全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (6): 853~859　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0147 853
收稿 2015-03-20　　修定 2015-06-03
资助 2013年海南省重大科技专项(ZDZX2013023)和海南大学
地方服务项目(HDSF201304)。
* 通讯作者(E-mail: dioscorea@163.com; Tel: 0898-66279037)。
参薯DaANS基因克隆及表达差异分析
陈跃华, 许云, 吴文嫱, 刘林娅, 黄小龙, 黄东益*
海南大学农学院, 海口570228
摘要: 通过研究参薯块茎花青素合成途径中DaANS基因的功能以为参薯分子育种打下基础。利用RT-PCR与RACE技术从
参薯块茎中扩增得到1 320 bp的花青素合成酶cDNA序列, 其编码356个氨基酸, 命名为DaANS (登录号为KP729182)。基因
组序列全长1 534 bp, 具有一个内含子。使用荧光定量PCR技术对参薯不同组织及其块茎不同发育时期的DaANS基因相对
表达量进行测定。结果表明: DaANS基因具有明显的组织特异性和时空性, 不同组织中块茎表达量最高, 且在块茎生长的
前期具有很高的表达量, 在8月份到顶峰, 随后急剧降低。
关键词: 花青素; 参薯; 花青素合成酶; 基因克隆; 实时荧光定量PCR
Cloning and Analysis of Differential Expression of DaANS Gene in Dioscorea
alata
CHEN Yue-Hua, XU Yun, WU Wen-Qiang, LIU Lin-Ya, HUANG Xiao-Long, HUANG Dong-Yi*
College of Agronomy, Hainan University, Haikou 570228, China
Abstract: The function of DaANS gene in anthocyanin biosynthesis pathway was studied to lay the founda-
tion for molecular breeding of Dioscorea alata. In this paper, the cDNA sequence of DaANS gene (1 320 bp)
was cloned by RT-PCR and RACE techniques from the tuber of D. alata. The gene was named as DaANS
(accession number: KP729182) encoding a protein of 356 amino acids. The full-length of DNA sequence was
1 534 bp, containing one intron. The relative expression of DaANS was determined by real-time quantitative
PCR in six different organizations and different developmental stages of tubers. The results showed the expres-
sion of DaANS gene had obvious characters of space and time. The expression of tuber was the highest in dif-
ferent tissues. And the early stage of tuber growth had a high amount of expression, in August to the peak, and
then decreased sharply.
Key words: anthocyanidin; Dioscorea alata; anthocyanidin synthase; gene cloning; real-time quantitative PCR
参薯(Dioscorea alata)又称大薯、脚板薯, 属薯
蓣科薯蓣属, 是一年生或多年生缠绕性藤本植物,
