全 文 ：园艺学报，2015，42 (11)：2206–2214.
Acta Horticulturae Sinica
2206 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0352；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–08–24；修回日期：2015–10–14
基金项目：国家重点基础研究发展计划（‘973’计划）项目（2012CB113900）；国家自然科学基金项目（30900986，3157110303，31572127）；
重庆市自然科学基金重点项目（cstc2012jjB80010）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2010B010）
* 为并列第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhuliquan@swu.edu.cn）
甘蓝 BoSU03 蛋白基因的克隆及其与 SRK 相互
作用分析
毕云龙 1,*，高启国 2,*，施松梅 2，刘晓欢 2，蒲全明 2，张 莹 2，张林成 2，
廉小平 1，柳 菁 1，朱利泉 1,2,**
（1 西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716；2 西南大学园艺园林学院，西南大学重庆市蔬菜学重点实验室，重
庆 400716）
摘 要：扩增了从甘蓝柱头蛋白质谱鉴定中获得的泛素蛋白 BoSU03 基因的编码序列。序列分析表明
BoSU03 与甘蓝泛素蛋白 Bol003815 的核苷酸序列相似性最高，达 98%，含有臂重复结构域，属于植物泛
素蛋白家族。为探究 BoSU03 是否为自交不亲和 S 位点受体激酶（SRK）下游的互作蛋白，以 SRK 与 ARC1
相互作用为对照，利用 GAL 酵母双杂交系统对 SRK 与 BoSU03 进行了相互作用验证，结果表明，
BoSRK/BoSU03 的转化酵母在四缺平板 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT 上长势较好，显色较
深，进一步检测发现 BoSRK/BoSU03 转化酵母的 β–半乳糖苷酶活性值大于 BoSRK/BoARC1 转化酵母的
活性值，这为进一步分析鉴定 BoSU03 是否参与 SRK 下游信号传导过程提供了依据。
关键词：甘蓝；S 位点受体激酶（SRK）；BoSU03；植物泛素蛋白家族（PUB）；下游信号蛋白；酵
母双杂交系统
中图分类号：S 635.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）11-2206-09

Molecular Cloning of BoSU03 and Analysis of the Interaction Between
SRK and BoSU03 in Brasscia oleracea
BI Yun-long1,*，GAO Qi-guo2,*，SHI Song-mei2，LIU Xiao-huan2，PU Quan-ming2，ZHANG Ying2，
ZHANG Lin-cheng2，LIAN Xiao-ping1，LIU Jing1，and ZHU Li-quan1,2,**
（1College of Agronomy and Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400716，China；2College of Horticulture and
Landscape Architecture，Southwest University，Key Laboratory in Olericulture of Chongqing，Chongqing 400716,China）
Abstract：In this study，the coding sequences of ubiquitin protein BoSU03 identified by Brassica
oleracea stigma protein mass spectrometry were amplified. Nucleotide sequence analysis showed that it
was highly identical with nucleotide sequence of ubiquitin protein Bol003815 in Brasscia oleracea，
BoSU03 contained ARM repeat domain and belonged to Plant U-box protein family. In order to analyze
the interaction between BoSU03 and SRK，GAL4 two-hybrid system was used here，and the interaction
between SRK and ARC1 was used as control. The results showed that the yeast cells transformed with

毕云龙，高启国，施松梅，刘晓欢，蒲全明，张 莹，张林成，廉小平，柳 菁，朱利泉.
甘蓝 BoSU03 蛋白基因的克隆及其与 SRK 相互作用分析.
园艺学报，2015，42 (11)：2206–2214. 2207

BoSRK/BoSU03 could grow better and turn deeper blue on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol
3-AT nutritional media. And the level of β-Galactosidase activity of BoSRK/BoSU03 was higher than that
of BoSRK/BoARC1. These results will provide the basis for further analysis whether BoSU03 participates
in SRK downstream SI signaling pathway.
