全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（3）：469–476 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–12–19；修回日期：2012–02–21
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（2009QC027）；湖北省自然科学基金项目（2010CBB01703）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wanzj@mail.hzau.edu.cn）
致谢：本文得到华中农业大学植物科学学院李再云教授的修改，在此表示感谢。
大白菜 hau 胞质雄性不育系的鉴定及不育相关
基因结构分析
施 展，万正杰*，徐跃进，李雪红，邹瑞昌
（华中农业大学园艺林学学院，华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）
摘 要：采用染色体压片法和形态观察法，对大白菜 hau 胞质雄性不育材料 6w-9605A 的 2 个遗传世
代（F1和 BC6）的染色体数和花器官进行鉴定。结果表明：F1 染色体数为 28 条；BC6 染色体数为 20 条，
与白菜的染色体数相同。6w-9605A 的花药呈三角形，干瘪无花粉，败育彻底。利用芸薹属作物雄性不育
基因线粒体保守序列设计 3 对引物，在 6w-9605A 中扩增出 867 bp 的片段。基因预测显示，在线粒体基
因 atp6 的下游产生 1 个新的开放阅读框为 orf288，与目前报道的芸薹属作物细胞质雄性不育相关基因
orf224、orf138 等均不相同，这种新的基因结构特点极有可能就是大白菜 hau 胞质不育系 6w-9605A 产生
不育的原因。
关键词：大白菜；雄性不育；hau 胞质；不育基因
中图分类号：S 634.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）03-0469-08

Characterization of the Chinese Cabbage hau Cytoplasmic Male-sterile
Line and Sequence Analysis of the Fertility-related Gene
SHI Zhan，WAN Zheng-jie*，XU Yue-jin，LI Xue-hong，and ZOU Rui-chang
（College of Horticulture and Forestry，Huazhong Agricultural University，Education Ministry Key Laboratory of
Horticultural Plant Biology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）
Abstract：The male-sterility of the Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）line
6w-9605A，a cytoplasmic male-sterile line，was studied in this research. Chromosome squashing revealed
that the chromosome numbers in the F1 and BC6 of 6w-9605A were 28 and 20，respectively，and
morphologic observation in the BC6 of 6w-9605A showed that the anthers of this line were degenerated
and completely abortive. Further，primers were designed based on the conserved sequence of known
cytoplasmic male sterility genes in the Brassica species，and a new open reading frame（ORF）of 867 base
pairs was amplified from 6w-9605A. Sequence analysis showed that this ORF located downstream from
the mitochondrial gene apt6 and was predicted as orf288. Sequence alignment demonstrated that the ORF
is different from the sterile genes of pol CMS and ogu CMS，and it may cause the sterility of 6w-9605A.
Key words：Chinese cabbage；male-sterility；hau cytoplasm male-sterile line；infertility genes