我国主要分布在云南、海南、广西等西南地区。
其块茎富含淀粉, 是西非各国的重要粮食作物。参
薯块茎由于花青素和其他次生代谢产物含量的差
异呈现白色、白中带紫、紫色等不同颜色。花青
素也称花色素(anthocyanidin), 属多酚类化合物, 在
医疗保健、食品添加剂、观赏园艺等方面均具有
重要价值。因此块茎中花青素的含量是参薯的重
要品质特征, 研究花青素代谢途径中关键酶的基因
及其表达量十分重要。在不同物种中, 主导花青素
积累的关键酶有所差异, 主要包括F3H、DFR、
ANS、GT等(Boss等1996; Shimada等2006)。在参
薯块茎中主导花青素含量的关键因素是花青素合
成酶基因的表达量。
花青素合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)
作为花青素生物合成途径后期中的关键酶, 催化无
色花青素的脱水氧化形成有色的花青素(Saito等
1999)。目前, 花青素合成酶基因已经从紫苏(Perilla
frutescens) (Gong等1997)、洋葱(Allium cepa) (Kim
等2004)、鹤望兰(Strelitzia reginae) (樊荣辉等
2013)、拟南芥(Arabidopsis thaliana) (Wilmouth等
2002)等植物中分离克隆出来。国内外对于参薯的
研究, 主要集中在抗病种质的筛选保存、离体种质
资源收集(Mignouna等2002)、分离提取花青素及
鉴定。Narina等(2011)对参薯的EST进行标记, 构建
了遗传连锁图谱。许云等(2014)采用参薯带节茎段
植物生理学报854
诱导类原球茎。但在分子水平上对参薯中花青素合
成酶基因的研究未见报道。本研究从参薯紫色块
茎中克隆获得花青素合成酶基因DaANS, 并对基因
及其编码蛋白序列进行分析; 同时采用实时荧光定
量PCR技术对该基因在参薯不同组织以及块茎不同
生长时期的基因表达量进行检测和分析, 为深入研
究DaANS基因的调控机理提供分子依据, 以期为参
薯块茎花青素形成的分子机理研究奠定基础。
材料与方法
1 材料
实验材料为参薯(Dioscorea alata Linn.)云南
品系, 种植于海南大学农学院农业部薯蓣种质资
源圃中, 从7月份开始选择长势相似的植株3株, 采
集相同发育时期的不同组织和不同时期的块茎(于
7月份开始, 每隔1个月采收块茎一次), 液氮速冻后
于–80 ℃条件下保存备用。
3′ RACE和5′ RACE试剂盒及反转录试剂盒、
pMD18-T载体、LA Taq酶、dNTP均购自TaKaRa
公司; HiFi Trans Taq酶购自北京全式金生物技术
有限公司; 引物合成及测序由上海生工生物工程
服务有限公司完成。
2 总RNA和DNA提取及cDNA第一链的合成
采用改良的CTAB-LiCl法提取参薯块茎总
RNA。利用Revert AidTM First Strand cDNA Synthe-
sis试剂盒(Fermentas公司)以提取的总RNA为模板
合成3′ RACE和5′ RACE的cDNA第一链。采用
CTAB法提取参薯叶片总DNA。
3 参薯DaANS基因cDNA序列的克隆
查找NCBI上登录的植物花青素合成酶基因
保守区段序列, 设计引物ANS1F、ANS1R (表1)用
来扩增cDNA中间序列, 随后以中间序列设计3′端
引物ANS3′-1、ANS3′-2 (表1) (周生茂等2009), 扩
增DaANS基因的3′端序列; 以5′端引物ANS5′-1、
ANS5′-2 (表1), 扩增DaANS基因的5′端序列。
依据RACE试剂盒(TaKaRa公司)说明, 对RNA
加帽处理后, 进行套式PCR。反应条件为94 ℃预
变性5 min; 94 ℃变性1 min, 分别于55、57 ℃退火
30 s, 72 ℃延伸2 min, 30个循环; 72 ℃延伸5 min。
PCR产物经电泳后 , 取目标片段回收、纯化与
pMD18-T载体连接, 转化感受态细胞后, 筛选送测
序。用DNAman软件拼接测序结果, 获得参薯块茎
花青素合成酶基因全长cDNA序列。
4 参薯DaANS基因cDNA和DNA全长序列的获得
根据拼接的结果, 设计了DaANS基因全长引
物ANS4F、ANS4R (表1), 以上述提取的参薯块茎
cDNA为模板, 扩增花青素合成酶基因的cDNA全
