全 文 ：园艺学报，2015，42 (11)：2229–2236.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0252；http：//www. ahs. ac. cn 2229
收稿日期：2015–06–25；修回日期：2015–11–17
基金项目：中国农业科学院院所基金项目（1610092015002-01）；国家‘863’计划项目（2011AA10020703）；国家公益性行业（农业）
科研专项（201203071）；中国农业科学院科技创新工程项目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangxiuxin@caas.cn）
牡丹隐花色素基因 PsCRY2 的克隆与表达分析
任秀霞，王顺利，薛璟祺，朱富勇，刘传娇，张秀新*
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 100081）
摘 要：以‘秋发 1 号’和‘洛阳红’牡丹（Paeonia suffruticosa）为试验材料，采用 RT-PCR 的方
法从花芽中克隆得到 1 个隐花色素基因 Cryptochrome 2，其 ORF 全长为 1 902 bp，编码 633 个氨基酸，基
因登录号为 KP982893。序列比对和结构域分析表明，此蛋白包含 1 个 PHR 和 1 个 CCT 结构域，与拟南
芥中 AtCRY2 最为相似，将其命名为 PsCRY2。系统进化树分析表明，PsCRY2 与甜橙（Citrus sinensis）
CsCRY2 亲缘关系最近。实时荧光定量 PCR 表明，PsCRY2 在牡丹的不同组织器官中均有表达。其中，成
年植株的花芽以及种子胚的表达量最高，幼苗根、茎、叶次之。在整个花芽分化不同时期，PsCRY2 的表
达呈现较高的表达水平；在花蕾发育不同时期，PsCRY2 的表达呈现先降低再升高而后有降低的趋势，大
风铃期表达量最高，推测 PsCRY2 在花芽分化和花蕾发育的过程中均起到重要作用。在‘洛阳红’和‘秋
发 1 号’牡丹春季花芽发育过程中，PsCRY2 的表达均呈升高的趋势，‘秋发 1 号’显著高于‘洛阳红’。
不同光周期条件下，PsCRY2 表达稍有不同。与长日照条件相比，短日照条件下 PsCRY2 在现蕾期和小风
铃期的表达量均下降。
关键词：牡丹；光周期途径；隐花色素；PsCRY2；实时荧光定量 PCR
中图分类号：S 685.11 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）11-2229-08

Molecular Cloning and Expression Analysis of Cryptochrome Gene PsCRY2
in Tree Peony
REN Xiu-xia，WANG Shun-li，XUE Jing-qi，ZHU Fu-yong，LIU Chuan-jiao，and ZHANG Xiu-xin*
（Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agriculture，P. R. China，
Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081，China）
Abstract：Cryptochrome 2（CRY2）was isolated from Paeonia suffruticosa by RT-PCR. The full open
reading fragment（ORF）length of PsCRY2 encoding 633 amino acids was 1 902 bp，and the GenBank No.
was KP982893. Sequence alignment and motif analysis showed that the deduced amino acids contained a
PHR domain near the amino terminus and a CCT domain near the carboxy terminus. It was designated as
PsCRY2，according to its high identity with AtCRY2 in Arabidopsis. Phylogenetic analysis showed that it
had close relationship with Citrus sinensis. Gene expression analysis revealed that the highest expression
levels of PsCRY2 were appeared in the bud and seed embryo of P. suffruticosa，followed by root，stem and
leaves. The expression of PsCRY2 in the whole process of bud differentiation was high. While the
expression of PsCRY2 was low in the early stage of bud development and quite high in the middle and late

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Molecular cloning and expression analysis of cryptochrome gene PsCRY2 in tree peony.
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stage. The expression of PsCRY2 reached a peak in big bell-like flower-bud. The results suggested that
PsCRY2 play an important role both in the process of bud differentiation and bud development. The
expression patterns of PsCRY2 in the bud of‘Luoyanghong’and‘Qiufa 1’were similar，while the
expression level of PsCRY2 in the bud of‘Qiufa 1’was significantly higher than that in the bud of
‘Luoyanghong’. The expression patterns of PsCRY2 in the buds with different photoperiod treatments
were different. The expression of PsCRY2 decreased in bud sprouting and small bell-like flower bud under
short day photoperiod，compared with that in long day photoperiod.
Key words：tree peony；photoperiod pathway；cryptochromes；PsCRY2；qRT-PCR

