全 文 ：园艺学报，2015，42 (12)：2412–2420.
Acta Horticulturae Sinica
2412 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0466；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–08–11；修回日期：2015–10–31
基金项目：国家重点基础研究发展计划（973 计划）项目（2012CB113900）；国家自然科学基金项目（30900986）；中央高校基本科研
M甘蓝 LPK的原核表达及其互作蛋白分离体系
的建立
刘晓欢 1，高启国 1,*，施松梅 1，蒲全明 1，毕云龙 2，张 莹 1，朱利泉 2，
王小佳 1
（1 西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400716；2 西南大学农学与生物科技学院，重
庆 400716）
摘 要：M–位点受体激酶（MLPK）是甘蓝自交不亲和反应的正向调控关键元件，其参与自交不亲
和反应的分子机制尚不明确。为了分离与 MLPK 相互作用的蛋白，在分析了 MLPK 功能域的基础上采用
PCR 技术扩增了 MLPK 激酶结构域编码序列（记为 MLPKK），通过体外定点突变技术构建了两种 MLPK
失活突变体（记为 mlpk1 和 mlpk2），然后以 pET43.1a 为载体构建了原核表达质粒 pET43.1a-MLPKK、
pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2，并进行了原核表达和纯化。纯化的融合蛋白 pET43.1a-MLPKK、
pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2 分别与高度自交不亲和甘蓝‘A4’柱头总蛋白提取液进行孵育，孵育
后利用融合蛋白序列中的 6× His 标签与 Ni+结合的特性，钓取 MLPK 的互作蛋白，建立了分离 MLPK 互
作蛋白的新方法。孵育产物经 SDS-PAGE 电泳显示，与两个突变体蛋白泳道对比，在 pET43.1a-MLPKK
与柱头总蛋白提取液孵育产物的泳道中成功获得了候选的与 MLPK 互作的蛋白条带，这为后续互作蛋白
质谱鉴定以及功能解析提供了技术支持。
关键词：甘蓝；自交不亲和；M–位点受体激酶（MLPK）；互作蛋白；分离方法
中图分类号：S 635.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）12-2412-09

Prokaryotic Expression of MLPK and the Establishment of Separation
System of Its Interacting Proteins in Brassica oleracea
LIU Xiao-huan1，GAO Qi-guo1,*，SHI Song-mei1，PU Quan-ming1，BI Yun-long2，ZHANG Ying1，
ZHU Li-quan2，and WANG Xiao-jia1
（1College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Key Laboratory of Horticulture Science for
Southern Mountainous Regions Ministry of Education，Chongqing 400716，China； 2College of Agronomy and
Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400716，China）
Abstract：M-locus receptor kinase（MLPK）is a positive regulatory element for Brassica self-
incompatibility（SI）signaling，and MLPK’s cellular mechanism in this response remains unknown. In this
study，for the separation and identification of interacting proteins with MLPK during the course of SI，

业务费专项资金项目（XDJK2010B010）；重庆市自然科学基金重点项目（cstc2012jjB80010）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gaoqg2004031@163.com）
刘晓欢，高启国，施松梅，蒲全明，毕云龙，张 莹，朱利泉，王小佳.
甘蓝 MLPK 的原核表达及其互作蛋白分离体系的建立.
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the coding sequences of MLPK kinase domain（named MLPKK）were amplified from stigma mRNA of
Brassica oleracea，and two kinds of MLPK mutants（named mlpk1 and mlpk2）deficient in kinase activity
were prepared by site-directed mutagenesis. Then，they were inserted into the expression vector pET43.1a
to construct the recombinant plasmid pET43.1a-MLPKK，pET43.1a-mlpk1 and pET43.1a-mlpk2. The
recombinant proteins were respectively expressed in E. coli（BL21）and purified. Using the characteristic
of 6× His Tag of fusion protein combined with Ni+，the purified fusion proteins pET43.1a-MLPKK，
pET43.1a-mlpk1 and pET43.1a-mlpk2 respectively were incubated with total protein extracts from stigmas
of highly self-incompatible Brassica oleracea，fished interacting proteins with MLPK，and established a
new method for separation of interacting proteins in vitro. The result of incubation products by SDS-PAGE
electrophoresis showed that the lane of incubation products which pET43.1a-MLPKK were incubated with
total protein extracts successfully obtained candidate interacting proteins bands，compared with two mutant
protein lanes. This research provides technical support for mass spectrum identification and functional
explanation of interacting proteins.