长序列。随后以上述提取的参薯块茎基因组DNA
为模板 , 扩增花青素合成酶基因的DNA全长序
列。PCR反应条件为95 ℃预变性3 min; 94 ℃变性
1 min, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 30个循环; 72
℃延伸10 min。PCR产物经电泳后, 取目标片段回
收、纯化与pMD18-T载体连接, 转化感受态细胞
后, 筛选送测序。
表1 引物序列及退火温度
Table 1 The primer sequences and annealing temperatures
引物名称 序列 (5′→3′) 退火温度/℃
ANS1F TNCAAATGAARATMAYTACTACCCAA 55
ANS1R CARAANACMGCCCAWGAAAYCCTNACC 55
ANS3′-1 AGTGTCCTCAACCCAGTCTCG 56
ANS3′-2 GTGTGTGCCTGACTCCATTGT 56
ANS5′-1 CTTGTACAGGCCATTGGTGAG 55
ANS5′-2 GCACACACTTGGCCGTGACCC 55
ANS4F TCTTCATCGAGAAAACAAAGCCTAC 60
ANS4R TTATTTTAGACTGACTCAATCACCATG 60
Q-ANS-F1 GCATAGACCAAATCCCCACC 60
Q-ANS-R1 CGCACCTCCTCAACGCAC 60
18S-Q-F GGGCATTCGTATTTCATAGTCAGAG 60
18S-Q-R CGGCATCGTTTATGGTTGAGA 60
陈跃华等: 参薯DaANS基因克隆及表达差异分析 855
5 参薯DaANS基因的同源性及进化分析
从NCBI中下载其他植物ANS基因编码的氨基
酸序列, 使用DNAman软件对氨基酸进行多重序列
比对, 分析保守的功能结构域。使用MEGA 5.0对
所选氨基酸序列进行进化树的构建, 对ANS氨基
酸同源性及进化进行分析。
6 参薯DaANS基因不同组织及块茎不同时期的特
异性表达
分别提取参薯不同组织的总RNA以及不同时
期的块茎的总RNA。使用Prime Script™ RT reagent
Kit with gDNA Eraser (宝生物工程有限公司)反转
录合成cDNA第一链备用。
使用荧光定量PCR (real-time quantitative PCR)
检测基因的相对表达量。设计引物Q-ANS-F1、
Q-ANS-R1 (表1)扩增目标基因, 预测产物长度是
174 bp, 退火温度60 ℃; 以18SRNA作为内参基因,
引物序列为18S-Q-F、18S-Q-R (表1), 预测产物长
度是180 bp。标准品cDNA和待测样品均设置3次
重复。
实验结果
1 参薯DaANS基因的克隆及结构分析
保守区段序列设计的引物扩增得到约230 bp
的片段(图1-A), 经DNAman和BLAST比对分析, 该
序列为DaANS基因cDNA序列的同源片段。依据3′
RACE试剂盒说明, 进行套式PCR, 获得约700 bp的
片段(图1-B)。利用5′ RACE特异性引物和试剂盒
自带的5′ RACE Outer Primer、5′ RACE Inner
Primer进行套式PCR, 获得约为800 bp的片段(图
1-C)。根据3′ RACE和5′ RACE测序结果拼接得到
参薯花青素合成酶基因全长cDNA序列为1 424 bp
(图1-D), 命名为DaANS。
利用DaANS基因全长引物ANS4F、ANS4R,
以参薯块茎cDNA为模板, 扩增得到1 320 bp的
cDNA序列, 包含完整ORF (1 071 bp), 3′端和5′端的
非翻译区长度分别为187和62 bp。起始密码子位
于5′端的63~65 bp处。在3′末端存在TAAAATAAA
的加尾信号。DaANS基因序列经分析后, 具有完
整的5′和3′末端, 确认是参薯花青素合成酶基因的
全长序列。以参薯块茎DNA为模板, 扩增得到1 534
bp的基因序列。两者序列比对后发现, 参薯DaANS
基因含有一个内含子(图2)。与预测的完整ORF比
对, 将ATG起始密码子定义为首位, 内含子则位于
508~621 bp。同时外显子和内含子的边界均满足
“GT-AG”规则, 且与NCBI中已经报道研究的葡萄
具有相似的剪接位点和基因结构。
DaANS基因的完整阅读框架编码356个氨基
