全 文 ：园艺学报，2015，42 (2)：341–349.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0882；http：//www. ahs. ac. cn 341
收稿日期：2014–11–13；修回日期：2015–01–22
基金项目：国家自然科学基金项目（31360475）；贵州省重大科技专项项目（黔科重大专项字 20136006-1）；贵州大学研究生创新基金
项目（研农 2014004）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：anhuaming@hotmail.com）
刺梨转录组 SSR 信息分析及其分子标记开发
鄢秀芹，鲁 敏，安华明*
（贵州大学农学院，贵州省果树工程技术研究中心，贵阳 550025）
摘 要：利用 MISA 软件筛选刺梨（Rosa roxburghii Tratt）转录组测序获得的 106 590 条 Unigene，
共检测出 21 711 个 SSR 位点，分布于 18 155 条 Unigene 中，出现频率为 20.37%，平均分布距离为 1.68 kb。
优势重复基序为三核苷酸、四核苷酸和二核苷酸，分别占总 SSR 位点的 26.87%、26.77%和 24.93%。AG/CT
与 AAG/CTT 分别是二核苷酸与三核苷酸的优势重复基元，分别占总 SSR 重复类型的 17.80%和 11.55%。
以不同主导重复基元类型设计合成 42 对 SSR 引物，并以刺梨及其他蔷薇属种质的基因组 DNA 为模板对
其有效性及通用性进行初步验证，筛选出具有清晰扩增产物的引物 23 对，并且均在同属材料中通用。选
取 16 份贵州刺梨资源对筛选出的引物进行多态性检测，获得 12 对具有多态性的引物。以上结果表明，
刺梨转录组测序产生的 Unigene 信息可作为开发 SSR 标记的有效来源，获得的大批量 SSR 标记可为刺梨
及其近缘种的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。
关键词：刺梨；SSR；转录组
中图分类号：S 661.9 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）02-0341-09

Analysis on SSR Information in Transcriptome and Development of
Molecular Markers in Rosa roxburghii
YAN Xiu-qin，LU Min，and AN Hua-ming*
（College of Agriculture，Guizhou University，Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops，Guiyang 550025，
China）
Abstract：One hundred and six thousand five hundred and ninety unigenes from fruit transcriptome of
Rosa roxburghii Tratt were screened using MISA software. A total of 21 711 SSRs that occurred in 18 155
unigenes were identified，and the frequency of these SSRs was 20.37% and mean distance was 1.68 kb in
the unigenes. Trinucleotide，tetranucleotide and dinucleotide were major types，accounting for 26.87%，
26.77% and 24.93%，respectively. AG/CT，AAG/CTT were respectively most frequent motifs in
dinucleotide and trinucleotide repeats，accounting for 17.80% and 11.55%，respectively. Using the Primer
3.0，42 primers were designed and synthesized based on different dominant motifs types，and verified with
R. roxburghii germplasms for validity and Rosa germplasms for transferability. The results showed that the
products of 23 primers are clear and effective，23 pairs could be transferable to Rosa germplasms and 12
pairs were polymorphic among the 16 R. roxburghii germplasms. The results indicated that the unigenes
generated from transcriptome sequencing in R. roxburghii can be used as an effective source to

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Analysis on SSR information in transcriptome and development of molecular markers in Rosa roxburghii.
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development SSR markers. The large quantities of SSR markers will provide more reliable markers for
map structure，analysis of genetic polymorphism for R. roxburghii and its closely related species.
Key words：Rosa roxburghii；SSR；transcriptome