光照对牡丹（Paeonia suffruticosa）成花质量具有重要的影响（李嘉珏，1999）。光周期途径
（Photoperiod pathway）是亲缘关系较远的植物中最保守的开花响应途径，它通过整合光照和生物
钟等信号决定植株开花时间（杨修勤 等，2013）。在光周期反应中，光信号的接收和传递由光受体
完成。Cryptochromes 2（CRY2）是光周期途径中的一个蓝光/紫外光受体，属于黄素蛋白的一个亚
家族（Cashmore et al.，1999；Lin，2002；Yasushi & Weigel，2007），它主要参与光形态建成以及光
周期调控开花。目前，在苔藓、蕨类、番茄、豌豆和水稻等植物以及果蝇、小鼠等动物中均分离得
到了隐花色素基因（Liu et al.，2011）。然而在牡丹中却没有相关基因的报道。因此，克隆牡丹 CRY2
同源基因不仅有助于揭示牡丹成花遗传机理，还可为牡丹花期调控提供理论依据。
本研究中从牡丹中克隆得到了 CRY2 同源基因 PsCRY2，并采用实时荧光定量 PCR 探讨了该基
因在‘秋发 1 号’牡丹不同器官、花芽分化及花蕾发育不同时期和不同光周期条件下的表达模式，
还比较了该基因在‘洛阳红’与‘秋发 1 号’牡丹花蕾发育不同时期的表达模式，为进一步研究
PsCRY2 同源基因的功能及其在成花诱导中的作用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的可以在秋季二次开花的牡丹新材料‘秋发 1 号’（张
秀新 等，2005）和常规栽培品种‘洛阳红’为试验材料。2014 年 3—10 月收取 5 年生‘洛阳红’
不同时期的花蕾（花苞）以及 5 年生‘秋发 1 号’牡丹在春季成花和秋季成花过程中不同发育时期
的花芽、花蕾和花苞；2014 年 8 月收取经自然授粉得到的成熟度一致饱满的‘秋发 1 号’牡丹种子，
一部分用手术刀快速取出其中的胚，用于组织器官表达分析，另一部分播种于育苗钵中，萌发出苗
后，将幼苗培养于日光温室（温度 15 ~ 28 ℃），2015 年 3 月取幼苗的根、茎和叶。上述所有样品经
液氮速冻后保存于–80 ℃冰箱中备用。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA的提取及 cDNA的合成
‘秋发 1 号’牡丹根、茎、叶和花芽以及‘洛阳红’花芽总 RNA 的提取和质量标准参照刘传
娇等（2014）和 Wang 等（2014）的方法进行，‘秋发 1 号’牡丹胚总 RNA 的提取采用 Trizol 法，
具体步骤参照 Li 等（2010）的文献。选择上述高质量的 RNA 采用天根生化科技（北京）有限公司
FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒合成 cDNA 第一链。
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图 1 牡丹 PsCRY2 基因 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 PCR amplification result on agarose gel of PsCRY2
1.2.2 引物设计与 PCR反应体系
根据本实验室已克隆得到的 CRY2 基因的 3′和 5′的部分序列结果，利用 Primer 5.0 软件设计 1
对可以扩增 PsCRY2 完整开放读码框的正、反向引物。PsCRY2-1F：5′-TATTTCCTATCCATTTCG-3′；
PsCRY2-1R：5′-TTTCATTCTAATCAAGCAG-3′。以上述反转录的 cDNA 为模板进行 PCR 反应，反
