全 文 ：园艺学报，2015，42 (6)：1129–1138.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0999；http：//www. ahs. ac. cn 1129
收稿日期：2015–01–16；修回日期：2015–04–23
基金项目：浙江省花卉新品种选育重大科技专项重点项目（2012C12909-14）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gaoyanhui408@126.com）
石蒜属植物实时荧光定量 PCR 内参基因的选择
蒋婷婷，高燕会*，童再康
（浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江临安 311300）
摘 要：以石蒜属植物换锦花（Lycoris sprengeri）、石蒜（Lycoris radiata）和中国石蒜（Lycoris chinensis
Traub）不同组织器官、不同花发育时期以及不同杂交种的幼小鳞茎为研究材料，利用 qRT-PCR 技术检测
Actin、EF-1α、GAPDH、5S rRNA、Ubiquitin 和 β-Tubulin 等 6 个内参基因的 mRNA 表达情况，利用 geNorm、
NormFinder、BestKeeper 和 Reffinder 软件综合评价 6 个内参基因的表达稳定性。结果表明，石蒜属植物
种间和种内内参基因表达差异明显，在分析换锦花不同组织基因表达时可选用 β-Tubulin、Actin 和 GAPDH
作为内参基因，分析不同花期的基因表达时宜选用 5S rRNA、EF-1α、Actin 和 β-Tubulin 作内参基因。中
国石蒜不同组织最合适的内参基因是 5S rRNA、Ubiquitin、EF-1α和 β-Tubulin，而不同花期最合适的内参
基因则是 Ubiquitin、β-Tubulin。分析石蒜不同组织间基因表达的适宜内参基因是 β-Tubulin 和 5S rRNA，
不同花期为 Ubiquitin、β-Tubulin 以及 5S rRNA。不同杂交种鳞茎适宜内参基因为 β-Tubulin 和 Actin。
关键词：石蒜属；实时荧光定量 PCR；内参基因
中图分类号：S 682 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）06-1129-10

Selection of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR in Lycoris
JIANG Ting-ting，GAO Yan-hui*，and TONG Zai-kang
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang Agriculture and Forestry
University，Lin’an，Zhejiang 311300，China）
Abstract：Different species，different tissues，different development periods of flowers and different
hybrids of bulb of Lycoris Herb were taken as materials in this study. The mRNA expression of six
housekeeping genes such as Actin，EF-1α，GAPDH，5S rRNA，Ubiquitin and β-Tubulin was detected by
qRT-PCR. The stability of expression of the six reference genes were evaluated by geNorm，NormFinder，
BestKeeper and Reffinder respectively. The results showed that mRNA expression of the reference genes
had significant differences during the species and intraspecific in Lycoris. When analyzing the mRNA
expression of different organs in Lycoris sprengeri，β-Tubulin，Actin and GAPDH could be reference genes.
In the meantime，5S rRNA，EF-1α，Actin and β-Tubulin could be uesed as reference genes in different
development periods of flowers. However，5S rRNA，Ubiquitin，EF-1α and β-Tubulin were best choices
in different organs of Lycoris chinensis Traub. Meanwhile，Ubiquitin，β-Tubulin were suitable reference
genes in different florescence. For Lycoris radiata，the stable mRNA expression in different organs
β-Tubulin and 5S rRNA were appropriate，and Ubiquitin，β-Tubulin and 5S rRNA should be chosen in

Jiang Ting-ting，Gao Yan-hui，Tong Zai-kang.
Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in Lycoris.
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different florescence. While β-Tubulin and Actin should be apply as the reference in different hybrids bulbs.
All these results will provide appropriate reference genes for further study，help achieve standardization，
decrease experimental errors and increase the reliability of experimental results.
Key words：Lycoris；quantitative real-time PCR；reference gene