简单序列重复（Simple sequence repeat，SSR）是一类由 1 ~ 6 个碱基组成的基元串联重复而成
的 DNA 序列（Tautz，1989）。根据 SSR 来源可分为基因组 SSR 和 EST-SSR。传统的基因组 SSR 标
记开发费时、费力且成本高，而 EST-SSR 标记不仅具有传统 SSR 标记多态性高、共显性与重复性
好等特点，更重要的是开发成本低；而且由于 EST-SSR 来源于表达的基因组区域，可直接反映相关
基因的多样性，在不同物种间也具有良好的通用性（Powell et al.，1996）。近年来，大量快速增长的
EST 数据已成为 SSR 的重要来源，基于 EST 序列开发 SSR 标记在梨（王西成 等，2010；Zhang et al.，
2014）、草莓（董清华 等，2011）、荔枝（孙清明 等，2011）、桃（Vendramin et al.，2007）、核桃
（齐建勋 等，2011）、猕猴桃（徐小彪 等，2010）等多种果树中均有报道。
刺梨（Rosa roxburghii Tratt）为蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa）多年生灌木，是中国特有的
新兴果树。因其果实含有丰富的营养物质和药用保健成分，特别是极高的维生素 C 含量而引起国内
外的广泛关注（樊卫国 等，1997；安华明 等，2011），并已成为贵州省重点发展的果树产业。贵州
刺梨资源极其丰富，但对于该物种的遗传多样性研究主要局限于 RAPD（文晓鹏 等，2003a，2003b，
2003c）、AFLP（Wen et al.，2004）等通用的分子标记技术。与此同时，至 2014 年 7 月，GenBank
中公布的刺梨 EST 序列仅有 160 余条，不足以开发大批量的 SSR 标记。本研究基于前期工作中对
刺梨果实转录组进行测序获得的数据，开发大批量 EST-SSR 引物，为利用 SSR 分子标记进行刺梨
种质资源多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 转录组数据来源
刺梨转录组数据来源于本课题组 2012 年对刺梨品种‘贵农 5 号’果实进行 Illumina 高通量深度
测序的结果。测序时采取 3 个发育时期（花后 20、60、100 d）的刺梨果实，提取 RNA 并等量混匀
后委托华大基因公司进行 RNA-Seq 转录组测序，并通过 De Novo 方法（Grabherr et al.，2011）组装
得到 106 590 条 Unigene，作为分析背景数据。
1.2 植物材料及其 DNA 提取
用于对所设计的引物进行筛选和可用性评价的材料为本课题组收集保存的 3 份刺梨（‘贵农 5
号’和两份野生刺梨）、1 份无籽刺梨（R. sterilis S. D. Shi）和 1 份野蔷薇（R. multiflora Thunb.）。
此外，选取‘贵农 5 号’和 15 份野生刺梨资源对筛选出的引物进行多态性检测。
试验材料基因组 DNA 提取参照 Porebski 等（1997）的 CTAB 法。
1.3 转录组 SSR 位点鉴别及 SSR 引物设计
使用 MISA 程序（http：//pgrc. ikp-gatersleben. de/misa）进行 SSR 位点搜索，搜索标准为：二核
苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为 6、4、3、3 和 3 次。
用 Primer 3.0 引物批量设计程序对含有 SSR 位点的 Unigene 序列设计引物，并且 SSR 位点侧翼
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序列长度 ≥ 50 bp。引物设计的主要参数为：（1）退火温度（Tm）在 55 ~ 65 ℃之间，上、下游引
物的 Tm相差 ≤ 2 ℃；（2）PCR 产物大小在 80 ~ 300 bp；（3）引物长度在 18 ~ 28 bp 之间；（4）GC
含量在 40% ~ 60%之间；尽量避免引物二级结构如发卡结构、二聚体、错配、引物二聚体的出现。
对批量设计的 SSRs 引物对在 Unigene 库中进行 SSR 引物的 Blast 验证。
1.4 EST-SSR 引物筛选
随机选取 42 对 EST-SSR 引物交由上海英骏生物技术有限公司合成。选取‘贵农 5 号’和两份
野生刺梨资源进行引物筛选。PCR 反应体系为 20 µL，其中包括 2× Mix 10 µL；10 µmol · L -1 的
Primer-F 及 Primer-R 各 0.5 µL；ddH2O 8 µL；50 ng · µL-1 的 DNA 模板 1 µL。扩增程序为 94 ℃预变
性 3 min；然后进行 35 个循环，每个循环包括 94 ℃变性 40 s，55 ℃退火 40 s（退火温度因不同引
物而异），72 ℃延伸 1 min；最后 72 ℃延伸 10 min。
扩增产物利用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶于北京六一仪器厂生产的 DYCZ-30C 型垂直电泳槽中
电泳分离，120 V 电压下电泳 75 min。电泳后参照 Bassam 等（1991）的方法进行银染显色，BIO-RAD
凝胶成像系统拍照记录。
1.5 数据统计
用 SSR 出现频率和 SSR 平均分布距离来描述 EST-SSR。计算公式为：（1）SSR 出现频率，
fc（%）= c/n × 100，c 为搜索到的 SSR 数量，n 为无冗余 EST 数量；（2）SSR 平均分布距离，fN =
N/c，N 为无冗余 EST 数量的总碱基数。
2 结果与分析
2.1 转录组中 SSR 的分布及结构特点
通过对刺梨转录组的 106 590 条 Unigene（序列总长约 36 571.80 kb）序列进行搜索，发现其中
18 155 条 Unigene 序列中含有 21 711 个 SSR 位点，其中 2 867 条 Unigene 含有两个或两个以上
EST-SSR 位点。总体上，SSR 发生频率为 20.37%，平均每 1.68 kb 出现 1 个 SSR。SSR 的类型丰富，
二核苷酸至六核苷酸重复类型均存在。其中二、三和四核苷酸重复出现频率占优势，分别占总 SSR
的24.93%、26.87%和26.77%；五核苷酸和六核苷酸重复类型数量较少，分别占总数的12.52%和8.91%
（表 1）。所有 SSR 中，以 3 次重复的 SSR 最多，占 40.81%，4 次重复的占 23.24%，6 次重复的占
10.06%（表 1）。

