全 文 ：园艺学报，2015，42 (2)：252–262.
Acta Horticulturae Sinica
252 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0775；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2014–11–13；修回日期：2015–01–04
基金项目：中央高校基本科研业务费项目（XDJK2009B024）；国家科技支撑计划项目（2012BAD02B01-4）；重庆市科技攻关项目
[CSTC2012GG（8005）]；重庆市自然科学基金项目（cstc2011jjA80014）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yuahs@163.com）
转 MLPK 反义基因对甘蓝自交不亲和性的影响
何绍敏，李春雨，兰彩耘，邹 敏，任雪松，司 军，李成琼，宋洪元*
（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715）
摘 要：对反义 MLPK 基因在甘蓝柱头特异启动子 SLR 的驱动下，通过农杆菌介导转化法将其导入
高度自交不亲和甘蓝材料‘TF’。转基因甘蓝 T0 代植株定量 PCR 分析结果显示，不同的转 MLPK 反义
基因单株内源 MLPK mRNA 积累量具有明显差异，其中转基因植株花期柱头内源 MLPK mRNA 积累量明
显低于野生型对照。花粉原位萌发的荧光显微镜观察结果显示，转基因甘蓝植株花期自交后，吸附在柱
头上的花粉粒大量萌发，且穿过柱头的花粉管明显增加，并导致花期自交结籽数上升，转基因植株花期
和蕾期自交亲和指数均明显高于野生型对照植株。结果表明，下调 MLPK 基因表达能部分打破甘蓝自交
不亲和，提高其花期自交结籽能力。
关键词：甘蓝；自交不亲和性；反义 MLPK 基因
中图分类号：S 635.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）02-0252-11

Effect of Antisense RNA of the MLPK Gene on Self-incompatibility in
Cabbage
HE Shao-min，LI Chun-yu，LAN Cai-yun，ZOU Min，REN Xue-song，SI Jun，LI Cheng-qiong，and
SONG Hong-yuan*
（Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountains Regions，Ministry of Education，Chongqing Key
Laboratory of Olericulture，College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Chongqing 400715，
China）
Abstract：An antisense MLPK gene controlled by a stigma-specific promoter SLR of Brassica
oleracea was introduced into a self-incompatibility B. oleracea‘TF’through Agrobacterium mediated
transformation. Real-time PCR expression analysis of the MLPK gene in T0 generation transgenic cabbage
plants was performed，significant different transcription levels of the MLPK gene in transgenic plants were
observed，and the transcription level of MLPK in open flower stigmas of the transgenic plants were greatly
reduced compared with the wild type plants. In situ fluorescence microscopy results showed a large
number of pollen germination on the stigmas of transgenic plants，and markedly increased pollen tubes
penetrated the stigma after self-pollination of open flower，which leads to significantly increased numbers
of seed. Moreover，both the flowering and bud stage compatibility index of transgenic plants were
significantly higher than the wild type. The results demonstrated that down-regulation expression of the
MLPK gene in stigma can result in a partial breakdown of B. oleracea self-incompatibility，and promote

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seed setting after self-pollination during flowering stage.