石蒜属（Lycoris）植物为多年生草本，包括石蒜、中国石蒜、换锦花、长筒石蒜、稻草石蒜等；
其花形态各异，有反卷、褶皱，有宽瓣、窄瓣；色彩斑斓，有红花品系、黄花品系、白花品系以及
复杂色品系，且乳白石蒜杂交种中出现的各种杂色条带，更为石蒜属花色改良提供了宝贵的资源，
现广泛用于园林造景；同时，石蒜属种球蕴含丰富的生物碱，可用于治疗阿尔茨海默症以及乳腺癌，
多年来引起广泛关注。但对石蒜属的研究一直进展缓慢，一方面由于其本身生长周期较长，从播种
到开花一般需要 4 ~ 5 年；另一方面，石蒜属种间及种内花色、形态均有较大差异，不同无性系之
间在基因表达上也有一定差异。由于花色和花期一直是观赏类植物研究的热点，而石蒜属植物花色
调节和花期调控在分子水平研究较少，主要依靠传统的杂交选育、无性系繁殖，以及对种质资源的
生理研究，但对石蒜属植物的花色调节和花期调控一直没有重大突破，因此理清石蒜属植物的花色
形成和花期调控的整个代谢网络，摸索各条件下 mRNA 的转录时空以及转录后基因的表达调控，是
当前首要任务。
荧光定量 PCR 是一种高通量且高效的生物技术，主要是利用高质量的 RNA 逆转录成 cDNA，
再通过检测 cDNA 的丰度来确定基因的表达量，可分为绝对定量和相对定量两种方法。对于相对定
量来说，通过标准化可减少样品之间和样品内部的差异，因此必须引入内参基因，此类基因一般为
拷贝数高，表达较为稳定的 Actin 看家基因（黄春红 等，2013）。但近年来大量的研究结果表明，
并没有表达绝对稳定的基因，任何一种看家基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或试验因
素作用下的恒定，不同的试验条件造成的荧光定量 PCR 的结果迥异，有时甚至会得出相反的结论
（Dheda et al.，2005；Zhu et al.，2008）。随着对定量分析要求的不断提高，寻求新的内参基因或同
时使用几个内参基因，是解决单一传统内参基因弊端的有效策略。
本试验中选取的 6 个内参基因（Valeria et al.，2009；Zhou et al.，2010；Zhu et al.，2013），包
括肌动蛋白基因 Actin、转录延伸因子基因 EF-1α、甘油醛–3–磷酸脱氢酶基因 GAPDH、微管蛋白
基因 β-Tubulin、多聚泛素蛋白基因 Ubiquitin、核糖体 5S rRNA，均为传统的看家基因，它们本身拷
贝数高，在不同器官、组织或者细胞中组成型表达，具有相当的保守性，表达水平较为一致，期望
通过对这些内参基因的检测和选择，为石蒜属植物的基因克隆和荧光定量 PCR 分析研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料选取
所用的试验材料石蒜属植物换锦花（Lycoris sprengeri）、石蒜（Lycoris radiata）和中国石蒜
（Lycoris chinensis Traub）种植于浙江农林大学遗传学科石蒜属植物种质资源圃。于 2013 年 7—9
月分别选取不同花期（花苞期、初花期、盛花期、败花期），不同组织器官（根、花葶、叶、鳞茎）
以及同一生长时期的长约 1 ~ 1.5 cm 的杂交种幼小鳞茎（石蒜♀ × 中国石蒜♂、换锦花♀ × 石蒜
♂、换锦花♀ × 长筒石蒜♂、中国石蒜♀ × 换锦花♂）共 28 个样品。
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1.2 引物设计
根据本课题组对换锦花花的转录组测序结果，以及前人（Michael et al.，2008）的研究，本研究
中选择 Actin、EF-1α、GAPDH、5S rRNA、Ubiquitin、β-Tubulin 等 6 个表达量较为稳定的基因作为
候选的内参基因。按照定量引物设计要求，利用 Primer 5.0 设计 6 对引物（表 1）。

表 1 内参基因的引物序列
Table 1 Primer sequences for internal control genes
引物名称
Gene
引物序列（5′–3′）
Primer sequence
扩增长度/bp
Amplification length
Actin F：CTTGTTCTTCTGAGTTTGCTTCC；R：GGCGCTCCTAACGTACTACCA 163
EF-1α F：CGACGGTGGCGACAGTTTA；R：CATACAGACGCAAAGGAAAGC 123
GAPDH F：TGAACACCACCAAGTAGGGC；R：ACAGTCGCTGGCACAGAGTAA 195
5S rRNA F：AGGTGGTGATGATGAGGATGA；R：CCAGATTGGCCTAACAGAAAGA 154
Ubiquitin F：TGGCTGGTTTTATGTGGACTT；R：CAAGAATCACGGTATCCTGGTA 129
β-Tubulin F：TTGACTGGGAGTGAGATTGGA；R：CAAAATAGCGTTCAGCCACA 146