表 1 刺梨 EST-SSR 的类型、数量及分布频率
Table 1 Type，number and frequency of EST-SSRs in R. roxburghii
重复次数 Repeat number 重复基元长度
Repeat motif length 3 4 5 6 7 8 9 10 ﹥10
总计
Total
百分比/%
Percentage
二核苷酸 Di 1 617 1 107 994 914 631 150 5 413 24.93
三核苷酸 Tri 3 726 1 241 547 276 36 1 7 5 834 26.87
四核苷酸 Tetra 4 725 847 181 17 1 1 3 1 36 5 812 26.77
五核苷酸 Penta 2 353 341 12 2 3 2 3 1 2 717 12.52
六核苷酸 Hexa 1 782 131 8 2 1 2 3 4 2 1 935 8.91
总计 Total 8 860 5 045 1 442 2 185 1 388 1 035 924 636 196 21 711 100.00
百分比% Percentage 40.81 23.24 6.64 10.06 6.39 4.77 4.26 2.93 0.90
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刺梨转录组 SSR 重复单元的重复次数分布在 3 ~ 29 次之间，其中 3 ~ 10 次重复的 SSR 位点有
21 515 个，占总个数的 99.10%；11 ~ 20 次重复的有 184 个，占 0.85%；20 次重复以上的有 12 个，
只占 0.05%。刺梨转录组 SSR 的长度从 12 ~ 112 bp 不等，分布在 12 ~ 15 bp 的约有 14 769 个，占整
个 EST-SSR 的 68.02%；16 ~ 20 bp 的有 6 237 个，为 28.73%；21 ~ 25 bp 的有 621 个，为 2.86%；
长度大于 25 bp 的有 84 个，为 0.39%。
2.2 转录组 SSR 基序重复类型和频率特征
从刺梨转录组 SSR 核苷酸基序类型来看，其 21 711 个 SSR 位点包含 314 种重复基元，二核苷
酸至六核苷酸重复分别有 4、10、33、86、181 种；从分布频率来看，出现最多的基元是 AG/CT
（3 865 个，占 17.80%），其次是 AAG/CTT（2 507 个，占 11.55%）和 AAAT/ATTT（1 918 个，占
8.83%）。在二核苷酸重复基元中，以 AG/CT、AC/GT 和 AT/AT 为主，占二核苷酸总数的 99.83%。
三碱基中以 AAG/CTT、AAT/ATT、AGG/CCT 最多，分别占三核苷酸总数的 42.97%、17.21%和
10.23%。二核苷酸和三核苷酸重复基元的类型及发生频率见表 2。四核苷酸中以 AAAT/ATTT 和
AAAG/CTTT 最多，分别占四核苷酸总数的 33.00%和 24.67%；五核苷酸中以 AAAAT/ATTTT 和
AAAAG/CTTTT 出现频率最高，分别占其总数的 30.77%和 27.46%；六核苷酸中出现频率最高的是
AAAAAT/ATTTTT 和 AAAAG/CTTTTT，分别占其总数的 23.98%和 22.02%。