Key words：Brassica oleracea var. capitata；self-incompatibility；antisense MLPK gene

芸薹属（Brassica）植物中普遍存在一个以 S 位点基因控制的孢子体自交不亲和信号传导途径。
在这一途径中，S 位点编码 3 个蛋白（Nasrallah et al.，1985；Takasaki et al.，2000；Takayama et al.，
2000），分别是雄性决定因子花粉胞被蛋白 SCR（S 位点富半胱氨酸蛋白）/SP11（S 位点蛋白 11）；
雌性决定因子 S 位点受体激酶 SRK（S 位点受体激酶）以及一个与 SRK 高度相似的 SLG（S 糖蛋白）。
3 个基因组成一个分离单元称为一个 S 单倍型（Nasrallah & Nasrallah，1993），自花授粉后，特定单
倍型内的 SCR 和 SRK 在柱头表皮细胞相互识别形成复合体而引发自交不亲和信号传导过程
（Takayama et al.，2001）。除了 S 位点这 3 个基因外，一些参与自交不亲和信号传导的下游相关因
子也被逐渐发现。臂重复蛋白 ARC1（Stone et al.，2003）、M 位点激酶 MLPK（Murase et al.，2004）
和 RNA 聚合酶基因 rdr6（Tantikanjana et al.，2009）被发现参与自交不亲和信号传导的正调控；而
硫氧还蛋白家族中的 THL1（Cabrillac et al.，2001）和 Exocyst 复合体亚基 BnExo70A1（Samuel et al.，
2009）被认为参与自交不亲和信号传导的负调控。
M 位点激酶（M-locus protein kinase）基因 MLPK 最早在完全丧失自交不亲和性（self-
incompatibility，SI）的芜菁（B. rapa L.）隐性突变体‘Yellow Sarson C634’（S8/S8mlpk/mlpk）中
被鉴定（Murase et al.，2004）。MLPK 主要在柱头中表达，编码一个膜锚定磷酸化蛋白，并直接与
SRK 蛋白相互作用后形成 SRK-MLPK 复合体实现下游蛋白磷酸化而传导自交不亲和信号，且该过
程不需要 SCR/SP11 蛋白的参与（Murase et al.，2004；Kakita et al.，2007a，2007b）。在一个高度自
交亲和的白菜型油菜地方品种‘青海大黄油菜’中，MLPK 序列编码区含有一段插入序列（Zhang et
al.，2013）。另外，MLPK 也被证明参与白菜种内的单向自交不亲和反应（Takada et al.，2013）。而
基于种间自交不亲和系 B. rapa‘Osome’与自交亲和系‘Yellow Sarson’杂交 F2 代的自交不亲和性
分析结果显示 M 位点不参与芸薹属种间自交不亲和反应（Udagawa et al.，2010）。另外，在人工创
制的 SRKb-SCRb 拟南芥自交不亲和植株中，通过 T-DNA 插入突变或人工 miRNA 干扰的方法分别
下调或关闭拟南芥中 BrMLPK 类似基因 AtAPK1a，AtAPK1b 的表达，对 SRKb-SCRb 植株自交不亲
和性均无影响（Kitashiba et al.，2011）。
甘蓝（B. oleracea var. capitata）作为典型的孢子体自交不亲和植物（Nasrallah et al.，1985；
Nasrallah & Nasrallah，1993），其 MLPK 与芜菁中的 MLPK 序列相似性达到 98%（赵永斌 等，2006）。
染色体 FISH 定位显示 MLPK 只有一个同源序列座位，与 S 位点基因之间不存在连锁关系，且分别
位于不同的染色体上（荣小营 等，2009）。目前尚未发现 M 位点突变体甘蓝材料，MLPK 在甘蓝
自交不亲和性信号传导途径中的具体作用和功能尚不清晰。另外，目前在芜菁、白菜以及拟南芥上
的研究结果显示 MLPK 在芸薹属自交不亲和信号传导中的作用和功能不具有完全的保守性（Murase
et al.，2004；Kakita et al.，2007a，2007b；Kitashiba et al.，2011；Takada et al.，2013；Zhang et al.，
2013）。通过反义抑制自交不亲和信号传导途径中的关键基因表达有助于诠释目标基因在该途径中的
具体作用和功能（Stone et al.，1999；Shiba et al.，2000）。本试验中通过农杆菌介导转化法将反义
MLPK 基因导入自交不亲和甘蓝材料‘TF’，通过抑制 MLPK 基因的表达，研究 MLPK 基因在甘蓝
