全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（8）：1583–1590 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–11–30；修回日期：2013–06–20
基金项目：山东省农业良种工程重大项目（鲁科农字[2008]167 号）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gszheng@qau.edu.cn）
牡丹病程相关蛋白 1 基因的克隆及表达分析
杨德翠，张玉喜，郑国生*
（青岛农业大学生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东青岛 266109）
摘 要：以牡丹柱枝孢叶斑病病原菌 Cylindrocladium canadense 处理的牡丹‘鲁菏红’叶片为材料，
根据已发表植物 PR1 的保守区域设计兼并引物，利用 RT-PCR 和 RACE 技术，获得病程相关蛋白 1 基因
的 cDNA，命名为 PsPR1。该序列全长为 744 bp，5′和 3′非翻译区分别有 42 bp 和 225 bp。该基因有 477 bp
的开放阅读框（ORF），编码 158 个氨基酸，成熟蛋白分子量 14.8 kD，等电点（pI）6.19，具有典型的
SCP_PR1_like 保守结构域。通过 Blast 比对发现该基因与多种植物病程相关蛋白 1 基因具有高度同源性。
通过实时荧光定量 PCR 检测，发现该基因在牡丹萼片中相对表达量最高，在正常生长的叶片中最少。该
基因受病原菌C. canadense和信号物质 SA的显著诱导，分别在处理的 24 h和 12 h达到最高峰，说明PsPR1
可能参与了牡丹的抗病防御过程。
关键词：牡丹；病程相关蛋白 1；基因克隆；表达分析
中图分类号：S 685.11 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）08-1583-08

Gene Cloning and Expression Analysis of Pathogenesis-related Protein 1 of
Paeonia suffruticosa
YANG De-cui，ZHANG Yu-xi，and ZHENG Guo-sheng*
（College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shangdong
Province，Qingdao，Shandong 266109，China）
Abstract：One pair of degenerate primer was designed according to the conservative domains of the
pathogenesis-related protein PR1 genes of other plants and using RT-PCR and RACE technology，a full
length cDNA of pathogenesis-related protein 1，named PsPR1，was obtained from leaves of Paeonia
suffruticosa‘Luhehong’，treated by Cylindrocladium canadense. Sequence analysis indicated that PsPR1
consisted of 744 bp and the 5′ UTR and 3′ UTR were 42 bp and 225 bp，respectively. The length of open
reading frame（ORF）was 477 nucleotides encoding 158 amino acids with molecular weight 14.8 kD，
isoelectric point 6.19. The deduced amino acids possessed SCP_PR1_like conserved domain. The PsPR1
was highly homologous to PR1，which have been isolated from other plants. Real-time PCR analysis
indicated that expression level of PsPR1 was the highest in sepal，but the lowest in leaves. PsPR1 was
significantly induced by C. canadense and signaling molecule salicylic acid（SA）and expression level of
PsPR1 reached the highest peak in 24 h and 12 h，respectively，which showed that PsPR1 might involved
in the disease defense.

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Key words：Paeonia suffruticosa；pathogenesis-related protein 1；gene clone；expression analysis