Key words：Brassica oleracea；self-incompatibility；M-locus receptor kinase；interacting protein；
separation method

自交不亲和性（Self-incompatibility，SI）普遍存在于显花植物中，是防止自交、促进异交的重
要遗传机制之一（Takayama & Isogai，2005）。
近年来，有关自交不亲和信号传导机理的研究已经取得显著进展。当自花授粉后，花粉中 S–
位点半胱氨酸富集蛋白（S-locus cysteine-rich protein，SCR）与柱头上 S–位点受体激酶（S-locus
receptor kinase，SRK）结合（Kachroo et al.，2001；Takayama et al.，2001），激发 SRK 活性，SRK
磷酸化臂重复蛋白 1（Arm repeat containing 1，ARC1）介导并通过泛素化过程降解 Exo70A1，进而
引发一系列尚未完全知晓的级联反应，最终实现 SI 反应（Gu et al.，1998；Stone et al.，1999；Chapman
& Goring，2010；Ivanov et al.，2010）。然而，与 SCR 和 SRK 突变导致自交不亲和性完全丧失不同
的是，反义抑制或 RNAi 干扰 ARC1 表达以及过量表达 Exo70A1 均只能部分打破 SI（Goring et al.，
1993；Schopfer et al.，1999；Stone et al.，1999；Samuel et al.，2009；Indriolo et al.，2012）。
Murase 等（2004）通过图位克隆的方法在自交亲和的白菜型油菜黄籽沙逊（Yellow Sarson）中
分离出 1 个由 M 位点编码的 M–位点受体激酶（M-locus protein kinase，MLPK），与 SRK 一样，其
mlpk/mlpk 突变体植株自交不亲和性完全丧失，表现为自交亲和，将 MLPK 基因通过基因枪法整合
到 mlpk/mlpk 突变体的乳突细胞中进行瞬时表达，可以恢复自交不亲和性（Murase et al.，2004；Kakita
et al.，2007b）。此外，MLPK 能被 SRK 磷酸化并与之形成异源复合体，表明 MLPK 是 SRK 下游信
号元件之一（Kakita et al.，2007a，2007b）。上述内容表明 MLPK 是 SI 反应的正向调控关键元件。
然而 MLPK 参与 SI 的分子机制尚不明确，解决这一问题的关键是分离和鉴定 MLPK 的互作蛋白。
在酵母双杂交不能有效检测到 SRK 与 MLPK 相互作用的前提下（Kakita et al.，2007a），本试验中
构建了具有激酶活性的 MLPKK以及失活突变体 mlpk1 和 mlpk2 的 pET43.1a 原核表达质粒，高效表
达融合蛋白后，与提取的高度自交不亲和甘蓝的柱头总蛋白进行孵育，经 SDS-PAGE 聚丙烯凝胶电
泳，成功筛选出候选的与 MLPK 互作的蛋白条带，成功建立了 MLPK 互作蛋白的分离体系，为后
续进行互作蛋白的鉴定与分析提供了基础。

Liu Xiao-huan，Gao Qi-guo，Shi Song-mei，Pu Quan-ming，Bi Yun-long，Zhang Ying，Zhu Li-quan，Wang Xiao-jia.
Prokaryotic expression of MLPK and the establishment of separation system of its interacting proteins in Brassica oleracea.