应体系为 ddH2O 20.8 μL，10 × LA Taq buffer（Mg2+ Plus）3 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol · L-1 each）
3 μL，LA Taq（5 U · μL-1）0.2 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL。PCR 扩增条件为：94 ℃预变
性 4 min；94 ℃变性 1 min，48.2 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 2 min，共 35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
扩增产物经电泳检测、胶回收、连接转化、阳性克隆检测和基因测序等，最终获得 PsCRY2 基因序
列。
1.2.3 序列分析与系统进化树的构建
PsCRY2 序列翻译、蛋白分子量及基本理化性质、亚细胞定位预测、氨基酸序列比对、蛋白二
三级结构预测和系统进化树构建参照朱富勇等（2014）和张萍等（2014）的方法。利用 NetPhos 2.0
Server 在线工具（http：//www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/）预测磷酸化位点。
1.2.4 实时定量 PCR反应
根据实时定量 PCR 引物设计原则，重新设计了 1 对引物。qPsCRY2-1F：5′-CGTGCGAATAAAGC
AGATA-3′；qPsCRY2-1R：5′-GAAACAAAGGTATCGGGAG-3′。其扩增子的长度为 241 bp。内参选
择和 qRT-PCR 反应具体步骤参照王顺利等（2014）的方法。
2 结果与分析
2.1 牡丹 PsCRY2 基因 cDNA 全长的克隆与序列分析
以‘秋发 1 号’牡丹花芽的 cDNA 为模
板，克隆得到了 1 个 2 094 bp 大小的含有完整
开放读码框的 PsCRY2 序列（图 1），该基因编
码 633 个氨基酸。
核苷酸 NCBI blast 分析发现，克隆得到的
氨基酸序列与已克隆的 CRY2 同源蛋白具有较
高的同源性，将基因命名为 PsCRY2。利用
ExPaSy ProtParam 在线工具预测分子量为
72.46 kD，理论等电点为 5.81，属于亲水性蛋白。
2.2 牡丹 PsCRY2 编码氨基酸的同源性分析
选取甜橙（Citrus sinensis）和拟南芥（Arabidopsis thalina）的 CRY2 编码的氨基酸进行序列比对，
发现 PsCRY2 含有典型的 PHR 和 CCT 结构域，属于隐花色素基因家族。
进一步研究发现，PsCRY2 的氨基末端 PHR 结构域高度保守，包含 DNA photolyase 结构域和
FLAVINADENINEDINUCLEOTIDE（FAD）结合结构域；羧基末端保守性较低，但存在 3 个重要的
保守基序 DQXVP-acidic-STAES（DAS）。DAS 是识别隐花色素的一个很重要的标识（Lin & Shalitin，
2003），推测 PsCRY2 是具有生物功能的隐花色素类似基因。通过在线工具 NetPhos 2.0 Server 预测
发现 PsCRY2 羧基末端延伸区富含有磷酸化位点。另外，在 PsCRY2 羧基末端（图 3）还具有核定
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位信号序列（Nuclear localization signal，NLS），推测 PsCRY2 蛋白位于细胞核内，这与亚细胞定位
预测结果一致。