Key words：Brasscia oleracea；S-locus receptor kinase（SRK）；BoSU03；Plant U-box family（PUB）；
downstream signaling protein；yeast two-hybrid system

甘蓝等芸薹属（Brassica）植物属于典型的孢子体型自交不亲和植物，其自交不亲和性
（Self-incompatibility，SI）由单一 S 位点（S-locus）上的复等位基因控制。当甘蓝自花授粉后，花
粉粒中 S 位点半胱氨酸富集蛋白（S-locus cystein-rich protein，SCR）与柱头上 S 位点受体激酶（S-locus
receptor kinase，SRK）胞外域发生特异性结合，引起 SRK 构象变化，发生自体磷酸化，使其释放原
本结合在 SRK 激酶结构域的类硫氧还蛋白 1/2（Thioredoxin-H-like 1/2，THL1/2）；随后臂重复蛋白
1（ARM Repeat Containing 1，ARC1）结合到 SRK 胞内激酶域上并被磷酸化；ARC1 是一个 E3 泛
素连接酶，处于活化状态的 ARC1 通过泛素化作用向下游继续传导 SI 信号，最终导致自交不亲和反
应（Stein et al.，1991；Stein & Hewlett，1993；Schopfer et al.，1999；Stone et al.，2003；Fujimoto et
al.，2006；Samuel et al.，2008）。
最近的研究结果显示，反义抑制柱头内 ARC1 基因的表达，只能部分地打破材料的自交不亲和
性，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中 ARC1 基因衰减为假性遗传因子，而仅转入 SRK-SCR 基因
后就能呈现自交不亲和性，由此说明 ARC1 并非 SRK 唯一的下游信号蛋白，柱头内可能存在其他未
知底物与 SRK 作用，在柱头内继续传递 SI 信号（Stone et al.，1999；Indriolo et al.，2012；Goring et
al.，2014；Nasrallah & Nasrallah，2014）。作者前期对甘蓝柱头总蛋白质谱鉴定过程中发现了一个在
甘蓝柱头内表达的泛素蛋白，命名为 BoSU03；本试验中从甘蓝柱头内获取了 BoSU03 基因的编码
序列，序列分析表明 BoSU03 与 ARC1 一样含有臂重复结构域；以 BoSRK 与 BoARC1 为对照，利用
酵母双杂交技术检测 SRK 与 BoSU03 相互作用，结果表明，BoSRK/BoARC1 和 BoSRK/BoSU03 的
酵母 AH109 转化菌株均可以在四缺培养基 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT 上生长并显
蓝色，但 BoSRK/BoSU03 转化酵母的长势较好，显色较深；进一步检测转化酵母的 β–半乳糖苷酶
活性，发现 BoSRK/BoSU03 转化酵母的 β–半乳糖苷酶活性值大于 BoSRK/BoARC1 转化酵母的活
性值。上述结果为进一步研究 BoSU03 在自交不亲和反应中的作用提供了依据。
1 材料与方法
1.1 材料
甘蓝高代自交不亲和系‘A4’由西南大学十字花科蔬菜研究所提供。于 2013 年 3 月底取开花
前 1 ~ 2 d 的柱头，立即放入液氮中保存备用。植物总 RNA 提取试剂盒购自 TIANGEN 公司。大肠
杆菌感受态 DH5α、克隆载体 pEASY-Blunt、反转录酶等购自 TransGen 公司。Ligation high 高效连
接酶购于 TOYOBO 公司。酵母感受态 AH109、酵母双杂交系统（MatchmakerTM GAL4 Two-hybrid
System 3）购于 Clontech 公司。高保真 DNA 聚合酶 PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Taq DNA 聚
合酶、反转录试剂盒购于 TaKaRa 公司。限制性内切酶 EcoRⅠ、BamHⅠ和 SacⅠ购于 Fermentas 公
司。胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）、质粒提取试剂盒（Plasmid Mini KitⅠ）均采购于 OMIGA
Bi Yun-long，Gao Qi-guo，Shi Song-mei，Liu Xiao-huan，Pu Quan-ming，Zhang Ying，Zhang Lin-cheng，Lian Xiao-ping，Liu Jing，
Zhu Li-quan. Molecular cloning of BoSU03 and analysis of the interaction between SRK and BoSU03 in Brasscia oleracea.
2208 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (11)：2206–2214.