1.3 试验方法
按 Trizol（TaKaRa）试剂盒说明书提取各样品的总 RNA。通过 1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光
光度计检测其完整性、浓度和纯度。
用反转录试剂盒 PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser（TaKaRa）cDNA 合成，先去除
gDNA 的，然后再进行 20 μL 体系反转录，取 4 μL 5× PrimeScript 缓冲液，1 μL PrimeScript RT enzyme
MixⅠ，1 μL Oligo dT primer，1 μL Random 6 mers，以及 1 μg 总 RNA，用去 RNA 酶的双蒸水补足，
于 37 ℃反应 15 min 后，85 ℃反应 5 s。
用 qRT-PCR 试剂盒 SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）进行 10 μL 体系 qRT-PCR。在 PCR 反
应管中加入 5 μL SYBR mix，上下游引物各 0.4 μL，0.5 μL cDNA 模板，并加 3.7 μL 双蒸水，每个
样本重复 3 次。PCR 扩增反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 0.05 s，60 ℃ 20 s，40 个循环。qRT-PCR 扩
增反应结束后进行 65 ~ 95 ℃熔解曲线分析。
1.4 数据分析
用凝胶成像系统观察总 RNA 质量，以及扩增条带，荧光定量仪器为 CFX-96 实时荧光定量 PCR
仪（BIORAD）观察扩增曲线，均在 40 个循环内达到平台期；熔解曲线均呈单峰，说明扩增的特异
性；用 geNorm（Vandesompele et al.，2002）、NormFinder（Andersen et al.，2004）、BestKeeper（Pfaffl
et al.，2004）3 种分析软件分别评价 6 个候选基因在石蒜属 3 个种的不同时期、不同花期表达的稳
定性，比较稳定值大小以及适宜选定的内参基因的数量，并在最终采用 RefFinder（Xie et al.，2011）
软件进行综合评定（Thomas et al.，2000；Vandesompele et al.，2002；Hayati & Robert，2004；Luisa
& Michèle，2012）。
2 结果与分析
2.1 RNA、引物以及 cDNA 质量检测
RNA 经过 OD 值检测，OD260/280 及 OD260/230 均为 1.8 ~ 2.22。1%琼脂糖电泳检测，28S、18S、
5S 条带明显，符合荧光定量 PCR 要求（图 1）。
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图 1 RNA 检测电泳图
M：DNA marker；1 ~ 3：换锦花；4 ~ 6：石蒜；7 ~ 9：中国石蒜；1、4、7：根；2、5、8：花葶；3、6、9：叶；10：换锦花花苞。
Fig. 1 Detection electrophoresis of RNA by electrophoresis
M：DNA marker；1–3：Lycoris sprengeri；4–6：L. radiata；7–9：L. chinensis；
1，4，7：Root；2，5，8：Scape；3、6、9：Leaf；10：L. sprengeri bud.


6 对引物在换锦花、石蒜和中国石蒜的不同花期（花苞期、初花期、盛花期、败花期），不同
组织器官（根、花葶、叶、鳞茎）以及同一生长时期的长 1 ~ 1.5 cm 的杂交种幼小鳞茎（石蒜♀ × 中
国石蒜♂、换锦花♀ × 石蒜♂、换锦花♀ × 长筒石蒜♂、中国石蒜♀ × 换锦花♂）试验材料中
的熔解曲线都只有明显的单一峰，且电泳检测均只有单一条带，说明所用引物都能特异性地扩增各
内参基因的相应产物，也不存在引物二聚体，每个待测样品 PCR 扩增曲线的重复性好，模板能特异
性扩增，而非模板无扩增，说明实时荧光定量 PCR 的结果是准确可信的（图 2，图 3）。


图 2 以换锦花花苞 cDNA 为模板 6 对引物特异性检测电泳图
Fig. 2 Examination of specific primers by agarose gel electrophoresis