自交不亲和信号传导途径中的作用及其功能，为解析 MLPK 基因参与芸薹属 SI 信号传导的机制提
供直接或者间接的试验证据；同时，也为今后开发生物技术手段调控甘蓝自交不亲和性奠定理论基
础。
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1 材料与方法
1.1 材料
用于扩增 MLPK 基因片段的甘蓝自交不亲和材料‘格拉克’和用于遗传转化的高度自交不亲和
甘蓝材料‘TF’均由西南大学十字花科蔬菜研究所提供。质粒转化用大肠杆菌 DH5α，农杆菌 EHA105
感受态细胞由本试验室保存。
1.2 MLPK 反义基因植物表达载体的构建
取甘蓝材料‘格拉克’开花当天柱头提取总 RNA，反转录获得 cDNA。根据 NCBI 数据库中的
Brassica rapa MLPK 基因序列信息（AB121973）设计引物 M1（5′-GCTCTAGAATGGGGATTTGCAT
GAGTGTTCAGG-3′）和 M2（5′-TGCCATGGCATGAACTCATACACAAGAAGATG-3′），用 pfu 高保
真酶扩增 MLPK 基因 5′长度约 0.48 kb 大小的片段。目标片段插入 pBlueScriptSK 用 EcoRⅤ切后的
位点后进行测序分析。用 NcoⅠ+ XbaⅠ切下 MLPK 基因片段替换 pCABarARC1 质粒（本试验室保
存）中的反义 ARC1 基因，获得 pCABarMLPK（图 1），载体进行酶切鉴定分析。用冻融法将表达载
体转入农杆菌 EHA105。


图 1 pCABarMLPK 载体结构图
Fig. 1 Structure of pCABarMLPK vector
1.3 转基因甘蓝植株的获得
农杆菌介导的甘蓝下胚轴遗传转化方法基本同江汉民等（2013）报道的。甘蓝预培养基：MS +
3 mg · L-1 6-BA + 0.05 mg · L-1 NAA；筛选培养基：MS + 3.0 mg · L-1 6-BA + 0.05 mg · L-1 NAA + 4
mg · L-1 PPT + 400 mg · L-1Carb + 3%蔗糖 + 0.6%琼脂；生根培养基：MS + 0.3 mg · L-1 NAA + 4
mg · L-1 PPT + 400 mg · L-1 Carb + 3%蔗糖 + 0.6%琼脂。
1.4 转基因甘蓝植株的 PCR 鉴定
转基因甘蓝叶片总 DNA 提取采用 CTAB 法。PCR 反应体系为 25 μL，模板为转基因植株叶片
总 DNA，具体操作按照 Taq DNA 聚合酶说明书进行。引物 SLR-F（5′-CCCAAGCTTGGTCATTGCTAC
ATTGGTTTTCCC-3′）和 M1（5′-GCTCTAGAATGGGGATTTGCATGAGTGTTCAGG-3′）用于检测
SLR 柱头特异启动子及下游的反义 MLPK 片段；引物 BAR-F（5′-GAGGATCCATGAGCCCAGAACG
ACGCCCG-3′）和 PolyA-R（5′- CCAAGCTTTAATTCGGGGGATCTGGATTTTAGT -3′）用于检测筛
选标记基因 Bar 及下游的 PolyA 终止子。PCR 扩增参数为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 40 s，56 ℃ 40
s，72 ℃延伸 2 min，30 个循环；72 ℃延伸 10 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 花粉原位萌发的荧光显微镜观察
转基因植株及非转基因植株分别进行花期和蕾期自花授粉，自花授粉 3 ~ 5 h 后取其柱头于固定
液[冰乙酸∶无水乙醇 = 9∶1（v/v）的混合液]中固定保存。固定后的柱头在 2 mol · L-1 NaOH 溶液
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图 2 pCABarMLPK 载体的酶切鉴定
Fig. 2 The restriction enzyme digestion identification
of pCABarMLPK vector
中于 55 ℃软化至透明，用 50 mmol · L-1 的偏磷酸钾溶液清洗数次，置于 0.1%苯胺蓝染液中染色 2 h，
取出柱头并用 50%甘油压片于 Leica DM5000B 荧光显微镜 380 nm 激发光下进行花粉管萌发情况观
察。
1.6 转基因甘蓝植株 MLPK 基因的表达分析
取转基因植株及非转基因植株开花前 1 ~ 2 d 花蕾的柱头和雄蕊以及当天开花的柱头和雄蕊，置
液氮速冻后于–80 ℃冰箱保存备用。根据植物总RNA提取试剂盒说明书提取柱头和雄蕊的总RNA，