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1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝‘A4’品种为西南大学园艺园林学院十字花科研究所选育的高度自交不亲和材料。2014
年 3 月底至 4 月初，取开花当天的花蕾，剥去萼片取自花授粉 30 min 的柱头，立即投入液氮中速冻，
–80 ℃保存，用于提取柱头总蛋白。
高保真 DNA 聚合酶 PrimeSTAR、Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa。大肠杆菌感受态 DH5α、BL21
（DE3）、克隆载体 pEASY-Blunt 等购自 TransGen 公司。胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自 Bio-Flux
公司。EcoRⅠ、XhoⅠ为 Thermo Scientific 产品。Ligation High 为 TOYOBO 的产品。MagneHisTM
蛋白纯化试剂盒购自 Promega 公司。
1.2 甘蓝MLPK基因克隆及其突变体mlpk1 和mlpk2 的构建及测序
依据MLPK激酶结构域的分布，设计引物P1（5′-GAATTCGTGTCTGTCAGAACAAGCCCTC-3′，
下划单线为EcoRⅠ酶切位点）和P6（5′-CTCGAGTCAGCTATTATCACCTGTTGGACCG-3′，下划单
线为XhoⅠ酶切位点，下划双线为终止密码子），特异扩增MLPK激酶结构域编码区序列MLPKK。采
用PCR体外定点突变技术，根据引物设计原则，设计一对包含突变位点的互补引物（正、反向），构
建突变体。参照Murase等（2004）以及Kakita等（2007a）构建的突变体，将位于MLPK激酶结构域
中的第 112 位赖氨酸（Lys）突变为精氨酸（Arg），相对应地将基因中的碱基A突变为G，设计含突
变位点的互补引物P2（5′-TGTTGAGTCTTCTGACAGCAATAAC-3′）和P3（5′-AATGGTTATT
GCTGTCAGAAGACTC-3′），构建的突变体命名为 mlpk1；将位于 MLPK 激酶结构域中的第 194 位
甘氨酸（Gly）突变为精氨酸（Arg），相对应地将基因中的碱基 G 突变为 C，设计含突变位点的互
补引物 P4（5′-TGTGAAGAAAAGCTAGACGTTTCGC-3′）和 P5（5′-CGAAACGTCTAGCTTTTCTTCA
CAG-3′），构建的突变体命名为 mlpk2。
以本实验室保存的 MLPK cDNA（刘豫东，2014）为模板，P1/P6 为引物，扩增 MLPKK序列，
PCR 反应体系参照 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 说明书，PCR 反应条件为 98 ℃热变性 1 min
后，进入以下循环：98 ℃ 20 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35 个循环后，72 ℃延伸 10 min。突变
体 mlpk1 的构建，首先分别以 P1/P2、P3/P6 为引物，扩增两个基因片段，经琼脂糖凝胶电泳后，共
同进行回收纯化，然后取 6.5 μL 回收的混合基因片段，加入 6 μL 的 PrimeSTAR，以上述 PCR 反应
条件进行 15 个循环，目的是将两个基因片段进行连接，最后以连接的基因片段为模板，P1/P6 为引
物，采用上述 PCR 反应体系和条件，扩增所需突变基因 mlpk1。以相同的方法构建突变体 mlpk2。
PCR 扩增产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的条带，连接克隆载体 pEASY-Blunt，转化
大肠杆菌感受态 DH5α，通过蓝白斑筛选挑取白色阳性菌落，经 PCR 验证阳性克隆后送华大基因公
司测序。
1.3 表达质粒的构建和诱导表达
MLPKK、mlpk1 和 mlpk2 编码序列经 EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后，分别亚克隆至 pET43.1a 载体，构
建重组表达质粒，经菌液 PCR 和 EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定后，检测正确的即为构建成功的表达质