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大白菜（Brassica compestris L. spp. pekinensis）一代杂种生产的主要途径为利用自交不亲和系或
者雄性不育系。但是利用自交不亲和系生产一代杂种存在亲本连续自交生活力易衰退，繁殖需人工
剥蕾授粉，成本高等缺陷（刘玉梅 等，2002），而利用细胞质雄性不育系更易得到高质量一代杂种，
且具有制种简单、应用方便、成本低廉等优点（赵利民 等，2008）。所以细胞质雄性不育成为生产
大白菜一代杂种的理想系统而被广泛应用。
关于白菜细胞质雄性不育系的选育及应用，前人已经做很多研究并取得一些进展。柯桂兰等
（1992）以 pol CMS 甘蓝型油菜为母本，用大白菜 3411-7 为父本，通过连续回交选育，育成了大白
菜 pol 胞质雄性不育系 CMS3411-7。大白菜细胞质雄性不育源主要来自于萝卜（ogura）和甘蓝型油
菜（polima）等异源材料，由于细胞质单一、遗传性脆弱，存在引起毁灭性病虫害的危险，不利于
大白菜一代杂种的生产，所以必须加强新的不育资源的引进和挖掘。王学芳等（2004）用甘蓝型油
菜胞质雄性不育系陕 2A 作为不育源，成功转育成大白菜不育系 12A，及白菜不育系青 1A 和青 2A。
刘惠吉和王华（2004）以榨菜胞质雄性不育系为母本，通过远缘杂交和多代回交选育成茎芥菜胞质
白菜雄性不育系。
对细胞质雄性不育的鉴定方法有细胞学标记、蛋白质标记、同工酶和 DNA 分子标记等，由于
DNA 多态性分子标记比较稳定，通过特异引物 PCR 技术来鉴定细胞质类型已经被普遍使用
（Bonhomme et al.，1992）。orf138、orf224-atp6 分别是 ogu、pol 不育类型的主控基因，仅在各自不
育类型中存在与特异表达（Liu et al.，2002）。
本研究中采用的大白菜细胞质雄性不育材料 6w-9605A 是以芥菜细胞质雄性不育 hau CMS 为不
育源转育而来的。万正杰等（2006）和 Wan 等（2008）对 hau CMS 进行了综合遗传分类，细胞学
观察，雄性不育相关候选基因的鉴定。本试验是在前人研究的基础上，综合细胞学技术、特异引物
的 PCR 标记技术以及基因克隆序列比对，对大白菜 hau 细胞质雄性不育系 6w-9605A 进行鉴定和不
育相关基因的结构分析，为大白菜种质资源评价、杂种优势的高效利用和雄性不育分子机理研究提
供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为大白菜 hau 细胞质雄性不育系 6w-9605A、保持系 6w-9605B、原始芥菜型油菜 hau
CMS、大白菜 ogu CMS 和大白菜 pol CMS。6w-9605A 是以芥菜型油菜细胞质雄性不育 hau CMS 为
不育源，以大白菜 DH 系为轮回亲本，通过种间杂交和连续回交（F1BC6），获得的遗传稳定的大白
菜细胞质雄性不育系。所有材料由国家蔬菜改良中心华中分中心提供。
本试验于 2010 年 8—12 月在国家蔬菜改良中心华中分中心（华中农业大学校内）基地和园艺植
物生物学教育部重点实验室内进行。试验材料于 2010 年 8 月 25 日播种，9 月 12 日取样，10 月中旬
定植于国家蔬菜改良中心华中分中心实验田，进行正常的田间肥水管理。
1.2 花器官形态和细胞染色体数观察
于盛花期田间观察大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 和保持系 6w-9605Ｂ的花器官形态，每
个材料随机取 20 株，测量其花瓣开展程度、花瓣大小、花药形态、花丝长短、柱头长短等指标，做
方差分析，并拍照记录。
取大白菜雄性不育材料 6w-9605A 的 F1（芥菜 hau CMS × 6w-9605B）和 BC6（6w-9605B 为轮
3 期 施 展等：大白菜 hau 胞质雄性不育系的鉴定及不育相关基因结构分析 471

回亲本）的小花蕾，用镊子剥取花蕾中的雌蕊，放于 0.002 mol · L-1 8–羟基喹啉中 22 ℃处理 2 h，
蒸馏水冲洗 2 ~ 3 次，卡诺式（无水酒精︰冰醋酸 = 3︰1）固定 24 h。于 1 mol · L-1 稀盐酸中解离 8 ~
10 min（60 ℃），蒸馏水冲洗几次置于洁净的载玻片上，用吸水纸吸去周围的水，用解剖针充分压
碎，改良苯酚品红染液染色 5 ~ 8 min 压片，在 Olympus CX41 显微镜观察，Mshot MD30 摄影。
1.3 不育基因结构研究
1.3.1 基因组 DNA的提取
取适量幼嫩叶片，采用改良的 CTAB 法提取基因组 DNA（Liu et al.，2003）。用 1 × TE 溶解稀
释 DNA 至 20 ng · μL-1，贮于–20 ℃冰箱中备用。
1.3.2 基因组 RNA的提取和 cDNA的合成
取适量幼嫩叶片，采用 TRIZOL 法提取基因组 RNA，溶于 20 μL DEPC-H2O，进行第一链 cDNA
合成（采用 Fermentas 试剂盒），贮于–20 ℃冰箱中备用。
1.3.3 引物设计
根据 GenBank 中登记的 orf138、orf224-atp6 和 orf263-atp6（Yuan et al.，2003）开放阅读框保
守区序列设计 3 对特异引物（表 1），由上海生物工程有限公司合成。