公司。酵母 β–半乳糖苷酶活性测定试剂盒（Yeast β-Galactosidase Assay Kit）购于 Thermo 公司。
1.2 BoSU03 基因序列的获得和生物信息学分析
利用前期蛋白质谱鉴定获取的 BoSU03 蛋白氨基酸序列在甘蓝基因组数据进行检索，获得了同
源基因 Bol003815。以此基因序列为模板设计 BoSU03 引物 BoSUS：TCTTCCTCCGTTTCATCAA
TCG；BoSUAS：TTAGGAAGCACGTTCTTGCAAATGTC。利用甘蓝柱头 cDNA 为模板扩增 BoSU03
编码序列。PCR 扩增体系：在 25 μL 反应体系中依次加入 12.5 μL PrimeSTAR Max Premix，9.5 μL
ddH2O，上、下游引物和模板 cDNA 各 1 μL。循环参数为：98 ℃ 1 min；98 ℃ 20 s，59 ℃ 15 s，
72 ℃ 1 min，共 35 个循环；72 ℃延伸 10 min。
BoSU03 基因编码序列经华大基因测序后，在 NCBI 中 Blast 比对，用 ClustalX1.8.0、DNAMAN
等软件进行同源序列分析；用 DNAStar 软件推导基因编码的氨基酸序列，用 ExPASy（http：//
expasy.org/tool//）在线分析氨基酸的理化性质，用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、PROSITE
（http：//wwww.expasy.org/prosite）、Swiss-model（http：//swissmodel.expasy.org/）、InterProScan（http：//
www.ebi.ae.uk/interpro/scan.html）等在线软件共同分析预测蛋白质的功能位点和高级结构域，用
PredictProtein（http：//www.predictprotein.org/）软件分析定位蛋白质特殊氨基酸。
1.3 酵母双杂交重组表达载体的构建
为了分析 BoSU03 与 SRK 之间的相互作用，在基因扩增引物 BoSUS 和 BoSUAS 上分别引入了
EcoRⅠ、SacⅠ酶切位点（BoSU03S：GAATTCTCTTCCTCCGTTTCATCAATCG，BoSU03AS：TCG
AGCTCGTTAGGAAGCACGTTCTTGCAAATGTC），以便将 BoSU03 基因亚克隆至 pGADT7 载体。
参照 Gu 等（1998）通过酵母双杂交系统首次检测到 SRK 与 ARC1 相互作用所使用的 SRK 与 ARC1
基因编码片段的序列，分别设计了 SRK 和 ARC1 引物，引物中加入了 EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点
（SRKS：GCCGAATTCAAAAGAAAACAAAAGCGTGCAAAAG，SRKAS：CGCGGATCCTTAGG
CATCGATGAGTGAGCAGGTG；ARCS：GCCGAATTCCTCCCTAAGGTGTTTCAAACAA，ARCAS：
ATGGATCCCTCAGCACCCCTTACAGACCTTAGAGAG）。PCR 循环参数为：98 ℃ 1 min；98 ℃ 20
s，Tm 15 s，72 ℃ 1 min，共 35 个循环；72 ℃延伸 10 min（引物划线序列代表限制性酶切位点）。
PCR 扩增后的产物用 10 g · L-1 琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的条带，连接克隆载体 pEASY-
Blunt，转化大肠杆菌感受态 DH5α，通过蓝白斑筛选挑取白色阳性单菌落进行菌落 PCR 检测，阳性
克隆子送往华大基因公司测序。
将基因序列正确的菌液扩大培养，用 Plasmid Mini KitⅠ提取质粒；对重组质粒和酵母表达载体
质粒 pGBKT7、pGADT7 进行双酶切；SRK 酶切片段与 pGBKT7 连接，BoSU03、ARC1 酶切片段
与 pGADT7 连接，转化大肠杆菌感受态 DH5α，pGBKT7-SRK 涂布于 LB/Kan 平板上，pGADT7-
BoSU03、pGADT7-ARC1 涂布于 LB/Amp 平板上。挑取白色菌落进行 PCR 检测；提取检测成功的
大肠杆菌质粒，再进行双酶切电泳检测。
1.4 重组质粒的毒性检测和自激活检测
参考酵母双杂交系统（MatchmakerTM GAL4 Two-hybrid System 3）说明书的标准操作方法，利
用 LiAc 法制备酵母感受态 AH109，用 PEG/LiAc 法将重组诱饵质粒 pGBKT7-SRK 和空载 pGBKT7
转化 AH109，涂布在 SD/-Trp 固体培养基上；将 pGADT7-BoSU03、pGADT7-ARC1 和空载 pGADT7
转化 AH109，分别涂布在 SD/-Leu 固体培养基上，于 30 ℃倒置培养 3 ~ 5 d，观察菌落生长状况。
毕云龙，高启国，施松梅，刘晓欢，蒲全明，张 莹，张林成，廉小平，柳 菁，朱利泉.
甘蓝 BoSU03 蛋白基因的克隆及其与 SRK 相互作用分析.