图 3 换锦花花苞 cDNA 为模板 6 个内参基因熔解曲线
Fig. 3 Melting curves of 6 reference genes
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表 2 引物的扩增效率与相关系数
Table 2 Amplification efficiency and the correlation
coefficient of primers
基因 Gene 扩增效率（E）/%
Amplification efficiency
相关系数（R）
Correlation index
Actin 115 0.9847
EF-1α 95 0.9832
GAPDH 111 0.9882
5S rRNA 116 0.9829
Ubiquitin 119 0.9824
β-Tubulin 120 0.9812
标准曲线按照原 cDNA 10 倍梯度稀释产
物，包括原液共设置 6 个 cDNA 浓度。根据荧
光定量 PCR 结果，以循环次数为横坐标，以扩
增的荧光强度为纵坐标，可得模板与非模板对
照的扩增曲线（图 4）。利用公式 E（%）=
（10-1/slope–1）× 100 计算基因的扩增效率。扩
增效率在 95% ~ 120%，相关系数在 0.9812 ~
0.9882 之间，符合 qRT-PCR 试验的要求（表 2）。




图 4 模板与非模板对照 qRT-PCR 的扩增曲线
同一模板重复 2 ~ 3 次 PCR 的扩增曲线。
Fig. 4 Amplification curves of template and non-template control qRT-PCR
2–3 times repeat PCR amplification curve by the same template.

2.2 内参基因表达稳定性分析
2.2.1 geNorm软件分析
利用 geNorm 可以通过内参基因标准化因子的配对差异分析（Vn/Vn + 1）来判定内参基因的最适
数量，geNorm 软件由默认值 0.15 进行取舍，即 Vn/Vn + 1 < 0.15 时没有必要使用内参数量 ≥ n + 1
的看家基因作为内参（张艳君 等，2007）。由分析可得（图 5，表 3），除杂交种鳞茎 V2/V3 小于
0.15，换锦花、石蒜以及中国石蒜在不同花期、不同组织 Vn/Vn + 1 均大于 0.15，其原因可能是样本
本身跨度大（花期跨越 30 d），器官差异大（包括根、茎、叶、鳞茎，花叶不同时期，鳞茎为组培
材料）所致。geNorm 操作手册中也提到 Vn/Vn + 1 最大值设定为 0.15 也并非总是必要，因此本试取
Vn/Vn + 1 最小值来确定最佳内参数（Bustin et al.，2005；Huggett et al.，2005；Wan et al.，2010；Gu
et al.，2011）。
杂交种鳞茎可以选择 Actin 和 β-Tubulin 为内参基因。换锦花不同花期可以选择 4 个（0.308）内
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参基因，即 EF-1α、5S rRNA、β-Tubulin 以及 Actin。由于选择的内参基因数量较多，也可在今后的
试验中进一步筛选表现更为稳定的看家基因。换锦花不同组织和石蒜不同花期都可选择 3 个内参基
因，分别 Actin、EF-1α和 5S rRNA，以及 5S rRNA、β-Tubulin 和 Actin。石蒜不同组织和中国石蒜不
同花期均可以选择两个内参基因，分别是 5S rRNA、β-Tubulin 和 Ubiquitin、β-Tubulin。


图 5 标准化因子配对差异值
Fig. 5 Pairwise variations of normalization factors

表 3 geNorm 数据分析的稳定值及排名
Table 3 Stable value and ranking of data analysis by geNorm
换锦花 L. sprengeri 石蒜 L. radiata 中国石蒜 L. chinensis
花期 Florescence 组织 Organs 花期 Florescence 组织 Organs 花期 Florescence 组织 Organs
杂交种鳞茎
Hybrids bulbs 基因
Gene 排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
Actin 4 1.12 1 0.59 3 0.75 3 0.80 5 1.12 5 1.86 1 0.28
EF-1α 1 0.68 1 0.59 6 1.33 4 1.94 6 1.49 4 1.68 6 2.49
GAPDH 5 1.33 5 1.07 5 1.22 5 2.47 3 0.50 6 2.00 5 1.47
5S rRNA 1 0.68 3 0.71 1 0.40 1 0.67 4 0.93 1 1.03 4 0.74
Ubiquitin 6 1.70 6 1.30 4 0.98 6 2.70 1 0.26 3 1.44 3 0.35
β-Tubulin 3 1.01 4 0.80 1 0.40 1 0.67 1 0.26 1 1.03 1 0.28