粒，分别命名为 pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2。
将上述重组表达质粒及空载体 pET43.1a 转化表达宿主菌 BL21（DE3）。将构建的表达菌株在含
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氨苄青霉素的 LB（luria-bertani）平板上划线，次日挑取单克隆菌落接种于 LB 培养液中，37 ℃过
夜培养后，按 1∶100 扩大培养，当 OD600 在 0.6 ~ 0.8 时加入 IPTG。设 IPTG 浓度为 0.6、0.8 和 1.0
mmol · L-1，诱导温度为 22、26 和 30 ℃，两因素三水平交叉分组设计，即 9 个组合处理，200 r · min-1
振荡培养 4 h，对 pET43.1a-MLPKK的诱导表达条件进行筛选。收集表达菌进行 12% SDS-PAGE 电
泳，用于检测重组蛋白表达。
1.4 重组蛋白的纯化
采用筛选出的诱导条件诱导表达目的蛋白，分别采用超声破碎法和冻融法进行细胞裂解，进行
重组蛋白纯化。取 pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2 的表达菌液各 2 管，每管
20 mL，4 ℃下 3 300 r · min-1 离心 10 min 收集细胞，采用不同的方法进行细胞裂解。一管中的表达
菌重悬于 2 mL 蛋白提取液（50 mmol · L-1 羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.4，100 mmol · L-1 NaCl，5
mmol · L-1 MgCl2，5 mmol · L-1 MnCl2，1 mmol · L-1 DTT，0.1 mmol · L-1 EDTA，0.1% 曲拉通 X-100）
中，冰上超声破碎细胞；另一管中的表达菌采用反复冻融法裂解细胞，同样悬浮于 2 mL 蛋白提取
液中置 28 ℃摇床上摇 15 min。然后按照His 标签蛋白纯化试剂盒的说明进行蛋白纯化，最后用 50 μL
洗脱缓冲液洗脱蛋白，加入 13 μL 5×上样缓冲液，100 ℃煮沸 5 min。每样取 10 μL 进行 12%
SDS-PAGE 电泳，用于蛋白纯化检测。
1.5 柱头总蛋白的提取
将柱头置于研钵中加入液氮进行研磨，充分研磨后放入在液氮中预冷的 5 mL 离心管中，迅速
加入 2 mL 在冰上预冷的蛋白提取液，上下颠倒混匀后，放入冰中进行提取。设提取时间分别为 0.5、
1.0、1.5 和 2.0 h，以找出最适的提取时间。提取过程中，每隔几分钟颠倒离心管，以使蛋白充分提
取。每半小时取出部分提取液，12 000 r · min-1 离心 5 min，取 32 μL 上清液，加入 8 μL 5× 上样缓
冲液，100 ℃煮沸 5 min，进行电泳，检测柱头总蛋白提取效果。
1.6 MLPK互作蛋白分离与电泳检测
表达菌 pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2 采用最佳的细胞裂解方法进行裂
解后，加入 30 μL MagneHisTM Ni-Particles，混匀，室温孵育 2 min，用磁力架回收 Ni-Particles，用
纯化试剂盒中的清洗缓冲液（MagneHisTM Binding/Wash Buffer）清洗 5 次，中间换管 1 次，各管分
别加入 400 μL 柱头总蛋白提取液，轻轻混匀，4 ℃孵育 1.5 h，每隔 10 min 混匀 1 次，孵育结束后
用 400 μL 清洗缓冲液（50 mmol · L-1 羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.4，100 mmol · L-1 NaCl，5 mmol · L-1
MgCl2，5 mmol · L-1 MnCl2，1 mmol · L-1 DTT，0.1 mmol · L-1 EDTA，0.1%曲拉通 X-100）洗 5 次，
中间换管 1 次，最后用 45 μL 洗脱缓冲液洗脱蛋白，加入 12 μL 5×上样缓冲液，100 ℃煮沸 5 min，
进行 12% SDS-PAGE 电泳分析，找出甘蓝柱头中与蛋白 MLPK 相互作用的蛋白。
2 结果与分析
2.1 突变体mlpk1 和mlpk2 的构建与测序验证及表达质粒的构建与鉴定
利用在线工具 PROSITE（http：//www. expasy. org/ prosite）以及 InterProScan（http：//www. ebi.