根据反转录试剂盒 PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time 说明书反转录成 cDNA 第 1 条链，经
NanoVue plus 超微量分光光度计（GE，美国）测定后将反转录产物稀释至同一浓度，–20 ℃保存
备用。
以甘蓝 TIPS（上游：5′-TTTGTATGAAGATGAACTGGCTGAC-3′；下游：5′-CCTCATAAGTACAC
CATCAACTCTAAGC-3′）和 Actin2（上游：5′-CAATCTACGAGGGTTACGCTCTTCG-3′；下游：5′-GTG
GTGAACATGTAACCTCTCTCGG-3′）作为内参基因，用 Q-MLPK1（5′-ATGCCTTGTGGAAGTT
TAG-3′）和 Q-MPLK2（5′-GTTGGACCGTCTTTAGCC-3′）引物对转基因及非转基因甘蓝植株中未
开放花蕾的柱头、雄蕊及开放当天花的柱头、雄蕊中 MLPK 基因的表达情况进行 Real Time RT-PCR
分析。反应在 C1000/CFX96 仪器（Bio-Rad，美国）上完成，具体操作按照 SYBR® Premix Ex TaqTM
Ⅱ说明书进行。反应程序为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃ 5 s，退火 10 s，35 个循环。利用 Bio-Rad CFX96
荧光定量 PCR 仪 CFX Manager Software 软件（2-∆∆CT 法）和 Microsoft Excel 软件分析数据。
1.7 花期及蕾期亲和指数的测定
转 pCABarMLPK 的甘蓝植株和对照‘TF’非转基因植株开花时，分别对当天开的花及开花前
2 ~ 3 d 的花蕾进行自交授粉，完成全部授粉后统计授粉的花朵数，待种荚成熟后，逐一考种，计算
花期和蕾期亲和指数。亲和指数计算公式为：亲和指数 = 种子数/授粉的花朵数。
2 结果与分析
2.1 MLPK 反义基因植物表达载体的构建
根据 NCBI 数据库中芜菁的 MLPK 基因
（AB121973）序列，用引物 M1 + M2 从甘蓝
‘格拉克’柱头 cDNA 中扩增到预期目标大小
约 0.5 kb 的 MLPK 基因片段。测序后发现获得
序列长度为 480 bp，用 NCBI 在线 Blast 软件与
芜菁的 MLPK 基因（AB121973）进行比较，
该区域内两者之间存在 12 个碱基差异，该段序
列相似系数为 97.5%。将目标序列用 NcoⅠ+
XbaⅠ切下替换 pCABarARC1 质粒中的反义
ARC1 基因，获得以 Bar 基因（对除草剂 Basta 具有抗性）为筛选标记的 pCABarMLPK 植物表达载
体（图 1）。pCABarMLPK 经 NcoⅠ+ XbaⅠ酶切可切下约 0.5 kb 的 MLPK 片段，而用 Hind Ⅲ + XbaⅠ
可切下约 2.0 kb 的反义 MLPK 基因及其上游 1.5 kb 柱头特异表达启动子 SLR 片段（图 2），证明所
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获得的载体结构正确。
2.2 转基因甘蓝植株的获得及 PCR 鉴定
图 3 显示，甘蓝下胚轴在筛选培养基上分化约 3 周后，部分失去原有的黄绿色，变成深褐色而
死亡，其余下胚轴可在切口处分化愈伤组织，并有少量不定芽长出（图 3，A）。将分化有愈伤组织
的绿色下胚轴继续转至新鲜筛选培养基进行继代培养，多次继代后，留下抗性芽株（图 3，B）。待
已分化的绿色芽体长至 2 ~ 3 cm 时，切下完整的芽体（不能连带芽下的愈伤组织）置于生根培养基
上生根，约 1 个月后，绿色芽体逐渐长出白色不定根（图 3，C）。将长出不定根的抗性芽进行炼苗
并挖出移栽入土（图 3，D），获得抗除草剂的植株。



图 3 pCABarMLPK 除草剂抗性甘蓝植株的获得
A：愈伤组织及抗性不定芽的形成；B：抗性芽的筛选；C：抗性芽不定根；D：生根的抗性苗移栽入土。
Fig. 3 The generation process of pCABarMLPK transgenic cabbage plants with PPT resistance
A：The formation of callus and resistant shoots；B：Screening PPT resistant shoots；C：Adventitious roots of PPT resistant shoots；
D：Transplanting of PPT resistant seedlings.