表 1 特异线粒体片段扩增所用的引物序列
Table 1 Primer sequences used for amplification
引物名称
Primer names
引物序列（5′–3′）
Primer sequences
orf263 primer F
orf263 primer R
orf138 primer F
orf138 primer R
atp6-orf 224 primer F
atp6-orf 224 primer R
ATGAAAAATAGACTCCAA
TCAGTCTAGATAATGCCG
GCCCATATTTGGCTAAGCTG
TTTTCTCGGTCCATTTTCCA
TGAAATGGGAGGTCAGAAGC
AAAAGGTGCTAACGGCAGTG

1.3.4 PCR扩增
PCR 反应体系为 25 μL，含 40 ng 基因组 DNA 和 cDNA，1.5 mmol · L-1 MgCl2，0.2 mmol · L-1
dNTPs，正反引物各 0.025 μmol · L-1，0.8 U Taq DNA 聚合酶。PCR 扩增程序 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，
56 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，35 个循环；72 ℃ 10 min 延伸。扩增产物于 1.2%琼脂糖凝胶上电泳，
紫外灯下拍照。
1.3.5 克隆和测序
采用北京庄盟生物技术有限公司的胶回收试剂盒回收目的片段；回收的 DNA 片段连接到
PSURE-T 载体上，连接产物转化感受态细胞。选取经 PCR 鉴定已插入目的条带的菌液送交上海桑
尼生物技术有限公司进行测序，测序结果于 NCBI 上比较相似性。同时用 DNAStar 软件对获得的序
列进行基因预测。
2 结果与分析
2.1 大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 及其保持系的花器官形态
如图 1 所示，大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 花朵开放正常，与保持系 6w-9605B 的花朵颜
色一致。不育系和保持系蜜腺正常，6 枚雄蕊分两轮，外轮 2 枚雄蕊的花丝较短，内轮 4 枚较长。
不育系 6w-9605A 的柱头明显高于雄蕊，雄蕊花丝短，花药呈三角形，干瘪无花粉；保持系 6w-9605B
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的柱头略高于雄蕊，雄蕊花丝较 6w-9605A 长，花药呈遁形，且饱满有明显淡黄色花粉。
不育系 6w-9605A 的花冠开展度、花瓣长与宽、雄蕊长、花丝长都显著小于保持系，而两者花
柱长度差异不显著（表 2）。

图 1 大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A（A）及保持系 6w-9605B（B）的花器官形态图
Fig. 1 Flower morphology of male sterile line 6w-9605A（A）and its maintainer line 6w-9605B（B）

表 2 大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 和保持系 6w-9605B 花器官大小比较
Table 2 Comparison of the flower organs forms between sterile flowers and fertile flowers /mm
材 料
Material
四强雄蕊（二弱雄蕊）
Tetradynamous stamen
(Two weak stamen)
四强花丝（二弱花丝）
Tetradynamous thrum
(Two weak thrum)
花柱长
Length of style
花朵开展度
Corolla expansion
花瓣长（花瓣宽）
Length of petal
(Width of petal)
6w-9605 A 2.332 ± 0.054 b
(1.904 ± 0.115 b)
0.750 ± 0.034 b
(0.538 ± 0.077 b)
7.552 ± 0.183 a 17.611 ± 0.262 b 10.099 ± 0.145 b
(5.777 ± 0.079 b)
6w-9605 B 7.436 ± 0.073 a
(6.013 ± 0.100 a)
5.654 ± 0.089 a
(4.216 ± 0.081 a)
7.960 ± 0.240 a 18.521 ± 0.320 a