园艺学报，2015，42 (11)：2206–2214. 2209

将含有重组载体 pGBKT7-SRK 的转化酵母菌株涂布在 SD/-Trp/x-α-gal 固体培养基上，含有重组
载体 pGADT7-BoSU03、pGADT7-ARC1 的转化酵母菌株分别涂布在 SD/-Leu/x-α-gal 固体培养基上，
30 ℃倒置培养 3 ~ 5 d，观察菌落生长状况和颜色变化。同时设立 pGBKT7-Lam × pGADT7-T 作为
阴性对照组，pGBKT7-p53 × pGADT7-T 作为阳性对照组，涂布在 SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/x-α-gal
固体培养基上。
1.5 SRK 与 ARC1 相互作用检测
利用 LiAc 法制备酵母感受态 AH109，用 PEG/LiAc 法将重组载体 pGBKT7-SRK 分别和
pGADT7-BoSU03、pGADT7-ARC1 共转化酵母菌感受态，同时设立 pGBKT7-Lam × pGADT7-T 作
为阴性对照，pGBKT7-p53 × pGADT7-T 作为阳性对照；取适量共转化酵母菌涂布于 SD/-Leu/-Trp
固体培养基上，30 ℃倒置培养 3 ~ 5 d；对菌落进行 PCR 鉴定，再挑取菌落溶入 2 μL 0.5 × YPDA，
悬浮滴在 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT 固体培养基上，30 ℃倒置培养 3 ~ 5 d 后观察
酵母的生长状况和显色情况。
1.6 β–半乳糖苷酶活性测定
根据 Yeast β-Galactosidase Assay Kit 说明书的标准操作方法，挑取转化成功的酵母单菌落至
YPDA 中，30 ℃培养至指数生长中期（OD = 0.5 ~ 1.0）；取 1 mL 菌液 13 000 ×g 离心 5 min，再用
无菌水清洗两次，依次加入 250 μL 酵母蛋白提取试剂和 250 μL 2 × β–半乳糖检测缓冲液，置于 37
℃培养箱中，开始计时，待溶液呈黄色时立即加入 200 μL β–半乳糖检测终止反应液，停止计时；
13 000 ×g 离心 30 s，以同体积的上述 3 种试剂为对照，取上清液于 420 nm 处测定吸光值。每个样
品重复测 3 次，取平均值。β–半乳糖苷酶活性 =（1 000 × A420）/（t × V × OD660）。t 为时间（min），
V 为菌液体积（mL），活性单位为 Miller Units。
2 结果与分析
2.1 BoSU03 的克隆与生物信息学分析
BoSU03 的 CDS 全长为 1 197 bp，编码 398 个氨基酸；通过 Blast 分析比对，在芜菁（Brassica rapa
L.）、欧洲油菜（Brassica napus L.）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和琴叶拟南芥（Arabidopsis lyrata）
中的同源基因（登录号分别为 XM_009121011、DQ078748、NM_111215 和 XM_00288224），核酸序
列相似性较高，分别为 96%、89%、86%和 86%，且都含有臂重复结构域（属于 ARM superfamily），
其蛋白是植物泛素蛋白家族成员（Plant U-box，PUB）。用 DNAMAN 等软件对 BoSU03 和 ARC1 的
核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对，其相似性分别为 26.47%和 9.49%；在拟南芥基因数据
库对 BoSU03 进行 BLAST 比对，其同源基因 AT3G03440 位于第 3 条染色体上，而 ARC1 在拟南芥
中属于假性遗传因子；在芸薹属甘蓝基因数据库中对 BoSU03 进行比对，其同源基因 Bol003815 位
于第 5 条染色体上，而 ARC1 的同源基因 Bol037877 位于第 4 条染色体上，说明 BoSU03 并不是 ARC1
的同源拷贝。
利用 Predict protein、PROSITE 在线预测分析其结构发现：BoSU03 蛋白的第 133 ~ 292 aa 为臂
重复区（ARM），无跨膜结构域；主要二级结构由 66.33%的 α–螺旋、1.01%的 β–折叠和 32.66%
的无规则卷曲构成。通过 Predict protein 等软件对 CDS 的氨基酸编码序列进行在线预测分析（图 1）：
Bi Yun-long，Gao Qi-guo，Shi Song-mei，Liu Xiao-huan，Pu Quan-ming，Zhang Ying，Zhang Lin-cheng，Lian Xiao-ping，Liu Jing，
Zhu Li-quan. Molecular cloning of BoSU03 and analysis of the interaction between SRK and BoSU03 in Brasscia oleracea.
2210 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (11)：2206–2214.