2.2.2 NormFinder分析软件
根据 NormFinder 分析可得（表 4），β-Tubulin 在换锦花不同组织、石蒜不同花期和杂交种鳞茎
表达最为稳定，为最适内参基因，其次表现较好的是 5S rRNA 和 Ubiquitin，5S rRNA 在换锦花不同
花期和中国石蒜不同花期是最稳定的内参基因，Ubiquitin 在石蒜和中国石蒜不同组织中是最适宜的
内参基因。

表 4 NormFinder 数据分析的稳定值及排名
Table 4 Stable value and ranking of data analysis by NormFinder
换锦花 L. sprengeri 石蒜 L. radiata 中国石蒜 L. chinensis
花期 Florescence 组织 Organs 花期 Florescence 组织 Organs 花期 Florescence 组织 Organs
杂交种鳞茎
Hybrids bulbs 基因
Gene 排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
Actin 2 0.25 1 0.37 5 2.62 6 1.39 5 1.78 5 1.23 2 0.65
EF-1α 3 0.29 4 1.23 2 1.60 5 1.33 3 1.65 6 1.86 6 4.39
GAPDH 5 1.38 3 0.80 4 2.30 4 1.23 6 1.88 3 0.85 4 1.52
5S rRNA 1 0.23 5 1.87 3 1.80 3 0.66 1 0.51 4 1.23 5 2.23
Ubiquitin 6 1.60 6 2.38 6 2.90 1 0.24 2 0.85 1 0.50 3 0.73
β-Tubulin 4 1.11 1 0.38 1 1.30 2 0.65 4 1.66 2 0.55 1 0.14
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2.2.3 BestKeeper软件分析
BestKeeper 也是通过稳定值对候选基因的稳定性进行评价和排序（表 5）。分析结果表明，换
锦花不同花期稳定性由高到低排序是 GAPDH > Actin > Ubiquitin > β-Tubulin > EF-1α >5S rRNA，换
锦花不同组织 β-Tubulin > 5S rRNA > Actin > EF-1α > GAPDH > Ubiquitin，石蒜不同花期 EF-1α >
GAPDH > Ubiquitin >5S rRNA >β-Tubulin > Actin，石蒜不同组织 β-Tubulin > 5S rRNA > EF-1α >
Actin > GAPDH > Ubiquitin，中国石蒜不同花期 Ubiquitin > GAPDH > β-Tubulin > 5S rRNA > Actin >
EF-1α，中国石蒜不同组织 EF-1α > Actin > Ubiquitin > 5S rRNA > Β-Tubulin > GAPDH，杂交种鳞茎
Actin > Tubulin > Ubiquitin > 5S rRNA > GAPDH > EF-1α。

表 5 BestKeeper 数据分析的稳定值及排名
Table 5 Stable value and ranking of data analysis by BestKeeper
换锦花 L. sprengeri 石蒜 L. radiata 中国石蒜 L. chinensis
花期 Florescence 组织 Organs 花期 Florescence 组织 Organs 花期 Florescence 组织 Organs
杂交种鳞茎
Hybrids bulbs 基因
Gene 排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
排名
Ranking
稳定值
Stable
value
Actin 2 0.62 3 0.68 6 1.75 4 1.52 5 1.19 2 1.03 1 0.28
EF-1α 5 1.61 4 0.73 1 0.29 3 1.18 6 1.46 1 0.40 6 3.61
GAPDH 1 0.46 5 1.31 2 0.58 5 1.71 2 0.28 6 1.83 5 2.21
5S rRNA 6 1.75 2 0.66 4 1.10 2 1.05 4 1.11 4 1.39 4 0.65
Ubiquitin 3 0.82 6 1.42 3 0.72 6 1.87 1 0.15 3 1.08 3 0.47
β-Tubulin 4 0.93 1 0.43 5 1.16 1 0.82 3 0.29 5 1.78 2 0.46