11.113 ± 0.173 a
(7.531 ± 0.144 a)

2.2 大白菜细胞质雄性不育系回交后代的染色体数
通过对大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 的 F1（芥菜 hauCMS × 6w-9605B）和 BC6（6w-9605B
为轮回亲本）的花蕾进行染色体压片观察，发现 F1 代染色体数为 28 条，BC6 染色体数为 20 条（图
2），表明随着回交代数的增加，大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 与大白菜的染色体数已经相同。

图 2 大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 染色体数
Fig. 2 The chromosome number of 6w-9605A
3 期 施 展等：大白菜 hau 胞质雄性不育系的鉴定及不育相关基因结构分析 473

2.3 大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 的不育基因结构特点
2.3.1 特异引物 orf263、orf138和 orf224-atp6的扩增结果
利用 3 对特异引物对 4 个细胞质雄性不育系进行 PCR 扩增（图 3），发现任意 1 对特异引物在
保持系中都没有扩增出差异条带，用 orf263 引物在 6w-9605A 和 hau CMS 中扩增出 750 ~ 1 000 bp
之间的特异片段，用 orf138 和 orf224-atp6 引物在不育系 6w-9605A 和 hau CMS 中都没有扩增出特
异片段，但在 ogu CMS 和 pol CMS 中分别扩增出 300 bp 和 800 bp 左右的特异片段，说明设计的这
3 对引物能够将 hau CMS、ogu CMS 和 pol CMS 胞质区分开。


图 3 特异引物 orf263-atp6，orf138 及 orf224-atp6 的 PCR 扩增结果
M：Marker（DL2000）；1：保持系 6w-9605B；2：不育系 6w-9605A；3：hau CMS；4：ogu CMS；5：pol CMS。
Fig. 3 The amplified pattern of specific primers orf263，orf138 and orf224-atp6
M：Marker（DL2000）；1：Maintainer line 6w-9605B；2：Male sterile 6w-9605A；
3：hau CMS；4：oguCMS；5：pol CMS.

2.3.2 序列同源性比较及基因预测
以大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 的基因组 DNA 为模板，通过 orf263 引物 PCR、克隆和
测序，获得 6w-9605A 的特异性片段序列长为 867 bp。如图 4 所示，将其提交到 GenBank 进行标准


图 4 6w-9605A 与 tour CMS orf263 的同源性比较
Fig. 4 Homologous comparis on of nucleotide sequence between 6w-9605A and tour CMS orf263

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的 Blast 核苷酸相似序列搜索，该片段与已知的油菜型胞质雄性不育 tour CMS 的不育基因 orf263 序
列（793 bp）相似，在相似的 793 bp 中只在 485 bp 和 786 bp 处各存在 1 个碱基的置换，在 765 bp
处存在 1 个碱基的缺失，同源性为 99%。
应用软件 DNAstar 分析不育系 6w-9605A 的序列并进行基因预测，获得 1 个新的开放阅读框
orf288（876 bp），此开放阅读框与 orf263 存在 3 个碱基的差异，但下游比 orf263 多 75 bp 碱基（图
5）。


图 5 atp6-orf288 基因区段示意图
不育系 6w-9605A：RBS1 为核糖体结合位点，orf288 为 867 bp 的一个新开放阅读框；箭头 485 bp 和 786 bp 表示
碱基的置换，765 bp 表示碱基的缺失；ATG 和 TGA 分别表示转录开始和终止位点。
tour CMS：来自已经公布的 tour CMS 线粒体序列。
Fig. 5 The Gene region schematic diagram of atp6-orf288 of 6w-9605A in B.juncea
6w-9605A：‘RBS1’indicate ribosome binding site，orf288 is a new open read frame which fragment is 867 bp，
arrowheads in the location of 485 bp and 786 bp are the replacement of the base，the location of 765 bp is the deletion of
the base. The Other two locations indicate the replacement of two bases.‘ATG’and
‘TGA’indicates the beginning and termination of transcription separately.
The sequence of tour CMS is from the result of Land-grant.