图 2 PsCRY2 基因的推导氨基酸序列与其他植物 CRY2 蛋白的多序列比对
黑色箭头：PHR 区域；粉色箭头：CCT 区域；红色框：DNA photolyase；蓝色框：FAD binding；橙色框：D（DQXVP）；
绿色框：A（Acidic）；紫色框：S（STAES）。
Fig. 2 Alignments of the deduced amino acid sequence of PsCRY2 with other CRY2 proteins from plants
The black and pink arrows indicate the regions of PHR and CCT domain respectively；Conserved domains（DNA photolyase，
FAD binding，DQXVP，Acidic and STAES domain）were marked with red，
blue，orange，green and purple box respectively.






图 3 PsCRY2 蛋白中核定位信号序列组成
Fig. 3 Composition of the bipartite nuclear localization signal（NLS）of PsCRY2

采用在线工具（http：//www. predict protein. org）预测 PsCRY2 蛋白二级结构，发现 PsCRY2 中
α–螺旋占 40.6%，β–折叠占 9.79%，延伸链占 15.48%，无规卷曲占 34.12%。利用 SWISS-MODEL
工具预测 PsCRY2 和 AtCRY2 蛋白的三级结构，结果表明两者 PHR 区三级结构相似，都是由多个螺
旋和 β 折叠共同构成的复杂结构，与以上二级结构的预测一致。在拟南芥中，CRY2 基因在光周期
调控开花过程中具有重要作用（Guo et al.，1998）。因此，结合 PsCRY2 蛋白的结构、理化性质、关
键位点以及三级结构的分析，推断 PsCRY2 可能调控牡丹开花。
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图 5 PsCRY2 在‘秋发 1 号’牡丹幼苗的根、茎、叶和
成年植株花芽、种子胚中的表达分析
a、b、c 表示在 P ≤ 0.05 水平上差异显著，下同。
Fig. 5 Expression analysis of PsCRY2 gene in seedling root，
seedling stem，seedling leaf，adult plant bud and seed
embryo in tree peony by qRT-PCR
a，b，c indicate significant difference at 0.05 level. The same below.
2.3 牡丹 PsCRY2 系统进化分析
为了探讨牡丹 PsCRY2 与来自拟南芥中的 CRY2 基因家族的关系，并进一步探讨牡丹与其他物
种 CRY2 的系统进化关系，利用拟南芥中的 3 个 CRY2 类似蛋白以及来自其它物种的 10 个 CRY 类
似蛋白与 PsCRY2 构建了系统进化树。结果表明：PsCRY2 与 CRY2 聚为一枝（图 4），这也证明了
克隆得到的 CRY 类似基因命名为 PsCRY2 的合理性；牡丹 PsCRY2 与甜橙（Citrus sinensis）CsCRY2
蛋白亲缘关系最近，而与单子叶植物水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum astivum）以及山羊草（Aegilops
tauschii）CRY2 蛋白亲缘关系最远（图 4）。

图 4 牡丹 PsCRY2 与拟南芥隐花色素蛋白以及其他物种 CRY2 蛋白的系统进化分析
自展值（1 ~ 1 000）标记各个节点。
Fig. 4 Phylogenetic relationship analysis among CRY2 proteins and Arabidopsis cryptochrome proteins
Boot-strap values from 1 000-replicates were indicated at each node.

2.4 PsCRY2 在牡丹不同组织器官和不同发育时期花芽中的表达分析
PsCRY2 在牡丹种子胚、幼苗根、茎、叶
和成年植株花芽中都有表达，但表达量存在一
定的差异（图 5）。在幼苗根、茎和叶中的表达
量低，成年植株花芽和种子胚中较高。推测
PsCRY2 在花芽和胚中发挥作用。
PsCRY2 在从苞片原基形成至雌蕊原基分
化完成均呈现较高的表达水平；在花蕾发育不
同时期呈现先降低再升高而后又降低的趋势，
在跳蕾期的花蕾中表达量最低。从整体来看，
PsCRY2 不仅在花芽分化的整个过程表达量比
较高，还在花蕾发育的小风铃期至平桃期达到
一个更高的水平（图 6），推测 PsCRY2 不仅在
启动花芽分化以及花芽分化的过程中起到一定
的作用，而且在花蕾发育的过程也起到重要的
作用。
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图 7 牡丹春季花蕾中的表达
a’、b’ 表示‘洛阳红’与‘秋发 1 号’在 P ≤ 0.05 水平
上的差异显著性；a、b 表示不同发育期在
P ≤ 0.05 水平上的差异显著性。
Fig. 7 Expression analysis PsCRY2 in bud of tree peony in spring
a’，b’ indicate significant difference between the expressions in the
buds of Luoyanghong and Qiufa 1 at 0.05 level；a，b indicate
significant difference between the expressions in the buds of
different developmental buds at 0.05 level.
图 8 在春季和秋季日照条件下，PsCRY2 在‘秋发 1 号’
牡丹花芽中的表达分析
a’、b’ 表示春季和秋季在 P ≤ 0.05 水平上的差异显著性；a、b
表示不同发育期在 P ≤ 0.05 水平上的差异显著性。
Fig. 8 Expression analysis PsCRY2 gene in bud of tree peony
under spring and autumn conditions
a’，b’ indicate significant difference between the expressions in the
buds under spring and autumn conditions at 0.05 level，a，b indicate
significant difference between the expressions in the buds of
different developmental buds at 0.05 level.