表 2 刺梨 EST-SSR 中二碱基和三碱基重复基元的类型及频率
Table 2 Dinucleotide and trinucleotide EST-SSR repeat motifs and their frequency in ESTs of R. roxburghii
重复次数 Repeat number 重复基元类型
Repeat motif length 4 5 6 7 8 9 10 > 10
总计
Total
频率%
Frequency
AC/GT 274 169 140 98 87 48 816 3.76
AG/CT 1 024 759 701 766 519 96 3 865 17.80
AT/AT 314 175 153 50 25 6 723 3.33
CG/CG 5 4 9 0.04
AAC/GTT 268 113 46 23 3 453 2.09
AAG/CTT 1 555 517 285 137 13 2 507 11.55
AAT/ATT 653 228 81 34 5 3 1 004 4.62
ACC/GGT 343 79 32 20 4 1 479 2.01
ACG/CGT 37 27 6 2 72 0.33
ACT/AGT 49 13 3 6 2 73 0.34
AGC/CTG 123 25 6 3 1 157 0.72
AGG/CCT 370 129 63 32 2 597 2.75
ATC/ATG 232 74 19 19 5 3 352 1.62
CCG/CGG 96 36 6 2 140 0.64
总计 Total 3 726 1 241 2 164 1 383 1 030 915 631 157 11 247 51.80
频率/% Frequency 17.16 5.72 9.97 6.37 4.74 4.21 2.91 0.72 51.80

2.3 EST-SSR 引物的有效性及通用性检测
对含 SSR 位点的 18 155 条 EST 序列进行引物设计，共设计了 11 185 对 SSR 位点特异引物。为
了验证其引物的有效性，随机挑选合成了 42 对 EST-SSR 引物，包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷
酸、五核苷酸及六核苷酸重复基元的 SSR 位点。
以 3 份刺梨材料的基因组 DNA 为模板对这批引物进行 PCR 扩增、筛选。结果表明，其中的 23
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对引物（表 3）能产生理想的 PCR 产物，有效扩增率为 54.76%。通过筛选得到的 23 对 SSR 引物，
在野蔷薇和无籽刺梨中均能有效扩增，引物的转化率达到 100%，说明其通用性很高。