提取移栽成活的 13 株甘蓝植株基因组 DNA，以非转基因甘蓝总 DNA 为对照（WT），
pCABarMLPK 质粒作为阳性对照（CK＋），并设空白对照（CK-）。用 SLR-F + M1 引物在 10 株
pCABarMLPK 转基因植株中扩增出预期大小约 2.0 kb 的反义 MLPK 基因及上游的 SLR 柱头特异表
达启动子目的条带（图 4，A）。
图 4 pCABarMLPK 转基因甘蓝植株 SLR 启动子以及反义 MLPK 基因（A）和 Bar 基因（B）的 PCR 鉴定
M：Trans2KTM plus DNA marker；1 ~ 13：转基因植株；WT：非转基因植株；CK+：阳性对照（质粒）；CK-：阴性对照（未加入 DNA）。
Fig. 4 The PCR identification of SLR promoter and anti-MLPK gene（A）and Bar gene（Ｂ）in pCABarMLPK transgenic cabbage plants
M：Trans2KTM plus DNA marker；1–13：Transgenic plants；WT：Non-transgenic plants；
CK+：Positive control（plasmid）；CK-：Negative control（without DNA）.
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同时用 BAR-F + PolyA-R 引物获得预期大小约 0.76 kb 的筛选标记 Bar 基因和下游的 PolyA 终止
子目的条带（图 4，B），结果显示检测出反义 MLPK 基因的植株均检测到筛选标记基因 Bar 的存在。
2.3 转 MLPK 反义基因甘蓝植株 MLPK 基因的表达分析
从获得的 10 株含目标基因的转基因植株中，在开花时选 3 株进行 MLPK 基因的表达分析，从
结果（图 5）中可以看出，3 株转基因甘蓝植株在未开放花蕾的雌蕊中，7 号和 10 号转基因植株中
MLPK 基因的 mRNA 积累量低于非转基因野生型对照，但 12 号植株却略高于非转基因野生型对照。
花期雌蕊中的 MLPK 基因 mRNA 积累量均明显低于非转基因野生型植株 mRNA 积累量，积累量仅
有对照 40% ~ 50%，该结果显示在甘蓝自交不亲和系雌蕊中特异表达反义 MLPK 基因确实能不同程
度地导致雌蕊中内源 MLPK 基因 mRNA 的积累量下降。
同时，在 3 株转基因植株蕾期雄蕊中 MLPK 基因 mRNA 积累量较对照野生型植株低，但花期
的雄蕊中均检测到明显高于野生型对照植株的 MLPK 基因 mRNA 积累量（图 5）。



图 5 转基因甘蓝植株 MLPK 基因的表达分析
7、10、12：转基因植株；WT：非转基因植株。显著水平为 P = 0.05。
Fig. 5 Expression analysis of MLPK gene in transgenic cabbage plants
7，10，12：Transgenic plants；WT：Non-transgenic plants. Significance level P = 0.05.