在生物和非生物胁迫下，植物通过迅速改变基因表达来对病原菌和外部胁迫做出反应，诱导一
些特殊蛋白的重新合成，其中大部分是病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）。一般认
为 PRs 共分为 17 个家族（van Loon et al.，2006），在植物抗病防御和系统获得抗性中起重要作用。
许多 PRs 有直接的抑菌活性（Alexander et al.，1993；Dassi et al.，1998；Kim & Hwang，2000）。在
不同的 PR 家族中，一个重要而功能又未知的是 PR1 蛋白。PR1 基因能被病原菌、SA 或乙烯诱导，
经常被用作系统获得抗性（Systemic Acquired Resistance，SAS）的分子标记（van Loon & van Strien，
1999），同时其基因编码产物 PR1 蛋白已成为近年来抗性研究的热点之一。
PR1 蛋白最早从烟草中发现（Antoniw et al.，1980），随后从许多单子叶和双子叶植物中鉴定出
PR1 基因（Kim & Hwang，2000；于玲 等，2001；Liu & Xue，2006；Mitsuhara et al.，2008；Li et al.，
2011），这些 PR1 蛋白分子量为 14 ~ 17 kD，有酸性和碱性，大多呈碱性。在同源性和结构上表现出
与真菌、昆虫、脊椎动物及人类相同，这表明 PR1 家族是高度保守的一类蛋白，在真核细胞中功能
相同（van Loon & van Strien，1999）。
不同 PRs 基因的表达水平和抗病性之间紧密相关（van Loon & van Strien，1999；van Loon et al.，
2006），目前，在已发现的 PRs 中，PR1、PR2 和 PR3 在离体条件下表现出不同程度的抗菌活性
（Rauscher et al.，1999）。Alexander 等（1993）在转 PRl-a 烟草中发现，该基因以组成型高效表达，
增加了烟草对两种卵菌、疫霉属，斜尖状孢子菌属侵染的耐受性。Niderman 等（1995）研究认为
PR1 蛋白在微克分子水平上就具有抗菌活性，可以抵抗许多植物的病原真菌。Niki 等（1998）研究
发现，PRl 基因表达量与水杨酸的积累密切相关，且表达量的升高增强了拟南芥对油菜霜霉病的抗
性。Sarowar 等（2005）将辣椒 PRl 蛋白基因 CaBPR1 转进烟草中过量表达，结果该基因表达后不
仅增强了烟草对多种病原菌的抗性，还增强了对重金属胁迫的抗性。
牡丹（Paeonia suffruticosa）因其具有观赏和药用价值而受到极大重视。但随着栽培面积的扩大，
其病害发生日益普遍，特别是由 Cylindrocladium canadense 侵染引起的牡丹柱枝孢叶斑病，发生普
遍，发病迅速（Li et al.，2010；赵丹和康业斌，2012）。目前牡丹抗病基因的克隆鲜有报道。本研
究参照葡萄（GU269634）、毛果杨（XM_002334340）、蓖麻（XM_002522024）、辣椒（AF053343）
等的 PR1 基因保守序列设计兼并引物并获得片段，利用 RACE 技术获得 cDNA 的全长序列，得到牡
丹的 PsPR1 基因，并对 PsPR1 基因在牡丹植株不同组织的表达，对病原菌 C. canadense、信号物质
SA 的响应进行了实时荧光定量研究，以便能更加了解 PR1 的特性和功能，为牡丹的抗病育种提供
资源。
1 材料与方法
1.1 材料
所用材料为 4 年生牡丹（Paeonia suffruticosa）品种‘鲁菏红’，2010 年秋天盆栽，埋入大田越
冬。2011 年 3 月放入温室，常规浇水施肥，生长健壮。牡丹柱枝孢叶斑病病原菌为 Cylindrocladium
canadense，为本试验室从牡丹病叶上分离并鉴定的菌种（杨德翠 等，2013）。将 C. canadense 在 PDA
培养基上培养 6 d，取出菌丝加无菌水用匀浆器匀浆，将菌液喷施致叶面滴水，罩塑料袋保湿 24 h；
另外，用 5 mmol · L-1、pH 5.7 的水杨酸（SA）喷施牡丹叶片；以无菌水喷施牡丹叶作为对照，均
在 0、12、24、48、72 和 96 h 时取样，液氮处理，–70 ℃保存。
8 期 杨德翠等：牡丹病程相关蛋白 1 基因的克隆及表达分析 1585

RNA提取采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（天津原平皓），反转录试剂盒购自Fermentas
公司 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，快速扩增 cDNA 末端试剂盒为 clonteck SMARTer
RACE cDNA Amplification Kit，SA 购自上海生工，其余所用到一些相关的分子试剂均购自大连宝生
物工程有限公司。引物合成和测序委托上海博尚生物技术有限公司完成。
1.2 目的基因 PCR 扩增和 cDNA 全长的获得
由 C. canadense 处理的牡丹叶片总 RNA 的提取按照 EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒说明
书进行，浓度用 SmartSpec Plus 核酸蛋白测定仪进行测定，RNA 完整性通过 1%琼脂糖凝胶电泳进
行检测。反转录按照 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 cDNA 第 1 链的合成。
以反转录产物为模板，所用引物为兼并引物，上下游分别 PsPR1F-1 和 PsPR1R-1（表 1）。PCR
反应条件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。
反应结束后 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，将目的片段回收纯化并连接至 pMD18-T 载体，转化 DH5α
大肠杆菌，挑选阳性克隆菌落，委托上海博尚生物技术有限公司测序。根据所得片段设计基因特异
引物，3′RACE 和 5′RACE 引物分别为 PsPR1F-2 和 PsPR1R-2，按操作指南进行，PCR 反应条件为
94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，4 个循环；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min， 29
个循环，4 ℃保存。对所得片段经测序和 DNAMAN 分析，获得 cDNA 全长。为了验证，在阅读框
两端设计基因特异引物 PsPR1F-3 和 PsPR1R-3，PCR 反应条件如下：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，58 ℃
30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃ 保存。对所得片段测序，方法同上。