酸(图3), 其分子量和理论等电点(PI)分别为40.22
kDa和5.81, 带有51个负电荷残基(Asp+Glu)和44个
正电荷残基(Arg+Lys)数目, 其消减系数(Abs)为
1.094。
2 参薯DaANS基因的同源性及进化分析
从NCBI中下载下列植物的ANS基因编码的氨
基酸序列, 用DNAman软件进行氨基酸多重序列比
图1 DaANS基因的扩增结果
Fig.1 The PCR amplifi cation results of DaANS gene
A: DaANS基因保守序列的扩增结果; B: DaANS基因的3′端扩增结果; C: DaANS基因的5′端扩增结果; D: DaANS基因cDNA和DNA全长
扩增结果; M: DL2000 marker。
植物生理学报856
图3 参薯DaANS编码的氨基酸一级结构
Fig.3 The primary structure of DaANS protein amino acids
对后发现, ANS基因编码的蛋白质具有2个保守结
构域(图4)。DIOX-N超家族(Gln51~Pro163)是高度
保守的N端结构。另一个保守结构域(Leu212~
Pro311)属于2-酮戊二酸-Fe2+-双加氧酶家族。其中
包含2个精氨酸(Arg241和Arg293), 可以特异性与2-
酮戊二酸结合 ; 另含保守组氨酸4个(His236、
His247、His274和His292)、天冬氨酸3个(Asp258、
Asp269和Asp277), 可以与Fe2+结合, 具有双加氧的
功能。
利用参薯DaANS编码的氨基酸序列与所选植
物进行比对构建进化树, 分析发现ANS基因编码
的氨基酸具有64%~73%的较高同源性。在单子叶
植物中, ANS基因编码的氨基酸与旅人蕉科的鹤望
兰同源性最高, 达到73%。在双子叶植物中与滇
藏木兰(AHU88620.1)、甜樱桃(AEO79983.1)、柰
(AEN19292.1)同源性最高, 达到68%。构建的进化
树显示参薯与蔷薇科的甜樱桃、巴旦木、旋花科
的甘薯以及木兰科的滇藏木兰聚为一小类, 在和十
字花科的紫罗兰、拟南芥、芥菜以及石蒜科的石
蒜聚于一亚类, 最后才和圆叶牵牛、可可、鸢尾等
其他物种归为一大类; 分析发现在进化树上同科植
物基本上处于同一个分支。但是甘薯(ADE08370.1)
没有归类到旋花科, 不能被区分开来。总的来说氨
基酸的比对结果与植物进化关系基本保持一致。
3 参薯DaANS基因在不同组织以及块茎不同时期
的表达分析
以参薯功能叶的DaANS基因表达量定为“1”,
依据相对定量公式作图, 得到DaANS基因在不同
组织中的表达结果 (图6 - A )。实验结果表明 ,
DaANS基因在顶芽、茎、块茎、嫩叶中均有表
达。其中块茎的DaANS基因表达量最高 , 是顶
芽、茎、嫩叶中基因表达量的40倍左右。不同组
织中DaANS基因表达量与花青素的含量变化趋势
具有一定的相似性。从表观特征也可以发现, 颜
色较深的组织中花青素含量较高, 同时DaANS基
因的的表达量也较高, 这表明DaANS基因的相对
表达量与花青素积累两者之间存在相同的趋势走
向。同时也可以发现DaANS基因的表达具有明显
的组织特异性, 在块茎中的表达量最高。
以DaANS基因在11月份的表达量作为对照,
得到块茎DaANS基因不同时期的表达结果 (图
6-B)。实验结果表明DaANS基因主要在块茎形成
的前期大量表达, 积累花青素。在8月份块茎膨大
的时期, DaANS基因的表达量达到顶峰, 随着花青
素含量积累的增加以及块茎的膨大, DaANS基因的
表达量急剧降低, 在12月份采收期的时候, 基因的
表达量有所增加(比11月份增加了0.05)。在植株的
生长前期 , 代谢旺盛 , 各种酶的活性都比较高 ,
DaANS基因在前期的高表达量可能与此有一定的
关联。从图6中可以发现DaANS基因的表达量存
在明显的时空性。
讨　　论
花青素合成酶是花青素合成通路末端的酶,
图2 参薯DaANS基因的结构分析
Fig.2 The structure analysis of DaANS gene
陈跃华等: 参薯DaANS基因克隆及表达差异分析 857
决定了花青素的累积, 在果实着色及花色形成中
具有重要作用。无色花青素在花青素合成酶的催
化下生成有色花青素, 随后与3-O-葡萄糖基转移酶
结合, 运输到到液泡中, 形成显色的3-O-糖苷化花