ac. uk/ interpro/ scan. html）对 MLPKK 进行功能分析（图 1），本试验中所用的序列不包含膜定位序
列，包含 MLPK 激酶功能域序列，其中 40 ~ 72 位氨基酸是激酶 ATP 结合域，165 ~ 177 位氨基酸是

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丝氨酸/苏氨酸激酶活性域，具有其激酶活性。测序结果表明，MLPKK 序列为 600 bp，编码 200 个
氨基酸，无移码错位现象。突变体 mlpk1 的编码框由 A 突变成了 G，氨基酸由 Lys 突变成了 Arg，
突变体 mlpk2 的编码框由 G 突变成了 C，氨基酸由 Gly 突变成了 Arg，突变位点与预计一致，其他
核苷酸序列没有改变，序列及编码框正确，同 Murase 等（2004）以及 Kakita 等（2007a）构建的失
活突变体一致，失活突变体构建成功。
MLPKK、mlpk1 和 mlpk2 的克隆质粒由 EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后与经同样酶切的原核表达载体
pET43.1a 连接，重组质粒转化大肠杆菌感受态。经菌落 PCR 筛选出阳性克隆后提取质粒 pET43.1a-
MLPKK、pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2，分别用 EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，酶切产物经 1.0%琼脂
糖凝胶电泳，结果均可以得到大小约为 600 bp 的基因片段，与目的片段大小一致，说明 MLPKK以
及突变体 mlpk1、mlpk2 均已分别成功插入到载体中，并且插入的位点与预期相符，表达质粒构建成
功。



图 1 MLPKK 序列分析
单下划线部分为激酶 ATP 结合域；双下划线部分为丝氨酸/苏氨酸激酶活性域；
方框处氨基酸为突变位点。
Fig. 1 Amino acid sequence analysis of MLPKK
Amino acids with single underline are protein kinase ATP-binding region；Amino acids with double underline are
Serine/threonine protein kinase active-site；Amino acids with frames are mutation sites.

2.2 重组蛋白诱导表达和诱导条件优化
重组菌 pET43.1a-MLPKK 经 9 个诱导条件组合诱导表达，表达产物 SDS-PAGE 结果显示，与诱
导的空载体质粒 pET43.1a 和未诱导的样品相比，诱导表达后的各泳道多出 1 条带，大小约 86 kD，
其蛋白质相对分子质量与估计值相符，pET43.1a-MLPKK 融合蛋白诱导表达成功，并且在 9 个诱导
条件下融合蛋白的表达量均较高，表达量差异较小，表明 IPTG 浓度与诱导温度对 pET43.1a-MLPKK
的表达影响不大（图片未列出）。
所以采用 IPTG 浓度 0.6 mmol · L-1、温度 26 ℃的诱导条件对重组菌 pET43.1a-MLPKK、
pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2 进行诱导表达，表达产物电泳结果（图 2）显示，融合蛋白
pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2 与 pET43.1a-MLPKK 一样高量表达。因此，本试验选用 IPTG 诱
导浓度 0.6 mmol · L-1，诱导温度 26 ℃的诱导条件进行后续试验。
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2.3 重组蛋白的纯化与检测
采用上述优化体系进行诱导表达，pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2 的表达
菌分别采用反复冻融法和超声破碎法裂解细胞。裂解液经 His 标签蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白，
纯化产物 SDS-PAGE 结果（图 3）显示，均得到符合预期大小的特异蛋白带，但 3 种融合蛋白采用
反复冻融法纯化后，只有很少的蛋白被洗脱下来。表达菌经超声破碎法裂解，纯化后得到较高产量
的融合蛋白，仅有微量的杂蛋白，并且通过对比发现，同 3 种融合蛋白一同洗脱下来的杂蛋白条带
相同，因此对后续试验无影响。所以，融合蛋白 pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2
均采用超声破碎法裂解细胞后进行纯化。
图 2 IPTG 0.6 mmol · L-1 和 26 ℃诱导的融合蛋白
SDS-PAGE 电泳图谱
M：蛋白质相对分子质量标准；1：pET43.1a-MLPKK产物；
2：pET43.1a-mlpk1 产物；3： pET43.1a-mlpk2 产物；
4：空载体诱导对照。
Fig. 2 SDS-PAGE patterns of fusion protein under the condition
of IPTG 0.6 mmol · L-1 and 26 ℃
M：Protein molecular weight marker；1：Induced products of
pET43.1a-MLPKK；2：Induced products of pET43.1a-mlpk1；
3：Induced products of pET43.1a-mlpk2；
4：Induced products of pET43.1a.