该蛋白含有 3 个 N–糖基化位点（204 ~ 207、211 ~ 214 和 275 ~ 278）；2 个 cAMP 或 cGMP 依赖性
磷酸化位点（78 ~ 81、232 ~ 235）；11 个蛋白激酶 C 磷酸化位点（27 ~ 29、84 ~ 86、169 ~ 171、230 ~
232、234 ~ 236、238 ~ 240、294 ~ 296、320 ~ 322、339 ~ 341、366 ~ 368 和 384 ~ 386）；9 个酪蛋
白Ⅱ磷酸化位点（17 ~ 20、21 ~ 24、110 ~ 113、132 ~ 135、152 ~ 155、243 ~ 246、251 ~ 254、340 ~
343 和 358 ~ 361）和 8 个 N–豆蔻酰化位点（41 ~ 46、60 ~ 65、190 ~ 195、264 ~ 269、276 ~ 281、
286 ~ 291、307 ~ 312 和 319 ~ 324）。

图 1 甘蓝 BoSU03 cDNA 及其推导的氨基酸序列
阴影部分为 ARM 结构域，椭圆为 N 糖基化位点，下划直线为 cAMP 磷酸位点，虚线框为蛋白激酶 C 磷酸化位点，
实线框为酪蛋白Ⅱ磷酸化位点，波浪线为 N–豆蔻酰化位点。
Fig. 1 The cDNA sequence of Brassica oleracea BoSU03 and its deduced amino acid sequence
The shadow sequence represents ARM domian；The ovaled sequence for N-glycosylation site；The underlined seqence for cAMP-dependent
protein kinase phosphorylation site；The dashed box for Protein kinase C phosphorylation site；The boxed for Casein kinase Ⅱ
phosphorylation site；The wavy-lined for N-myristoylation site.
毕云龙，高启国，施松梅，刘晓欢，蒲全明，张 莹，张林成，廉小平，柳 菁，朱利泉.
甘蓝 BoSU03 蛋白基因的克隆及其与 SRK 相互作用分析.
园艺学报，2015，42 (11)：2206–2214. 2211

图 2 SRK 胞内域和 ARC1 臂重复区的 PCR 电泳
Fig. 2 Electrophoretic patterns of PCR products of SRK，
BoSU03 and ARC1
图 4 酵母重组载体酶切电泳图
Fig. 4 Double digestion patterns of recombinant plasmid
2.2 重组质粒 pGBKT7-SRK、pGADT7- BoSU03 及 pGADT7-ARC1 的构建及酶切鉴定
以 BoSU03S、BoSU03AS 为引物扩增
BoSU03 臂重复结构域基因片段，用 1%琼脂糖
凝胶电泳检测，核酸序列大小为 1 143 bp；参
照文献设计引物扩增 SRK 和 ARC1，扩增得到
SRK 和 ARC1，基因核酸序列大小分别为 1 170
bp 和 882 bp（图 2）。BoSRK 片段主要包含了
B-Lection 结构域，S-locus glycop 结构域、
PAN-APPLE 结构域和丝氨酸/苏氨酸激酶结构
域，ARC1 主要包含 U-box 和 ARM 结构域，
而 BOSU03 最主要包含 1 个 ARM 结构域。对
SRK、BoSU03 和 ARC1 进行蛋白结构域分析（图 3）：虚线框内表示的为基因扩增片段，BoSU03
和 ARC1 的扩增片段为 ARM 臂重复结构域部分，蛋白质片段长度分别为 381 aa、294 aa；SRK 的
扩增片段是 Ser/Thr 激酶结构域部分，蛋白质片段长度为 390 aa。


图 3 BoSU03、ARC1 和 SRK 的蛋白质结构域
虚线框内为基因扩增片段。
Fig. 3 Protein domains of BoSU03，ARC1 and SRK
The domains with the dashed box were the amplified gene fragments.

扩增基因连接 pEASY-Blunt 克隆载体送华
大基因公司测序。测序结果表明，扩增基因与
甘蓝基因数据库中基因序列一致。用 EcoRⅠ和
BamHⅠ对重组表达载体 pGBKT7-SRK 和
pGADT7-ARC1 进行双酶切鉴定，用 EcoRⅠ和
SacⅠ对重组表达载体 pGADT7-BoSU03 进行
双酶切鉴定，电泳检测到都有两条明亮的条带
（图 4），酶切片段与目的基因大小一致，表明
重组表达载体构建成功。
2.3 重组质粒的毒性和自激活检测
AH109[pGBKT7-SRK]和 AH109[pGBKT7]转化菌株涂布在 SD/-Trp 固体培养基上，30 ℃培养
4 d 后,生长出的白色克隆，菌斑大小、密度无明显的差异；AH109[pGADT7-BoSU03]、
AH109[pGADT7-ARC1]和 AH109[pGADT7]转化菌株涂布在 SD/-Leu 固体培养基上，30 ℃倒置培
养 4 d 后均生长出白色克隆，菌斑大小、密度也无明显差异。而未转化重组质粒的酵母感受态 AH109
Bi Yun-long，Gao Qi-guo，Shi Song-mei，Liu Xiao-huan，Pu Quan-ming，Zhang Ying，Zhang Lin-cheng，Lian Xiao-ping，Liu Jing，
Zhu Li-quan. Molecular cloning of BoSU03 and analysis of the interaction between SRK and BoSU03 in Brasscia oleracea.