青素(Nakajima等2001), ANS基因最早是从玉米的
A2突变体中利用转座子标签技术鉴定和克隆得到
的(Menssen等1990)。近年来已从紫苏、洋葱、鹤
望兰、拟南芥等植物中分离克隆到ANS基因。
ANS基因在参薯块茎中的表达量高可能与花
青素的合成有关, 推测DaANS可能参与了参薯块
茎花青素积累的分子调控。在对彩叶草的研究中
发现, ANS基因在红色品种茎、叶、花中有较强的
表达, 且强于绿色品种(祝钦泷2004)。Nakamura等
(2006)利用RNA干扰技术抑制蓝猪耳ANS基因的
表达, 使得蓝色花朵变成白色花朵, 且遗传性状十
分稳定。Aharoni等(2001)在草莓研究中通过抑制
ANS基因的表达量, 使得粉红色的花冠变成白色,
明显减少花青苷的积累, 表明基因的表达量是植
图4 DaANS蛋白序列与其他植物ANS蛋白序列比对部分结果
Fig.4 Sequence alignment of deduced DaANS and other plant ANS proteins
ANS基因编码蛋白质的2个保守结构域, 一个是DIOX-N超家族, 位于Gln51~Pro163, 另一个是2-酮戊二酸-Fe2+-双加氧酶家族, 位于
Leu212~Pro311。选用的植物为: 鹤望兰(Strelitzia reginae)、垂花百合(Lilium cernuum)、荷兰鸢尾(Iris×hollandica)、百合(Lilium spp.)、中
国石蒜(Lycoris chinensis)、滇藏木兰(Magnolia sprengeri)、布氏稠李(Prunus avium)、木奈(Prunus salicina var. cordata)、巴旦木(Prunus
persica)、欧洲李(Prunus domestica)、甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)、红薯(Ipomoea batatas)、紫罗兰(Matthiola incana)、西洋梨
(Pyrus communis)、圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)、芥菜(Brassica juncea)、白花甘蓝(Brassica oleracea var. alboglabra)、紫花牵牛(Ipomoea
purpurea)、裂叶牵牛(Ipomoea purpurea)、杜梨(Pyrus communis)、可可(Theobroma cacao)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、王妃藤(Ipo-
moea horsfalliae); 图5同。
植物生理学报858
物颜色变化形成的重要因素之一。而Reddy等
(2007)将ANS基因在水稻中过量表达, 使转基因植
株种皮呈现紫红色。Rosati等(2003)则研究ANS基
因和CHS基因两者之间的协同表达对金钟连翘花
朵颜色的影响, 得出须同时转入两个基因才可以
图6 参薯DaANS基因相对表达量
Fig.6 The relative expression levels of DaANS gene in D. alata
A: DaANS基因在不同组织中的表达结果; B: DaANS基因在块茎不同时期的表达结果。
图5 ANS氨基酸系统进化关系
Fig.5 Phylogenetic analyses of ANS
改变花色, 而转入单个基因则不改变花色。表明
两者是花青素合成途径的主要结构基因, 两者之
间的协同表达对于花青素的积累具有重要作用。
近年来, 转录因子对于花青素生物合成作用方面
的研究已经取得了一定的进展。在今后的研究中,
陈跃华等: 参薯DaANS基因克隆及表达差异分析 859
需要更多关注MYB、bHLH和WD40作用的调控
网络以及微小RNA对调控基因表达的作用(王华等
2015)。
ANS是花色素合成途径的关键酶, 可通过改
变ANS基因的表达来改变花色素的含量, 进而引起
植物器官颜色的变化。因此, 本课题组欲通过转
基因技术对DaANS基因进行功能验证, 为参薯分
子育种打下基础, 对调控和增加花青素形成以及
改善膳食营养和创新参薯品种具有重要意义。
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