2.3.3 大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A cDNA扩增结果与基因区段的验证
提取大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A 的基因组 RNA，合成第 1 链 cDNA，以基因组 cDNA
为模板，通过特异引物 orf263 进行 PCR 扩增，扩增出 750 ~ 1 000 bp 之间的特异条带（图 6），克隆
并测序，获得长为 867 bp 片段序列，将其与通过基因组 DNA 获得的特异性片段比对，同源性达到
100%，从而验证了大白菜胞质不育系 6w-9605A 的 atp6-orf288 基因区段的准确性。

图 6 大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A cDNA 用特异引物 orf263 的 PCR 扩增结果
M：Marker（DL 2000）；1 ~ 4：不育系 6w-9605A。
Fig. 6 The amplified pattern of cDNA with specific primers orf263 in 6w-9605A
M：Marker（DL 2000）；1–4：Male sterile 6w-9605A.

3 期 施 展等：大白菜 hau 胞质雄性不育系的鉴定及不育相关基因结构分析 475

3 讨论
细胞质雄性不育系的来源通常有 2 种：一是自然繁殖过程中发生的突变或品种间杂交产生的同
源细胞质雄性不育，如 pol CMS，hau CMS，二是种属间远缘杂交形成的细胞质和细胞核基因组重
组而导致的异源细胞质雄性不育（Schnable & Wise，1998）。
hau CMS 是傅廷栋 1999 年发现的天然芥菜型油菜细胞质雄性不育型（万正杰 等，2006）。本
研究中以大白菜 DH 系 6w-9605B 为轮回亲本，通过不育系与 DH 系种间杂交并连续回交 F1BC6，获
得遗传稳定的大白菜细胞质雄性不育系 6w-9605A。芥菜型油菜的染色体组为 AABB，染色体数为
2n = 4x = 36；大白菜的染色体组为 AA，染色体数为 2n = 2x = 20，AA。在回交转育中，轮回亲本
的核基因不断替换非轮回亲本的核基因，经检测，F1 代染色体数为 28 条，属于中间型。随着回交
世代的增加，6w-9605A 的染色体数趋于大白菜染色体数，说明其核已经被保持系核基因组替代，
获得了遗传稳定的大白菜细胞质雄性不育系，这与张艳等（2010）的研究结果一致。同时对大白菜
细胞质雄性不育系 6w-9605A BC6 进行花器官观察，发现其蜜腺正常，花药呈三角形，干瘪无花粉，
败育彻底，不育株率和不育度为 100%，可以作为大白菜细胞质雄性不育系的种质资源加以利用。
大白菜不育胞质类型的分类和鉴定有助于掌握其遗传规律和研究遗传机理，为人工合成保持系
或者合理利用雄性不育系提供理论基础（陈沁滨 等，2006）。不同类型的 CMS 分别与一种线粒体
基因密切相关（郭宝健 等，2007），ogura CMS 和 pol CMS 分别由 orf138 和 orf224 线粒体基因控制
（Hanson & Bentolila，2004），Yuan 等（2003）对 pol CMS 三系进行 Northern 检测发现 orf224/atp6
的表达与 pol CMS 相关。本研究中通过特异引物 PCR、克隆、测序及特异性片段的基因预测并通过
RNA 编辑的对比验证，在大白菜 hau 胞质雄性不育系 6w-9605A 中发现 1 个新的开放阅读框 orf288
（867 bp）。orf288 与已知的 tour CMS 不育基因 orf263 存在 3 个碱基的差异，但下游比 orf263 多 75
bp 碱基，说明 orf288 是一个不同的开放阅读框，这与前人报道的芸薹属作物雄性不育基因区域均不
相同，但与万正杰等（2006）和 Wan 等（2008）对原始芥菜型油菜 hau CMS 的不育相关候选基因
的验证结果是一致的，从而为 hau 细胞质雄性不育基因的克隆和分子机理解析提供了进一步的依
据。

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