异质群体（Wang et al.，2010），本研究分离的 32 条 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 序列在长度、
碱基同源性、碱基变化上存在较大的异质性，经过对序列特征的深入分析表明碱基替换，定点或缺
失突变可能是造成牡丹反转录转座子异质性的重要原因，这与 Woodrow 等（2012）在其他植物中的
研究结果一致。
对本研究分离出的 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 序列的系统聚类分析可将它们分为 4 个家族，
不同家族里含有的反转录酶序列数量不同，反映了不同家族反转录转座子的转录过程存在差异，其
存在的历史地位也可能不同，对牡丹基因组进化的作用也可能各异。将 32 条 LINE 类牡丹反转录转
座子 RT 序列翻译为氨基酸后，发现在第 18 氨基酸序列处它们有 1 个共同的非常保守的甘氨酸（Gly）
位点，在第 138 位点处也表现出 1 个半保守的赖氨酸位点（Lys）；而在其他多处位点的氨基酸序列
表现出很大的差异性，这可能是在进化的过程中发生氨基酸突变而形成。32 条序列均发生较多的终
止密码子突变和移码突变。这也反映了在牡丹进化的过程中其存在的历史地位也可能不同。
将本研究中从牡丹中克隆的 32 条 LINE 类反转录转座子 RT 序列与其他物种的反转录转座子
LINE 中 RT 序列比较，并构建系统进化树。由聚类图可知牡丹的反转录转座子 LINE 中 RT 序列聚
类比较集中，说明其具有一定的保守性；同样，部分序列与洋葱、白花甜菜、蚕豆、金鱼草和水稻
遗传距离较近，说明它们具有一定的同源性。推测在牡丹的进化历史上可能与这几个物种的 LINE
类反转录转座子 RT 存在物种间的横向传递。
本研究分离出 LINE 类牡丹反转录转座子 RT 序列，对进一步基于其开发出一种新型分子标记具
有重要意义。

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