图 3 融合蛋白不同纯化条件的 SDS-PAGE 电泳图谱
M：蛋白质相对分子质量标准；1、3、5：反复冻融法
pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1和pET43.1a-mlpk2的纯化产物；
2、4、6：超声破碎法 pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1 和
pET43.1a-mlpk2 纯化产物。
Fig. 3 SDS-PAGE patterns of selection on fusion protein
purification condition
M：Protein molecular weight marker；1，3，5：Purification of
pET43.1a-MLPKK，pET43.1a-mlpk1 and pET43.1a-mlpk2 by
ultrasonication；2，4，6：Purification of pET43.1a-MLPKK，
pET43.1a-mlpk1 and pET43.1a-mlpk2
by repeated freeze-thaw method.

2.4 柱头总蛋白的提取检测
图 4 不同提取时间的柱头总蛋白提取结果
Fig. 4 The extraction results of total stigma proteins under the
condition of different extraction time
柱头充分研磨后迅速加入蛋白提取液，颠倒
混匀，于冰上进行蛋白提取，每隔半小时取样 1
次，共取样 4 次。
样品经 SDS-PAGE 显示（图 4），每个泳道均
有相对分子质量不等的蛋白条带，条带分散均匀
且蛋白质量较小的条带也较明显，蛋白提取效果
较好，说明配制的蛋白提取液适合柱头总蛋白的
提取，提取的柱头总蛋白可用于进行后续试验。
通过比较，各泳道的蛋白量差异较小，但随着提
取时间的延长蛋白产量有一定的提高。为了保持
提取蛋白的活性和防止蛋白降解，选用 1.0 h 作为
蛋白提取时间。

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2.5 MLPK互作蛋白分离与电泳检测
Murase 等（2004）以及 Kakita 等（2007a）
的研究表明，将位于 MLPK 激酶结构域中的第
112 位 Lys 突变为 Arg 或者将第 194 位 Gly 突变
为 Arg，mlpk/mlpk 突变体均丧失激酶活性。本试
验也将构建的这两种失活突变体作为分离 MLPK
互作蛋白的阴性对照，具有激酶活性的融合蛋白
能够与其互作的蛋白结合，从而一起被洗脱下来，
而构建的突变体因不具有激酶活性，则不能与其
互 作 蛋 白 结 合 。 纯 化 得 到 的 融 合 蛋 白
pET43.1a-MLPK

图 5 授粉 30 min 柱头总蛋白与融合蛋白相互作用的
SDS-PAGE 分析
M：蛋白质相对分子质量标准；1：pET43.1a-mlpk1 与柱头总蛋白
孵育产物；2：pET43.1a-mlpk2 与柱头总蛋白孵育产物；
3：pET43.1a-MLPKK 与柱头总蛋白孵育产物。
箭头：增多的蛋白条带。
Fig. 5 SDS-PAGE analysis of interaction of pollinated stigma
protein with fusion protein
M：Protein molecular weight marker；1：Pollinated stigma protein was
incubated with purified pET43.1a-mlpk1；2：Pollinated stigma protein
was incubated with purified pET43.1a-mlpk2；3：Pollinated stigma
protein was incubated with purified pET43.1a-MLPKK.