表 1 本试验中所用引物
Table 1 Primers in this study
名称 Primer name 序列 Sequence
PsPR1F-1 5′-CCTTA(C/T)GG(T/C/G)GA(G/A)AAC(C/T/A)T(T/A/G)GC-3′
PsPR1R-1 5′-GCCA(A/G)AC(G/A/T)AC(C/T)TGAGT(G/A)TA(A/G)TG-3′
PsPR1F-2 5′-CATGAGCACTGGCGATCTTTCGGGCAC-3′
PsPR1R-2 5′-ACCCACATCTTGACAGCTCCAGTACCCG-3′
PsPR1F-3 5′-AAGGATCCATGTTGTGTAAGATCTCTCTGGTGTGCC -3′
PsPR1R-3 5′-CGAGCTCGCTAGTAAGGACGCTGGCCAAC -3′
PsPR1F-4 5′-CTCCGCCCAAGACTCCCCACAAG-3′
PsPR1R-4 5′-GCAAGATTCTCACCATAGGGACCACCAG-3′
ActinF 5′-GAGAGATTCCGTTGCCCTGA-3′
ActinR 5′-CTCAGGAGGAGCAACCACC-3′

1.3 实时荧光定量 PCR
根据所得 cDNA 序列设计上下游引物分别为 PsPR1F-4 和 PsPR1R-4（表 1），内参基因 β-Actin
的一对特异引物为 ActinF 和 ActinR。荧光定量 PCR 按照荧光试剂 SYBR-Green（TaKaRa 公司）试
剂盒进行，按照说明书配制反应体系，在罗氏 LightCycler 480 system 荧光定量 PCR 仪上扩增。反
应条件为：94 ℃预变性 30 s；94 ℃变性 5 s，53 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 1 min，40 个循环；72 ℃延
伸 5 min。由仪器自带的软件 LightCycler 480 得到原始数据后再在 Excel 中计算相对表达量和方差。
3 次重复，求平均值，用 SAS 8.1 数据处理软件进行显著性分析。
1.4 生物信息学分析
利用 DNAMANV6 进行基因的 cDNA 全长核苷酸序列分析、阅读框查找、推测氨基酸序列以及
氨基酸序列的同源性比对；利用 NCBI 数据库中的 BLAST（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast）
进行同源序列查找；利用 ProtParam 程序（http：//expasy. org/cgi-bin/protparam）预测蛋白质的分子
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量和等电点；利用 SignalP（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）进行蛋白质的信号肽分析；
利用 MEGA4.1 做进化树分析；利用 http：//www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form.html 预测
蛋白质的跨膜结构域。
2 结果与分析
2.1 PsPR1 基因全长 cDNA 的克隆
参考其他植物PR1基因的保守序列设计兼并引物，经RT-PCR获得特异条带，片段长度为151 bp，
与期望值相符（图 1，A）。根据所得片段序列设计基因特异性引物，做 3′RACE 和 5′RACE，获得 3′
端和 5′端的片段长度分别为 496 bp（图 1，B）和 375 bp（图 1，C）。将所得序列进行拼接获得 cDNA
全长，为 744 bp，5′非翻译区（the 5′ untranslated region，5′UTR）长 42 bp，3′非翻译区（the 3′ untranslated
region，3′UTR）长 225 bp，具有 38 个 poly(A)，开放阅读框（open reading frame，ORF）为 477 bp
（图 1，D），编码 158 个氨基酸。将该基因命名为 PsPR1，其核苷酸和推测氨基酸序列如图 2。

图 1 牡丹 PsPR1 不同引物扩增片段的琼脂糖电泳检测
M：DL2000 marker；A：兼并引物 PCR 产物片段；B：3′RACE 产物；C：5′RACE 产物；D：开放阅读框片段。
Fig. 1 Detection by agarose gel electrophoresis of PsPR1 amplified from P. suffruticosa with different primers
M：DL2000 marker；A：Degenerated primers PCR product；B：3′RACE product；
C：5′RACE product；D：Open reading frame fragment.