2.4 花粉原位萌发的荧光显微镜观察
自交不亲和体现为自花花粉在柱头上的萌发受阻，花粉管不能伸长穿过柱头完成受精。在非转
基因甘蓝‘TF’中，蕾期自花授粉可明显看到大量花粉萌发并形成花粉管束穿过柱头（图 6，A），
花期自交授粉后可见大量花粉粒被吸附在柱头表面并萌发，但是几乎不能看到萌发的花粉形成花粉
管束穿过柱头（图 6，B），而在转基因甘蓝植株中，蕾期自花授粉也可见大量花粉在柱头上萌发并
形成花粉管穿过柱头（图 6，C），花期自交可见大量花粉粒被吸附于柱头表面并大量萌发，且可见
明显的花粉管束穿过柱头（图 6，D）。
上述结果显示，反义 MLPK 基因在甘蓝柱头的特异表达，对打破甘蓝花期自交不亲和性起到积
极作用，在促进花期自交花粉在柱头表面萌发的同时，也能促使花粉管穿过柱头，形成花粉管束向
胚囊延伸。

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图 6 pCABarMLPK 转基因以及非转基因甘蓝花粉原位萌发的荧光显微观察
A：野生型植株蕾期自交；B：野生型植株花期自交；C：转基因植株蕾期自交；D：转基因植株花期自交。
白色箭头示柱头上花粉萌发和花粉管伸长。
Fig. 6 In situ fluorescence microscopy of pollen germination on the stigma of pCABarMLPK transgenic cabbage and the wild-type control
A：Bud stage self-pollination of wild type；B：Flowering stage self-pollination of wild type；C：Bud stage self-pollination of transgenic plants；
D：Flowering stage self-pollination of transgenic plants. White arrows indicate the pollen germination on stigma and pollen tube growth.
2.5 pCABarMLPK 转基因甘蓝植株结荚及结籽表现
非转基因植株及 pCABarMLPK 转基因植株自交授粉约 1 个月后，调查发现，非转基因植株花
期自交授粉所结种荚短小、干瘪，几乎看不见突起的籽粒，并且种荚死亡情况严重（图 7，A），蕾

图 7 pCABarMLPK 转基因植株及非转基因植株种荚生长情况
A ~ D：花期自交授粉后；E ~ H：蕾期自交授粉后；WT：非转基因植株种荚；MLPK：转基因种荚；白色箭头示种荚突起情况。
Fig. 7 Seed pod growth of pCABarMLPK transgenic cabbage and wildtype cabbage
A–D：Seed pods growth after flowering self-pollination；E–H：Seed pods growth after self-pollination of bud stage；WT：Seed pods of
non-transgenic cabbage；MLPK：Transgenic plants. White arrows indicate the seed pods protruding.
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期授粉后部分种荚正常伸长，并且也有明显突起（图 7，E）。而 pCABarMLPK 转基因植株花期和蕾
期自交明显可见细长而籽粒饱满突起的种荚（图 7，B、F）。花期自交后的非转基因的甘蓝种荚中几
乎未发现饱满的籽粒，籽粒均表现为胚胎死亡（图 7，C、D）。转基因植株花期自交后获得的种荚
明显比非转基因种荚长，且多数种荚中可见明显突起，最多种荚结籽数达到 8 ~ 10 粒（图 7，C、D）。
蕾期自交授粉也表现为转基因植株种荚长于非转基因种荚，且种子发育饱满，平均每荚种子数量多
于非转基因对照（图 7，G、H）。上述结果说明，反义 MLPK 基因的表达对打破甘蓝自交不亲和性
有积极作用，能导致花期自交以及蕾期自交的结籽数量提高。
2.6 pCABarMLPK 转基因甘蓝植株花期及蕾期亲和指数
从表 1 可以看出，非转基因植株花期自交亲和指数为 0.06，蕾期亲和指数为 0.45。一般认为，
花期亲和指数小于 0.5 或 1 的品系为强自交不亲和系；介于 l ~ 3 之间的为弱自交不亲和系；而大于
10 的被认定为自交亲和系（方智远 等，1983）。因此，本研究中所使用的甘蓝材料‘TF’为典型的
强自交不亲和系。而从调查的 5 株转基因植株来看，蕾期自交亲和指数除 10 号和 13 号单株外，均
显著高于野生型对照组；花期自交亲和指数均显著高于对照野生型花期自交亲和指数，其中 9 号、
12 号和 13 号单株花期自交亲和指数超过或接近对照野生型蕾期自交亲和指数。从本研究的结果来
看，反义 MLPK 基因的表达对打破甘蓝自交不亲和性起到了积极作用，但并不能完全打破自交不亲
和。

表 1 反义 MLPK 转基因甘蓝花期和蕾期自交亲和指数的调查结果
Table 1 Investigation of self-polination compatible index of antisense MLPK transgenic cabbage
花期授粉 Flowering stage 蕾期授粉 Bud stage
植株序号
No.