2.3 对 6 个内参基因表达稳定性的综合评价
geNorm、NormFinder 以及 BestKeeper 等 3 种分析软件中，geNorm 和 NormFinder 的分析结果
较为一致，而 BestKeeper 与其它两个软件差异明显，因此需要采取综合分析法。
根据 RefFinderl 软件综合评定，换锦花不同组织从最稳定到最不稳定综合推荐排名排序是：
β-Tubulin > Actin > GAPDH > EF-1α > 5S rRNA > Ubiquitin，根据 geNorm，可选择 β-Tubulin、Actin
以及 GAPDH3 个最适内参基因；换锦花不同花期 5S rRNA > EF-1α > Actin > β-Tubulin > GAPDH >
Ubiquitin，由于 geNorm 推荐最适内参数为 4 个，则可使用 5S rRNA、EF-1α、Actin 和 β-Tubulin 作
为内参基因。
根据 geNorm 软件分析推荐，中国石蒜不同组织稳定性排名为 5S rRNA > Ubiquitin > EF-1α >
β-Tubulin > Actin > GAPDH，选取最适内参数为 4 个，即 5S rRNA > Ubiquitin > EF-1α > β-Tubulin；
不同花期是 Ubiquitin > β-Tubulin > GAPDH > 5S rRNA > Actin > EF-1α，可选取两个最适内参为
Ubiquitin、β-Tubulin。在石蒜不同组织中，稳定性排名是 β-Tubulin > 5S rRNA > EF-1α > Actin >
GAPDH > Ubiquitin，选择 β-Tubulin 和 5S rRNA 为内参基因；不同花期 Ubiquitin > β-Tubulin > 5S rRNA >
GAPDH > EF-1α > Actin，Ubiquitin、β-Tubulin，可用 5S rRNA 作为内参基因。杂交种鳞茎分析结果
稳定性排名为 β-Tubulin > Actin > Ubiquitin >5S rRNA > GAPDH > EF-1α，选取 β-Tubulin 和 Actin 作
为内参基因。
根据 geNorm 软件分析推荐，中国石蒜不同组织稳定性排名为 5S rRNA > Ubiquitin > EF-1α >
β-Tubulin > Actin > GAPDH，选取最适内参数为 4 个，即 5S rRNA > Ubiquitin > EF-1α > β-Tubulin；
不同花期是 Ubiquitin > β-Tubulin > GAPDH >5S rRNA > Actin > EF-1α，可选取两个最适内参为
Ubiquitin、β-Tubulin。在石蒜不同组织中，稳定性排名是 β-Tubulin > 5S rRNA > EF-1α > Actin >
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GAPDH > Ubiquitin，选择 β-Tubulin 和 5S rRNA 为内参基因；不同花期 Ubiquitin > β-Tubulin > 5S rRNA >
GAPDH > EF-1α > Actin，Ubiquitin、β-Tubulin，可用 5S rRNA 作为内参基因。杂交种鳞茎分析结果
稳定性排名为 β-Tubulin > Actin > Ubiquitin >5S rRNA > GAPDH > EF-1α，选取 β-Tubulin 和 Actin 作
为内参基因。
3 讨论
在换锦花和石蒜中不同组织器官中 β-Tubulin 表达稳定性最高，Ubiquitin 稳定性最低。在中国石
蒜和石蒜不同花发育时期中，6 个内参基因表达稳定性差异不大，均是 Ubiquitin、β-Tubulin 表达稳
定，而 Actin、EF-1α表达较差，但种间差异明显。在不同组织器官中，5S rRNA、Ubiquitin 在中国
石蒜中均表现稳定，而在换锦花中表现最差，在石蒜中前者表现较为稳定，后者表现最不稳定。不
同花期中，在换锦花中稳定性排名位居前三位的是 5S rRNA、EF-1α和 Actin，但在中国石蒜中稳定
性排名后三位，在石蒜中稳定性也较差，分别是第 3 位和第 5 位、第 6 位。Cui 等（2011）用 13 个
候选基因在长筒石蒜中研究发现 7 个不同组织（根、茎、叶、花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊）中，宜选