Arrow：Increased protein bands.
K、pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-
mlpk2 分别与自花授粉 30 min 的柱头总蛋白提取
液进行孵育，结束后进行蛋白清洗，用洗脱液洗
脱蛋白后电泳，两个激酶活性失活突变体（图 5，
泳道 1 和泳道 2）条带完全一致。与这两个激酶
活性失活突变体的泳道对比，在pET43.1a-MLPKK
与自花授粉 30 min 的柱头总蛋白提取液孵育的
泳道中 29.0 ~ 44.3 kD 处明显多出 4 条蛋白条带
（图 5，泳道 3 箭头所示），由于 pET43.1a-MLPKK
与 pET43.1a-mlpk1和 pET43.1a-mlpk2对比仅存在
激酶活性有无的差异，由此说明这 4 条差异的蛋
白条带可能依赖于 MLPK 的激酶活性而与 pET43.1a-MLPKK 结合形成稳定的复合体而被洗脱下来，
表明成功获得了 MLPK 互作蛋白的候选条带。
3 讨论
对于甘蓝等芸薹属作物的自交不亲和信号传导过程，早期人们普遍认为，柱头内的信号是沿着
SRK-ARC1-Exo70A1 途径传递，最终实现 SI反应。然而在自交不亲和的 Brassica napus 和 Arabidopsis
lyrata 中，分别通过反义抑制和 RNAi 技术抑制 ARC1 基因的表达，均只能部分打破材料的不亲和性
（Stone et al.，1999；Indriolo et al.，2012）。这种现象有可能是残余的 ARC1 造成的，但也不能排除
柱头内可能存在其他的未知信号元件与 ARC1 共同参与传递自交不亲和信号。同时在 B. napus 柱头
中过量表达亲和因子 Exo70A1，也不能使材料完全丧失自交不亲和性（Samuel et al.，2009）。这些
结果表明，ARC1-Exo70A1 组成的信号通路可能只是 SRK 下游信号传导途径的一个分支，在芸薹属
作物中还存在其他未知信号元件和信号分支与 ARC1-Exo70A1 共同参与下游信号传导过程（Goring
et al.，2014）。此外，在原本自交亲和的拟南芥中仅仅转入来自 A. lyrata 的 SRK-SCR 基因后，材料
表现出自交不亲和性，并不需要 ARC1 的参与（Nasrallah et al.，2004；Boggs et al.，2009；Tsuchimatsu
et al.，2010；Goring et al.，2014；Indriolo et al.，2014；Nasrallah & Nasrallah，2014），且在转基因
拟南芥（C24：SRK-SCR）中过量表达 Exo70A1 不能降低材料的不亲和性（Kitashiba et al.，2011），
进一步表明 SRK 下游存在 ARC1-Exo70A1 之外的信号元件和信号分支。但至今对 SRK 的互作蛋白
刘晓欢，高启国，施松梅，蒲全明，毕云龙，张 莹，朱利泉，王小佳.
甘蓝 MLPK 的原核表达及其互作蛋白分离体系的建立.