授粉花数
Number of
self-pollination
结籽数
Number of
seeds
亲和指数
Index of
self-compatible

授粉花数
Number of
self-pollination
结籽数
Number of
seeds
亲和指数
Index of
self-compatible
7 54 9 0.17 d 60 195 3.25 a
9 56 33 0.59 a 62 114 1.84 c
10 52 8 0.15 d 66 46 0.46 d
12 62 27 0.44 c 77 172 2.23 b
13 81 41 0.51 b 93 48 0.52 d
WT 63 4 0.06 e 137 67 0.45 d
注：显著水平为 P = 0.05。
Note：Significance level P = 0.05.
3 讨论
在芸薹属自交不亲和信号传导途径的研究中，对 S 位点所编码的 3 个基因 SRK、SCR/SP11 和
SLG 在该信号传导途径中的机制和功能已经清楚（Takayama & Isogai，2003）。上述 3 个关键基因的
功能缺失均会导致自交不亲和性的丧失。反义 SLG 基因在柱头特异启动子 SLG8 的驱动下转入大白
菜后获得的转基因植株花期亲和指数大幅度提高，等电聚焦 IEF 免疫分析中未见转基因植株中内源
SLG 蛋白的积累（Shiba et al.，2000）。而通过 RNAi 干扰 SCR/SP11 基因的表达能导致白菜自交不
亲和品种（Brassica rapa‘Osome’）花期结籽数量大幅度上升，获得一个白菜 SC 自交亲和系（Jung
et al.，2012）。甘蓝和油菜中导入 SRK 基因后产生内源 S 同源基因的共抑制沉默，自交不亲和系变
成了自交亲和系（Conner et al.，1997；Stahl et al.，1998）。
He Shao-min，Li Chun-yu，Lan Cai-yun，Zou Min，Ren Xue-song，Si Jun，Li Cheng-qiong，Song Hong-yuan.
Effect of antisense RNA of the MLPK gene on self-incompatibility in cabbage.
260 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (2)：252–262.
MLPK 属于植物胞质类受体激酶（receptor-like cytoplasmic kinase，RLCK）家族，具有丝氨酸/
苏氨酸激酶活性。在自交亲和突变体芜菁‘Yellow Sarson’柱头乳头细胞中瞬时表达 MLPK 可以恢
复其自交不亲和反应（Murase et al.，2004）。后来发现，因为转录起始位点的不同，芸薹属和拟南
芥中均存在 MLPKf1 和 MLPKf2 两个亚型，原位杂交显示两个转录本均在柱头乳头细胞表达而不在
雄蕊中表达（Murase et al.，2004；Kakita et al.，2007b）。然而在本研究中，3 株转基因甘蓝植株以
及非转基因植株在开花当天的雄蕊中均检测到 MLPK 的明显表达。鉴于目前有关 MLPK 基因的表达
特性研究主要集中在 Brassica rapa 上（Murase et al.，2004；Kakita et al.，2007b），因此，MLPK 基
因的表达特性是否与遗传背景相关尚待进一步的比较研究。MLPKf1 和 MLPKf2 氨基酸序列 N 端区
域不同，由此决定两种蛋白转到膜上的机制不同，其中 MLPKf1 通过其 N 端的豆蔻酰化基序定位到
膜上，而 MLPKf2 则通过其 N 端的疏水区定位到膜上。MLPKf1 和 MLPKf2 的表达被证明均能够恢
复 mlpk/mlpk 突变体的自交不亲和表型（Kakita et al.，2007b）。因此，MLPK 被认为是 SRK 下游一