用 eIF 和 HIS；5 个不同花期（花瓣 20、40、70、80 和 90 mm）UBC 较为稳定。eIF、HIS、UBC 以
及 18S RNA 在所有的样品中均表达较好，而 Ubiquitin、GAPDH、α-Tubulin 稳定性较差。这与本试
验研究成果有些差异，可能原因：①本身种间差异大，就换锦花、石蒜和中国石蒜中就可看出差异
明显，因此根据各条件下使用不同内参基因更为重要。②本试验选用的材料较多，侧重发现种间差
异，而 Cui 等（2011）试验侧重新旧内参基因的筛选，针对 Cui 等（2011）研究结果，还可以在后
续试验中，多选取几个内参基因加以比较，尤其选择表达较为稳定的 eIF、HIS 以及 UBC。
植物基因的荧光定量 PCR 内参基因的研究，主要集中对于保守的看家基因进行筛选，如周良云
等（2014）对黄花蒿（Artemisia annua Linn）的 Actin、18S rRNA、PAL、GAPDH 和 CPR 作为候选
内参基因，不同浓度镉处理下黄花蒿叶片中的表达稳定性进行分析，采用多个内参校正结果，最终
选取 Actin、18S rRNA、PAL 作为内参基因。刘金泊等（2014）使用 qRT-PCR 技术评价 β-Actin、GAPDH、
α-Tubulin、SYN1、SYN6、RPS3、RPS18 和 RPL13a 等 8 个内参基因在磷化氢诱导后的不同品系赤拟
谷盗（Tribolium castaneum Herbst）中的表达水平，确定相对适合的内参基因为 RPS18 和 RPL13a。
黄琼林等（2013）以毛唇芋兰[Nervilia fordii（Hance）Schltr]3 个组织（叶片、叶柄和球茎）为材料，
利用实时荧光定量 PCR 技术探讨 18S rRNA、Actin、Ubiquitin、EF-1α和 β-Tubulin 5 个常用内参基
因在不同组织中表达差异，结果表明 β-Tubulin 可作为内参基因。苏晓娟等（2013）使用荧光定量
PCR 方法分析了 TUA8、TUB6、Ubiquitin、GAPDH、Actin、18S rRNA 和 EF-1α等 7 个看家基因在
毛果杨（Populus trichocarpa）的不同组织以及锌胁迫下的组培苗的表达情况，发现 Actin、Ubiquitin、
EF-1α 和 18S rRNA 的稳定性较好，可用作内参基因；而 TUB6 在不同组织中稳定性最差；GAPDH
在锌胁迫下的组织中稳定性最差，不适宜作为内参基因。李冉等（2013）通过分析 5 个常用的内参
基因（eEF-1α、18S rRNA、25S rRNA、Actin 和 UBQ5）在水稻（Oryza sativa）经过各种处理后表达
的稳定性，结果表明，水稻经过机械损伤处理后 eEF-1α 基因的表达最稳定；二化螟（Chilo
suppressalis）处理后 25S rRNA 基因的表达最为稳定；稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis Guenee）
处理后 Actin 基因的表达最稳定；两种刺吸式口器昆虫褐飞虱（Brown rice planthopper）和白背飞虱
（Sogatella furcifera）危害后，UBQ5 基因的表达最稳定。张岗等（2013）以铁皮石斛（Dendrobium
officinale Kimura et Migo）ACT-1、ACT-2、EF-1α、GAPDH、β-TUB、18S rRNA 和 26S rRNA 等 7 个
蒋婷婷，高燕会，童再康.
石蒜属植物实时荧光定量 PCR 内参基因的选择.
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候选内参基因，以 EF-1α/18S rRNA 为标准分析 FPS 基因的相对表达量，其大小为种子 > 根 > 原
球茎 > 茎 > 叶。由于发现新的内参基因步骤繁琐，工作量大，且应用范围较小，因此，大多选用
的还是传统的内参基因。在不同的组织部位以及不同的胁迫处理下，内参基因表达量的差异明显。
Actin 和核糖体 RNA 均为常用内参基因，说明 Actin、核糖体 RNA 在植物进化过程中保守，且表达
量稳定，这对研究没有进行大规模筛选最适内参基因的植物有较大启迪作用，对今后石蒜属植物的
进一步研究有更多的指导意义。

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