图 2 PsPR1 基因 cDNA 全长核苷酸序列和推测氨基酸序列
*处是起始、终止密码子。
Fig. 2 Nucleotide sequence of PsPR1 cDNA and deduced amino acid sequence
* Translation initiation and stop codon.
8 期 杨德翠等：牡丹病程相关蛋白 1 基因的克隆及表达分析 1587

2.2 PsPR1 蛋白序列分析
利用在线 SignalP 推测，PsPR1 的第 1 ~ 20 个氨基酸是信号肽序列，切割位点在 21 到 22 个氨
基酸之间。蛋白质专家分析成熟蛋白分子量为 14.8 kD，等电点为 6.19，为酸性蛋白，软件预测有跨
膜结构域，可能位于细胞间隙中。
将所得到的 PsPR1 氨基酸序列与其它植物 PR1 氨基酸序列比对（图 3），结果显示 PsPR1 蛋白
与杨树（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis hybrid），拟南芥（Arabidopsis thaliana）和蓖麻（Ricinus
communis）的 PR1 蛋白均具有高度相似性，分别为 68%、67%、64%、60%，与单子叶植物水稻（Oryza
sativa）的同源性达 50%。通过与在线 NCBI 中 CCD 数据库比对，发现该蛋白中包含一个保守的
SCP-PR1-like 结构域，也包含富含半胱氨酸（cysteine-rich secretory protein，CAP）保守结构域，含
有 6 个保守的丝氨酸残基，形成 3 对二硫键，这表示该蛋白即为 PR1 在牡丹中的同源蛋白。


图 3 牡丹 PsPR1 与其它植物 PR1 序列同源性分析
牡丹：PsPR1；拟南芥：AtPR1（NM_127025）；杨树：PtPR1（XM_002313898）；蓖麻：RcPR1（XM_002522024）；葡萄：VpPR1（HM346858）；
水稻：OsPRl（BAB84473）；黑色：完全相同的氨基酸序列；灰色：50%以上相同的氨基酸序列；……：信号肽。
Fig. 3 Alignment of the predicted amino acid sequences of PsPR1 and PR1s of other plants
Paeonia suffruticosa：PsPR1；Arabidopsis thaliana：AtPR1（NM_127025）；Populus trichocarpa：PtPR1（XM_002313898）；Ricinus communis：
RcPR1（XM_002522024）；Vitis hybrid：VpPR1（HM346858）；Oryza sativa：OsPRl（BAB84473）；Black：Identical residues in amino acid
sequence；Gray：More than 50% of the same in amino acid sequence；……：Signal peptide.

将牡丹 PsPR1 与 NCBI 检索的其他 11 种植物 PR1 同源蛋白进行序列比对并构建系统发育树，
结果（图 4）显示与许多植物的 PR1 具有同源性。其中与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、油菜（Brassica



图 4 植物 PR1 蛋白同源序列的系统发育树
图中数字代表进化距离。
Fig. 4 Phylogenetic tree of PR1 homologous sequences from plants
Number in the figure represent evolutionary distance.
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napus）聚为一类；苹果（Malus × domestica）、杨树（Populus trichocarpa）和蓖麻（Ricinus communis）
聚为一类；葡萄（Vitis hybrid cultivar）与马铃薯（Solanum tuberosum）PR1 聚为一类；烟草（Nicotiana
tabacum）与番茄（Lycopersicon esculentum）的 PR1 聚为一类，以上植物均属于双子叶植物，而单
子叶植物水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）与双子叶植物 PR1 亲缘关系相对较远。
2.3 牡丹 PsPR1 组织表达特性分析
由图 5 可知，牡丹品种‘鲁菏红’不同组织中 PsPR1 相对表达量存在显著差异。在萼片中最高，
根、茎、芽和雄蕊中较高，正常生长的叶片中最少。
2.4 病原菌 C. canadense 和 SA 对牡丹叶片 PsPR1 表达的影响
病原菌 C. canadense 处理牡丹叶片的不同时间，PsPR1 的相对表达量有显著的差异，从 12 h 开
始显著增加（图 6），到 24 h 表达量达到高峰，随后开始下降，但表达量一直高于对照。同时也研
究了 SA 处理对牡丹叶片 PsPR1 表达量的影响。SA 处理后在 12 h 上升到高峰，然后下降，但高于
对照。结果表明牡丹 C. canadense 和 SA 都能诱导 PsPR1 的表达量增加，说明 PsPR1 可能参与了牡
丹的抗病防御过程。