表 3 23 对刺梨 SSR 引物信息
Table 3 Information of 23 pairs of primers developed from R. roxburghii
引物编号
Primer No.
引物序列（5′→3′）
Primer sequence（5′→3′）
重复单元
Repeat
motif
预期产物/
bp
Expected size
扩增带数
Number
of bands
多态性带数
Number of
polymorphic
bands
多态率/%
Percentage of
polymorphism
1 GGAGGGTTTGGTTTCACTCTTAT
TAGGGTTAGGTTTCTCTTCTGGG
AG（2*9） 153 5 3 60.00
2 TCAGATTTCCTTGATACCCAAAG
CGATGAGTTGAGTGTTGTTGCTA
AC（2*8） 106 2 0 0
3 TGAGTCCTTTGAATGATGAACAA
ACCCGATAAGTAACAATACGCAA
AT（2*6） 92 3 0 0
4 TTGTGGTTATAGTTCAGCCCCTA
CAATCACGGAAATCATACATTCA
CCT（3*5） 95 3 2 66.67
5 TATCTTACACGCATCCTCCTCAT
GCCGCCTCTTGATTTTATTTATT
CCA（3*7） 140 1 0 0
6 AAGATTATGAGGTTTTGGCGG
GGATGGTGTTGAGGATAGGATTT
AAAT（4*5） 160 4 1 25.00
7 AATATACACGAACAACAACCATCG
GGAACATGACCCCTTTTCTTATT
CTACA（5*4） 147 2 2 100.00
8 CATCCTTATTTTCCTCTCCACG
TAGTGTTCTCGGTGATGTAGGGT
TTTCC（5*4） 155 3 0 0
9 TAACCACAGTTATTCATACGGCA
CAGCAATCCTTCAAAGTTAGCAC
AG（2*8） 150 5 4 80.00
10 GAAAAATCTGGGAGTGATGTTTG
TGACTATGTAAGTGTGGACGCTC
CT（2*8） 121 3 0 0
11 ACCCATATCCCAAGAAAAGTCAT
CCCCATTGAGAAAGAAAGAAAAG
CT（2*6） 141 6 0 0
12 GCTAATCTTCCCATCCTCTTCTG
TACCTCAAACACATACACAACGC
TG（2*6） 99 5 2 40.00
13 CCGACTCTTTCACAGTCAATCTC
AAGCAGGAACTCTTTCACCATTC
TG（2*7） 98 3 2 66.67
14 GTGGATGTGTCAAATCTAATGGC
GGAGGGAAGAAGTAGTGAAGAACA
CT（2*6） 152 2 1 50.00
15 CCCTATACAGAAAGTGTGTGCGT
ACTCTAACTCTCTCCCTCCTCCC
AG（2*6） 137 2 0 0
16 TTTGAGTGGGATTTCAGATGATT
AGTACAAGTATAGTACAATAGGGTTTTG
AT（2*6） 124 2 1 50.00
17 GATGCTTTTCATTCTGCTTCAAC
ATTTTTACCGTACTCTGGGTGCT
TC（2*6） 123 1 0 0
18 GGAGCACAAAGATGAGTGGATAC
AAACAGGCATAGATTGGCATAGA
TG（2*6） 136 2 0 0
19 ATTTGTTTTTCGTTTTTCTTCCC
TTTGGTCATTCATTCTTCTCCTC
CAT（3*5） 128 4 0 0
20 CAATGGAAGTGTTCACAAGAGTG
CACAAGAAATATGAGCACAGAAGAA
CCT（3*5） 104 3 2 66.67
21 GAACAAACCCAACACAAATCCT
AAACAACCACCACAAACACACTT
TCT（3*6） 141 1 0 0
22 GAGTCATGTTGAATGATATTGGC
TTTCCTCTTTTCTTCTTTTTCCC
TGGA（4*13） 131 2 1 50.00
23 CTGACAAAGCCCCTTCTCTTAAT
ATGTCGCTCTTTACACCATTTCC
CAAA（4*5） 142 3 2 66.67
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图 1 为 6 对 SSR 引物在 3 份刺梨种质和两份蔷薇属植物中的扩增情况。

图 1 部分引物在 3 个刺梨（A ~ C）和野蔷薇（D）、无籽刺梨（E）中的扩增
4 ~ 8 和 15 代表引物见表 3。
Fig. 1 Amplification of primer 4–8 and 15 showed in three species of R. roxburghii（A–C），
R. multiflora（D）and R. sterilis（E）
Representative primers 4–8 and 15 are shown in Table 3.

2.4 EST-SSR 标记的多态性
选取‘贵农 5 号’和 15 份野生刺梨资源利用 23 个有效 EST-SSR 引物进行扩增、多态性评价。
结果表明，12 对引物呈现出多态性，占有效引物的 52.17%。12 对引物共得到 39 条条带，其中多态
性片段 23 个，每对引物平均产生 1.92 个多态性片段，每对引物产生的多态性片段的数 1 ~ 4 不等。
图 2 为引物 22 的扩增情况，其它引物的扩增及多态性情况见表 3。