个关键的信号传导因子。在芜菁中，MLPK 表达在开花前 2 d 快速增加，开花当天表达量达到最高
峰，且 MLPK 表达丰度与自交不亲和表型一致（Murase et al.，2004）。本研究中也发现野生型非转
基因植株在开花当天柱头中 MLPK 的积累量较蕾期高，而相应花期自交亲和指数（0.06）也远低于
蕾期自交亲和指数（0.45）。本研究中 3 株反义 MLPK 转基因植株开花当天柱头中 MLPK 基因 mRNA
积累量均明显低于非转基因野生型植株，自交亲和指数也较非转基因植株有明显提高，但转基因植
株之间花期自交亲和指数呈现较大的差异。另外，伴随花期自交亲和指数的提高，除了 13 号单株外，
其余 4 株转基因单株蕾期自交亲和指数也得到大幅度提高。由于自交不亲和的稳定性与环境因素、
不同开花阶段和遗传背景有明显的关系（Ockendon，1975；Horisaki & Niikura，2008），因此，出现
上述MLPK表达水平与亲和指数不完全一致的原因可能与试验期间植株种植于室外隔离网室而非室
内人工气候室，植株间生长状态差异以及环境条件（低温、频繁下雨）影响有一定关系。
目前已有多个处于 SRK 激酶下游的因子被确认参与芸薹属自交不亲和性信号传导（Cabrillac et
al.，2001；Stone et al.，2003；Murase et al.，2004；Samuel et al.，2009；Tantikanjana et al.，2009），
另外，不同于 MLPK、ARC1、THL1 等下游因子的遗传位点也在白菜中发现（Isokawa et al.，2010），
但到目前为止，这些下游因子在整个信号传导途径或者网络中的地位和作用仍不明确。MLPK 基因
在芜菁/白菜自交不亲和信号传导中能够起到与 S 位点基因相似的作用（Murase et al.，2004；Kakita
et al.，2007b），但在拟南芥以及芸薹属种间自交不亲和反应中，MLPK 被证明并非自交不亲和信号
传导所必需的元件（Udagawa et al.，2010；Kitashiba et al.，2011）。因此，处于 SRK 下游的 MLPK
因子在芸薹属中的作用和功能是否具有保守性还有待进一步研究。另外，SRK 下游有多个信号通路
被认为卷入芸薹属自交不亲和信号传导（Tantikanjana et al.，2010）。如 SRK 蛋白能导致 ARC1 蛋白
磷酸化并作为一个E3 Ubiquitin连接酶而实现下游蛋白的泛素化而导致自花花粉被拒绝（Stone et al.，
2003）。然而，在油菜 Brassica napus W1 柱头中反义抑制 ARC1 表达仅能部分打破自交不亲和，其
原因之一可能存在胞内其它信号蛋白对 ARC1 蛋白的缺失进行补偿（Stone et al.，1999）。MLPK 蛋
白在离体条件下能作为 SRK 激酶底物而发生磷酸化反应且在植物细胞中发生稳定互作（Kakita et
al.，2007a，2007b），同时，MLPK 蛋白也能导致 ARC1 蛋白磷酸化而实现其亚细胞定位（Samuel et
al.，2008）。在本研究中，反义基因 MLPK 在柱头的特异表达仅能部分打破甘蓝自交不亲和性而在
一定程度上提高花期以及蕾期结籽数量，该结果与 Stone 等（2003）在油菜中对 ARC1 的抑制表达
研究结果类似。该结果除了可以归咎于对目标基因 MLPK 的不彻底抑制表达外，由其它的自交不亲
和信号通路补偿 MLPK 途径缺失，导致转基因甘蓝自交不亲和性不能完全打破的可能性也是不能完
何绍敏，李春雨，兰彩耘，邹 敏，任雪松，司 军，李成琼，宋洪元.
转 MLPK 反义基因对甘蓝自交不亲和性的影响.
园艺学报，2015，42 (2)：252–262. 261

全排除的。当然，为彻底解析 MLPK 基因在甘蓝自交不亲和信号传导中的作用和功能，获得 MLPK
基因敲除突变体以及大量分析甘蓝自交亲和系的 M 位点将是必要的。

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