3 讨论
牡丹是木本植物，基因组高度杂合，常规选育抗病品种困难，从牡丹自身上挖掘抗病相关基因
是缓解牡丹病害的有效途径。本研究中利用 RT-PCR 和 RACE 技术在牡丹‘鲁菏红’上成功获得了
牡丹病程相关蛋白 1 基因（PsPR1）cDNA 全长，推测 PsPR1 蛋白为酸性，pI 为 6.19。虽然研究中
发现的 PR1 蛋白多为碱性，但 Li 等（2011）认为，不能简单的以 pI 值和序列同源性来判断 PR1 能
否增强抗病性，而必须试验后再确定。
将所得 PsPR1 序列进行同源性比对发现，PsPR1 蛋白与杨树（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis
hybrid）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和蓖麻（Ricinus communis）以及单子叶植物水稻（Oryza sativa）
都高度同源。该蛋白中包含一个保守的 SCP-PR1-like 结构域，不同植物来源的 PR1 蛋白保守区域上
的相似性，表明 PR1 蛋白是 PRs 家族中高度保守的一类成员，较高的 PR1 蛋白同源性说明可能起
源相同，这一结果与 van Loon 等（2006）的一致。
图 5 牡丹 PsPR1 组织表达特性
Fig. 5 Characterization of PsPR1 expression in tissues
of P. suffruticosa
图 6 C. canadense 和 SA 对牡丹叶片 PsPR1 表达的影响
Fig. 6 Effects of C. canadense and SA on expression of PsPR1 in
leaves of P. suffruticosa
8 期 杨德翠等：牡丹病程相关蛋白 1 基因的克隆及表达分析 1589

对 PR1 基因在植物体内组织的分布、表达时间、表达量的研究有助于了解 PRl 基因的功能。研
究发现，PsPR1 在植物体内属于组成型的基因，在不同的组织中表达量不同，但在叶片中含量相对
较低，葡萄 VvPR1 在叶片中含量最高（侯丽霞 等，2012）。Tornero（1997）认为组成型的 PR1 基
因表达可能参与特定类型的免疫，这种组成型表达模式构成了植物对某种特定病原菌的自然抗性基
础。
系统获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）具有系统性、持久性和广谱性的特点，并伴
随一系列病程相关蛋白（RPs）的产生，是植物产生的最有效的抗性反应（van Loon，1997）。研究
表明，尽管 PRs 的积累不是诱导 SAR 产生的前提条件，但 PRs 与植物 SAR 直接相关。SAR 的产生
依靠水杨酸（Salicylic acid，SA）信号传导途径，SA 可诱导拟南芥等植物 PR1 表达（Henanff et al.，
2009）。本研究中 SA 处理牡丹叶片，PsPR1 相对表达量在 12 h 达到最高，然后下降，但仍高于对照。
这说明 SA 确实能诱导 PsPR1 的表达，这与许多植物的 PR1 基因对 SA 的反应（王彦华 等，2006；
罗红丽 等，2011；侯丽霞 等，2012）一致。多年来，对 PR1 蛋白的作用及功能不断进行研究，van
Huijsduijnen 等（1985）发现烟草受到 TMV 侵染后，PR1 表达水平可提高上千倍。Muradov 等（1993）
发现当抗白粉菌的大麦接种白粉菌 12 h 后，其 PRb-1 基因的转录产物显著积累。本研究中 C.
canadense 处理牡丹叶片，发现在处理 24 h PsPR1 的相对表达量较高，这说明病原菌 C. canadense
诱导了 PsPR1 的表达。
综合以上研究结果，说明 PsPR1 参与了牡丹的生长发育和对病原菌的防御过程。目前对 PR1
功能的研究还较少（van Loon et al.，2006）。拟打算进一步通过转 PsPR1 烟草对病原菌和各种逆境
的反应进行研究，更多了解 PsPR1 功能和特性，以期为 PsPR1 在牡丹抗病育种上的应用奠定基础。

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