2212 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (11)：2206–2214.
在缺陷型平板 SD/-Trp 和 SD/-Leu 上均不能生长，说明重组载体 pGBKT7-SRK、pGADT7-BoSU03
和 pGADT7-ARC1 在 AH109 中都能成功表达且无毒性作用。
两种转化酵母菌株在 SD/-Trp/x-α-gal 和 SD/-Leu/x-α-gal 固体筛选培养基上长出白色菌斑，都无
蓝色菌落生成；阳性对照在 SD/-Leu/-Trp 平板上长出白色菌斑，在 SD/-Leu/-Trp/x-α-gal 平板长出蓝
色菌斑，阴性对照在 SD/-Leu/-Trp 和 SD/-Leu/-Trp/x-α-gal 平板上长出白色菌斑。这表明重组载体
pGBKT7-SRK、pGADT7-BoSU03 和 pGADT7-ARC1 本身没有激活 MEL1 的能力，即重组载体在酵
母 AH109 中没有自激活作用。
2.4 酵母双杂交系统鉴定 SRK 与 BoSU03 和 ARC1 之间的相互作用
将阴阳对照载体和重组载体[pGBKT7-SRK × pGADT7-ARC1]、[pGBKT7-SRK × pGADT7-
BoSU03]共转化酵母感受态 AH109，分别涂布在 SD/-Leu/-Trp 固体培养基上，30 ℃倒置培养 3 d 后
发现平板上有白色菌落生成（图 5）。挑取单菌落进行 PCR 鉴定，在单个菌落中均能扩增出目的基
因条带，说明重组质粒同时转化进入酵母细胞中。从两缺固体培养基上挑取克隆悬浮于 2.5 μL YPDA
液体培养基中，混匀后滴在四缺固体培养基上，30 ℃倒置培养 3 d 后，观察到 SRK/BoSU03、
SRK/ARC1 转化酵母和阳性对照在平板上出现蓝色反应，阴性对照在平板上略显红色；而且
BoSRK/BoSU03 组比 BoSRK/BoARC1 组生长状况更好，蓝色更深（图 6）。由此推测，SRK 与 BoSU03
之间存在相互作用，激活报告基因 MEL1 编码的 β–半乳糖苷酶使得酵母显蓝，并且 SRK 与 BoSU03
之间的作用强度可能要比 SRK 与 ARC1 之间的作用强度大。


图 5 酵母融合株在 SD/-Leu/-Trp 平板上的生长状况
Fig. 5 The Co-transformed plasmid in yeast grown on SD/-Leu/-Trp ager plate



图 6 酵母融合株在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/x-α-gal/25 mmol 3-AT 平板上相互作用检测
Fig. 6 Test protein-protein interactions on SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/x-α-gal/25 mmol 3-AT plate
毕云龙，高启国，施松梅，刘晓欢，蒲全明，张 莹，张林成，廉小平，柳 菁，朱利泉.
甘蓝 BoSU03 蛋白基因的克隆及其与 SRK 相互作用分析.