图 6 PsCRY2 在‘秋发 1 号’牡丹花芽分化及花蕾发育不同时期的表达分析
A：未分化；B：苞片原基分化期；C：萼片原基分化期；D：花瓣原基分化期；E：雄蕊原基分化期；F：雌蕊原基分化期
G：膨大期；H：现蕾期；I：跳蕾期；J：立蕾期；K：小风铃期；L：大风铃期；M：平桃期；N：破绽期。
Fig. 6 Expression pattern analysis of PsCRY2 gene in different developmental buds
A：Undifferentiation；B：Bract primordium phase；C：Sepal primordium phase；D：Petal primordium phase；E：Stamen Primordium phase；
F：Pistil primordium phase；G：Bud swelling；H：Bud sprouting；I：Leaflet emerging；J：Flower bud emerging phase；K：Small bell-like flower
bud；L：Big bell-like flower-bud；M：Bell-like flower-bud extending；N：Color exposing.

2.5 PsCRY2 在‘洛阳红’和‘秋发 1 号’牡丹春季花芽中的表达分析
对比‘洛阳红’和‘秋发 1 号’牡丹春季花芽中 PsCRY2 的表达模式发现，在花蕾发育的过程
中，PsCRY2 的表达均呈升高的趋势，‘秋发 1号’牡丹春季花芽的表达量显著高于‘洛阳红’（图 7）。
2.6 PsCRY2 在不同光周期条件下的表达分析
秋季短日照条件下，‘秋发 1 号’牡丹 PsCRY2 在现蕾期和小风铃期的表达量均低于春季，而在
膨大期的表达量与春季相似（图 8）。因此，不同光周期对 PsCRY2 的表达有一定的影响，特别是花
蕾发育后期。

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3 讨论
本研究中从‘秋发 1 号’牡丹花芽中克隆得到了 PsCRY2 全长 CDS 序列，氨基酸序列分析发现：
PsCRY2 含有与拟南芥 AtCRY2 相似的两个功能域，即氨基末端的 PHR 区域和羧基末端的 CCT 区
域，这表明该基因确属 CRY2 同源基因。进化分析表明，PsCRY2 在进化过程中具有较高的保守性。
PsCRY2 在‘秋发 1 号’牡丹各组织中的表达存在差异，这与拟南芥、茶、甘蓝型油菜、苹果
和水稻中 CRY2 的表达类似（Tóth et al.，2001；Platten et al.，2005；Chatterjee et al.，2006；Hirose
et al.，2006；毛柯，2012）。牡丹花芽中高表达的 PsCRY2 可能会影响花芽分化；胚中高表达的 PsCRY2
可能与种子发育、萌发等相关。PsCRY2 在‘洛阳红’和‘秋发 1 号’牡丹春季花芽中的表达分析
表明：二者均呈升高的趋势，反映了 PsCRY2 在牡丹中表达模式的共性；然而其在‘秋发 1 号’牡
丹中的表达量高于‘洛阳红’，表明 PsCRY2 在秋发牡丹和非秋发牡丹中表达又存在一定的差异。
不同光周期研究发现，春季长日照条件可以促进 PsCRY2 的表达，PsCRY2 表达的高低可能会影响牡
丹成花质量。进一步揭示了尽管‘秋发 1 号’牡丹可以在秋季开花，但成花质量比春季差的原因，
即可能是由于秋季 PsCRY2 表达量低引起的。因此这一研究也为促成栽培过程中通过补光来延长光
照时间最终提高牡丹成花率提供了科学依据。总之，牡丹光周期途径中的 CRY2 基因的成功克隆，
为进一步研究牡丹开花诱导途径的遗传机理奠定了理论基础。

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