园艺学报，2015，42 (12)：2412–2420. 2419
进行了至少 3 次的筛选，分离了 THL1、THL2、ARC1、钙调蛋白、KAPP 和 SNX1 共 6 个互作蛋白，
但仅有 ARC1 直接参与了 SRK 下游信号传导（Ivanov et al.，2010）。
现已证明 MLPK 是 SI 反应的正向调控关键元件（Murase et al.，2004），与 SRK 一样，其突变
或缺失将导致材料自交不亲和性的彻底丧失（Murase et al.，2004；Kakita et al.，2007b）。BiFC 分析
显示，MLPK 在细胞膜上直接与 SRK 作用传递 SI 信号（Kakita et al.，2007b）。另外，MLPK 同 SRK
一样，也能够有效地磷酸化 ARC1，并且与 ARC1 在烟草 BY-2 细胞中瞬时共表达会改变 ARC1 的
亚细胞定位，表明 MLPK 能够利用 ARC1 作为下游的胞内目标（Samuel et al.，2008）。显然，MLPK
在自交不亲和信号传递过程中扮演着重要的角色，然而其作用机制至今仍不清楚（Kitashiba et al.，
2011）。因此，在对 SRK 深入研究而未找出新的信号元件的前提下，通过分离 MLPK 互作蛋白成了
获取 SI 信号传递过程中的其他未知信号元件的新的研究切入点。
酵母双杂交结合文库筛选是一种被用来研究蛋白质互作的有效技术。但 Kakita 等（2007a）研
究表明，应用传统的 GAL4-pGADT7 酵母双杂交系统和断裂—泛素为基础的酵母双杂交系统均未检
测到 MLPK 与 SRK 间的相互作用。Samuel 等（2008）用 LexA-VP16 酵母双杂交系统检测 MLPK
与 ARC1 间的相互作用，同样没有检测到互作现象。作者也曾试图利用酵母双杂交结合文库筛选的
方法来分离甘蓝MLPK互作蛋白，但是在构建诱饵蛋白的过程中，无论是用 pGBKT7还是用pGADT7
质粒来表达 MLPK 蛋白，均不能检测到甘蓝 MLPK 与 SRK、MLPK 与 ARC1 间的作用。表明酵母
双杂交系统并不适用于检测 MLPK 与蛋白间的相互作用，同样也不适用于分离 MLPK 的互作蛋白。
因此，本试验中采用体外表达的 MLPK 蛋白与自交不亲和甘蓝柱头总蛋白提取液进行孵育，钓取
MLPK 的互作蛋白。扩增了 MLPK 激酶功能域 MLPKK，包含其激酶 ATP 结合域和丝氨酸/苏氨酸激
酶活性域，所以所用片段具有激酶活性。首先采用 PCR 技术扩增了 MLPK 激酶功能域编码序列
MLPKK，通过体外定点突变技术构建了两种 MLPK 失活突变体，分别为 mlpk1 和 mlpk2，然后对
MLPKK 和突变体进行了原核表达和纯化。依据免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用的原理，本试验应
用突变体分析并利用 pET43.1a-MLPKK融合蛋白序列中的 6× His 标签与 Ni+结合的特性，探索并建
立体外分离互作蛋白的新方法。将 pET43.1a-MLPKK、pET43.1a-mlpk1 和 pET43.1a-mlpk2 融合蛋白
分别与 Ni+结合，结合后的复合物作为“诱饵蛋白”，分别与开花当天自花授粉 30 min 甘蓝柱头总蛋
白提取液在 4 ℃条件下进行孵育钓取 MLPK 的互作蛋白，柱头中与 MLPK 互作的蛋白能够和
pET43.1a-MLPKK 融合蛋白结合形成复合体而被洗脱下来。孵育产物经 SDS-PAGE 电泳，泳道对比
显示，pET43.1a-MLPKK 的泳道比两个突变体泳道多出 4 条新的蛋白条带，条带清楚，得到了理想
的结果，成功获得了候选的 MLPK 互作蛋白条带，这也说明探索建立的 MLPK 互作蛋白分离体系
的方法是可行的。
本研究结果为进一步鉴定MLPK互作蛋白提供了明确的目标，今后将对差异条带进行质谱鉴定、
互作确认和蛋白功能解释，以期为自交不亲和信号的传导提供新内容，同时也可以为研究蛋白质间
相互作用提供新的方法和思路。

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