园艺学报，2015，42 (11)：2206–2214. 2213

图 7 β–半乳糖苷酶活性的测定
Fig. 7 Test of β-Galactosidase activity
2.5 β–半乳糖苷酶活性的测定分析
Yeast β-Galactosidase Assay Kit 能够定量测量 YPDA 液体培养基中转化酵母的 β–半乳糖苷酶活
性。将阳性转化酵母悬浮在酵母蛋白提取试剂和 β–半乳糖检测缓冲液中，经过一段时间的孵化，
转化酵母产生的 β–半乳糖苷酶会使得使邻硝基苯 β–D–半乳吡喃糖苷（ONPG）发生水解作用生
成黄色的邻–硝基酚（ONP），即使在很低浓度
下也可检出。β–半乳糖苷酶活性值能够直接表
示反应强度，故可用此来测定 SRK 与 BoSU03、
ARC1 相互作用强度。参照酵母 β–半乳糖苷酶
活性测定试剂盒测定转化酵母的 β–半乳糖苷
酶活性，测得阳性互作酵母的 β–半乳糖苷酶
活性值为 42.71 Miller Units，BoSRK/BoSU03
融合酵母的 β–半乳糖苷酶活性值要比
BoSRK/BoARC1 的活性值大，其活性值分别为
15.37 和 11.19 Miller Units（图 7）。
3 讨论
在十字花科植物中，自交不亲和反应途径始于花粉中 SCR 和柱头中 SRK 的特异性识别，然后
由 SRK 的胞内激酶结构域向下游传递 SI 信号，Gu 等（1998）首次通过酵母双杂交系统在芜青（B.
rapa）中筛选出 SRK 下游信号蛋白 ARC1。在自交不亲和的芜青和琴叶拟南芥（A. lyrata）中对 ARC1
进行基因敲除后，能部分打破植物的自交不亲和性（Stone et al.，1999；Indriolo et al.，2012）。Indriolo
等（2014）将包含 SCR-SRK-ARC1 基因的 p548 载体转化到拟南芥（A. thaliana）的两个生态型中，
所有的转基因植株都表现出了强烈而稳定的 SI 表型，认为 ARC1 是拟南芥重新恢复自交不亲和性的
关键因子；然而 Nasrallah 实验室对此提出了质疑，因为将 SCR-SRK 基因转入拟南芥中后也得到了
SI 表型（Nasrallah et al.，2002，2004；Kitashiba et al.，2011；Nasrallah & Nasrallah，2014）。据此
有必要重新审视 ARC1 在自交不亲和反应中的作用，而 Goring 实验团队也在回应 Nasrallah 的文章
中指出，之前的研究确实只证明了 ARC1 促进了拟南芥中强烈稳定的自交不亲和反应，而敲除 ARC1
基因后部分打破了植株的自交不亲和性，可能是有残存的 ARC1 使得植株保留了自交不亲和性，但
并不排除存在其他下游信号蛋白的可能性（Goring et al.，2014）。泛素蛋白介导的泛素化作用对芜
青自交不亲和反应至关重要，蛋白酶体抑制剂可抑制柱头中 26S 蛋白酶体的活性，从而促进花粉萌
发和花粉管的生长（Stone et al.，2003；Samuel et al.，2011）。Goring 等（2014）进一步推测，此未
知下游信号蛋白可能与ARC1同属于泛素蛋白家族成员，可以替代ARC1参与组成 SI信号传导通路。
本研究中发现的 BoSU03 蛋白，含有臂重复结构域，其编码基因经 Blast 比对，进行同源序列
分析，发现在欧洲油菜（B. napus）、芜菁（B. rapa）、拟南芥（A. thaliana）、琴叶拟南芥（A. lyrata）
中的同源相似性在 86% ~ 96%之间，都属于植物泛素蛋白家族。运用生物信息学方法对 BoSU03 和
ARC1 进行多重序列比对，证实了两者是两种完全不同的泛素蛋白基因；而 ARC1 基因在拟南芥（A.
thaliana）中为假性遗传因子，而在上述其他 3 个物种中都能表达，并且 ARC1 是一个 E3 泛素连接
酶，通过臂重复区与 SRK 相互作用（Gu et al.，1998；Kitashiba et al.，2011；Indriolo et al.，2012）。
因此本试验中扩增了 SRK 激酶结构域和 BoSU03 臂重复结构域的基因片段，用 GAL 酵母双杂交系
Bi Yun-long，Gao Qi-guo，Shi Song-mei，Liu Xiao-huan，Pu Quan-ming，Zhang Ying，Zhang Lin-cheng，Lian Xiao-ping，Liu Jing，
Zhu Li-quan. Molecular cloning of BoSU03 and analysis of the interaction between SRK and BoSU03 in Brasscia oleracea.
2214 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (11)：2206–2214.