图 2 引物 22 在 16 个刺梨材料中的扩增
2：‘贵农 5 号’；1、3 ~ 16：野生刺梨。
Fig. 2 Polymorphisms showed in 16 R. roxburghii germplasms by primer 22
2：R. roxburghii Tratt‘Guinong 5’；1，3–16：Wild R. roxburghii.
3 讨论
随着新一代测序技术的飞速发展，大量的 EST 序列被提交到公共数据库中，成为开发 SSR 标
记的可利用资源。迅速增多的 EST-SSR 也被广泛应用于遗传连锁图谱的构建、种质鉴定、遗传多样
性及基因定位与克隆等（程小毛和黄晓霞，2011）。在本研究中对一个来自刺梨果实 cDNA 文库中
的 106 590 条 Unigene 进行了 SSR 搜索，得到了 21 711 个 SSR 位点，出现频率为 20.37%，这个比
率高于茶的 14.70%（Wu et al.，2013）、腊梅的 12.35%（李响 等，2013）、红豆杉的 2.07%（李炎
林 等，2014），但稍低于柑橘的 21.74%（Jiang et al.，2006）和萝卜的 23.79%（Wang et al.，2012）。
出现这种情况的原因可能是物种间的真实 SSR 信息差异，或由 SSR 查找程序所使用的软件、SSR
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长度设定的标准、EST 数据库中的数据量及来源等方面的不同造成。随着 EST 数据库的容量不断增
大，各个物种间的 SSR 频率比较将有一个统一的标准。
从刺梨 SSR 结构来看，三核苷酸（26.87%）出现频率最高，略高于四核苷酸（26.77%）和二核
苷酸（24.93%）。这与前人对其他植物的研究表明三核苷酸是存在最广泛的重复元（Kota et al.，2001；
孙清明 等，2011）相符。在二核苷酸重复基元中频率最高的是 AG/CT，与胡杨（Du et al.，2013）、
芝麻（Wei et al.，2011）、蔷薇科果树杏、桃（Jung et al.，2005）中的研究一致。最丰富的三核苷酸
重复为 AAG/CTT，这与 Morgante 等（2002）认为双子叶植物中三核苷酸主要重复类型是 AAG/CTT
的观点相符。
根据 18 155 条 EST 序列进行引物设计，共设计了 11 185 对 SSR 位点特异引物。在合成的 42
对 SSR 引物中，共有 23 对引物能够扩增出理想的 PCR 产物，其有效扩增率为 53.76%。部分引物扩
增失败的原因可能与引物位置或者质量有关。23 对引物中 12 对引物具有多态性，占可扩增引物的
52.17%，这个比率低于甜瓜的 73.3%（胡建斌和李建吾，2009）、草莓的 85.71%（董清华 等，2011），
但高于野三七的 50%（李翠婷 等，2014）和红豆杉的 38.71%（李炎林 等，2014）。多态性的高低
可能与材料数量及材料之间差异程度有关。从多态性潜能的角度考虑，本研究中设计的 11 185 对 SSR
引物也具有较高的可用性，用于刺梨遗传研究是可行的。
前人在蔷薇科植物 SSR 通用性方面做了研究，如 Dirlewanger 等（2002）根据桃设计的 41 对
EST-SSR 引物在杏和甜樱桃中的有效扩增率分别为 100%和 80.5%；王彩虹等（2005）的研究结果表
明，6 对来自苹果基因组 SSR 引物除两对在杏上无相应大小范围的 SSR 扩增产物外，其它 SSR 引
物在蔷薇科 6 属 18 个种上都有清晰的 SSR 条带出现；在杏中表现多态的 20 对 EST-SSR 引物有 90%
的引物在梅中也有扩增产物（上官凌飞 等，2011）。本研究中发现在对刺梨 DNA 能扩增出理想产
物的 23 对引物中，对 2 种蔷薇属植物完全可用，通用率为 100%。SSR 侧翼序列的保守程度决定着
EST-SSR 的通用率，说明所选取的 EST-SSR 侧翼序列的保守性较好。
下一步工作将扩大筛选范围，所获得的大批量 SSR 引物将会为刺梨和其他蔷薇科植物的资源分
类、分子标记辅助育种、遗传图谱构建等研究提供更多、更加专一有效的分子标记。

References
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