统来鉴定 SRK 与 BoSU03 之间的相互作用。结果显示，BoSRK/BoSU03 转化酵母能在
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT 平板上显蓝，证实了 BoSRK 与 BoSU03 之间确实存在
相互作用；并且相对于 BoSRK/BoARC1 转化酵母，BoSRK/BoSU03 转化酵母的长势较好，显色较
深，进一步检测转化酵母的 β–半乳糖苷酶活性，发现 BoSRK/BoSU03 转化酵母的 β–半乳糖苷酶
活性值大于 BoSRK/BoARC1 转化酵母的活性值，依据酵母双杂交试剂盒和酵母 β–半乳糖苷酶活性
测定试剂盒说明书，SRK 与 BoSU03 之间的相互作用可能要比 SRK 与 ARC1 之间的相互作用强。
因此，在本试验结果的基础上，将对 BoSU03 蛋白的生物学功能进行分析，尤其是 BoSU03 是否参
与 SRK 下游信号传导过程将成为后续研究工作的重点内容。

References
Fujimoto R，Sugimura T，Fukai E，Nishio T. 2006. Suppression of gene expression of a recessive SP11/SCR allele by an untranscribed SP11/SCR
allele in Brassica self-incompatibility. Plant Mol Biol，61：577–587.
Goring D R，Indriolo E，Samuel M A. 2014. The ARC1 E3 ligase promotes a strong and stable self-incompatibility response in Arabidopsis species：
Response to the Nasrallah and Nasrallah Commentary. Plant Cell，26 (10)：3842–3846.
Gu T，Mazzurco M，Sulaman W，Matias D D，Goring D R. 1998. Binding of an arm repeat protein to the kinase domain of the S-locus receptor kinase.
Proc Natl Acad Sci USA，95 (1)：382–387.
Indriolo E，Safavian D，Goring D R. 2014. The ARC1 E3 ligase promotes two different self-pollen avoidance traits in Arabidopsis. Plant Cell，26：
1525–1543.
Indriolo E，Tharmapalan P，Wright S I，Goring D R. 2012. The ARC1 E3 ligase gene is frequently deleted in self-compatible Brassicaceae species
and has a conserved role in Arabidopsis lyrata self-pollen rejection. Plant Cell，24：4607–4620.
Kitashiba H，Liu P，Nishio T，Nasrallah J B，Nasrallah M E. 2011. Functional test of Brassica self-incompatibility modifiers in Arabidopsis thaliana.
Proc Natl Acad Sci USA，108：18173–18178.
Nasrallah M E，Liu P，Nasrallah J B. 2002. Generation of self-incompatible Arabidopsis thaliana by transfer of two S locus genes from A. lyrata.
Science，297：247–249.
Nasrallah M E，Liu P，Sherman-Broyles S，Boggs N A，Nasrallah J B. 2004. Natural variation in expression of self-incompatibility in Arabidopsis
thaliana：Implications for the evolution of selfing. Proc Natl Acad Sci USA，101：16070–16074.
Nasrallah J B，Nasrallah M E. 2014. Robust self-incompatibility in the absence of a functional ARC1 gene in Arabidopsis thaliana. Plant Cell，26
(10)：3838–3841.
Samuel M A，Mudgil Y，Salt J N，Delmas F，Ramachandran S，Chilelli A，Goring D R. 2008. Interactions between the S-domain receptor kinases
and AtPUB-ARM E3 ubiquitin ligases suggest a conserved signaling pathway in Arabidopsis. Plant Physiol，147 (4)：2084–2095.
Samuel M A，Tang W，Jamshed M，Northey J，Patel D，Smith D，Siu K W，Muench D G，Wang Z，Goring D R. 2011. Proteomic analysis of
Brassica stigmatic proteins following the self-incompatibility reaction reveals a role for microtubule dynamics during pollen responses. Mol
Cell Proteomics，10 (12)：M111.011338. doi：10.1074/mcp.M111.011338.
Schopfer C R，Nasrallah M E，Nasrallah J B. 1999. The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science，286：1697–1700.
Stein J C，Hewlett B，Boyes D C.1991. Molecular cloning of a putative receptor protein kinase encoded at the self-incompatibility locus of Brassica
oleracea. PNAS，88：8816–8820.
Stein J C，Nasrallah J B. 1993. A plant receptor-like gene，the S-locus receptor kinase of Brassica oleracea L.，encodes a functional serine/threonine
kinase. Plant Physiology，101：1103–1106.
Stone S L，Anderson E M，Mullen R T，Goring D R. 2003. ARCI is an E3 ubiquitin ligase and promotes the ubiquitination of proteins during the
rejection of self-incompatibility Brassica pollen. Plant Cell，15 (4)：885–898.
Stone S L，Arnoldo M，Goring D R. 1999. A breakdown of Brassica self-incompatibility in ARC1 antisense transgenic plants. Science，286：1729–1731.