全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（11）：2161–2170 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–05–27；修回日期：2013–09–16
基金项目：国家自然科学基金项目（30900986）；重庆市自然科学基金项目（2009BB1298）；西南大学博士基金项目（SWUB2008042）；
中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2010B010，XDJK2009C126）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gaoqg2004031@163.com；Tel：023-68251274）
甘蓝自交不亲和相关转录因子BosiPA1蛋白基因
的克隆与表达分析
刘豫东 1，朱利泉 2,*，高启国 1,*，曾 静 2，张林成 1，任雪松 1，王小佳 1
（1 西南大学园艺园林学院 ，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400716；2 西南大学农学与生物科技学院，
重庆 400716）
摘 要：通过自交不亲和甘蓝‘A1’自花授粉 1 h 和未授粉柱头蛋白质表达谱的对比，鉴定出 1 个受
自花授粉诱导上调表达的蛋白，通过 PCR 技术获取了其编码序列，命名为 BosiPA1 蛋白，其基因全长为
3 730 bp，具有 1 个 1 092 bp 的完整编码框（KF314579）。BosiPA1 由 6 个外显子、5 个内含子组成，编码
363 个氨基酸。序列分析表明 BosiPA1 蛋白具有典型的 basic helix-loop-helix（bHLH）功能域，在 SCR、SRK、
Exo70A1 基因的 ATG 上游启动子序列中存在可以被 bHLH 功能区识别并结合的 E-box（CANNTG）序列。
在分子进化上甘蓝BosiPA1与AtbHLH128距离最近，与AtHEC1/2/3和TgGBOF-1处在同一个分支。RT-PCR
检测表明甘蓝 BosiPA1 基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中均有表达；荧光定量 PCR 分析表明 BosiPA1
基因在自花授粉 10 min、30 min、1 h 的柱头中呈逐渐上升趋势。上述结果说明 BosiPA1 与 bHLH 的进化
分支较早，可能是一个参与甘蓝多器官发育的自交不亲和相关的转录因子。
关键词：甘蓝；bHLH 转录因子；基因克隆；表达分析
中图分类号：S 635 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）11-2161-10

Molecular Cloning and Expression Analysis of Transcription Factor
BosiPA1 in Brasscia oleracea
LIU Yu-dong1，ZHU Li-quan2,*，GAO Qi-guo1,*，ZENG Jing2，ZHANG Lin-cheng1，REN Xue-song1，
and WANG Xiao-jia1
（1College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Key Laboratory of Horticulture Science for
Southern Mountainous Regions，Ministry of Education，Chongqing 400716，China； 2College of Agronomy and
Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400716，China）
Abstract：Through the contrast of the stigma protein expression profiling between after self-pollination
and none-pollination of Brasscia oleracea L. SI line A1，an up-regulated protein was identified，which was
named BosiPA1 protein. The full-length DNA of this gene was 3 730 bp，and the ORF（open reading frame）
was 1 092 bp. The gene contained six exons and five introns，encoded 363 amino acids，the amino acids
sequence analysis showed that BosiPA1 contained a typical basic helix-loop-helix（bHLH）domains，which
can recognize and bound the E-box（CANNTG）sequence. There are the E-box sequence in the promoter

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sequences upstream of the ATG of SCR，SRK，Exo70A1. Phylogenetic tree analysis showed that Brassica
oleracea L. BosiPA1 was most close to AtbHLH128，and grouped into one clade with AtHEC1/2/3 and
TgGBOF-1. RT-PCR analysis indicated that BosiPA1 was expressed in petal，sepal，pollen，stigma and
leaf，the further real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the relative expression level
of BosiPA1 in the stigma increased continually after 10 min，30 min，1 h self-pollination. All the results
indicated that BosiPA1 may be a transcription factor related with SI and involved in multi-organs
development in Brasscia oleracea L.
Key words：Brassica oleracea；bHLH transcription factor；gene cloning；expression analysis

自交不亲和甘蓝柱头能特异性识别并排斥自花花粉接受异花花粉，是研究植物生殖发育和生殖
细胞间信号传导的理想材料（Chapman & Goring，2010；Ivanov et al.，2010）。SRK 和 MLPK 等自
交不亲和信号元件的表达与柱头发育过程具有协同性，且自交不亲和性的强弱和柱头排斥自花花粉
的反应与自交不亲和信号元件的表达调控密切相关，但信号元件表达调控的分子机制尚不清楚
（Stein et al.，1991；Kakita et al.，2007）。本试验中通过自交不亲和甘蓝‘A1’授粉前后柱头蛋白
质表达谱的对比鉴定出 1 个受自花授粉诱导上调表达的蛋白，获取了 1 个全新的甘蓝 BosiPA1 基因
编码序列，对其编码的氨基酸序列及其表达进行分析，初步探讨 BosiPA1 蛋白的生物学功能。
1 材料与方法
1.1 材料
从甘蓝品种‘上黑’选育的高代自交不亲和系‘A1’由西南大学十字花科蔬菜研究所提供。2012
年 4 月初，选取长势一致的‘A1’花蕾，开花当天人工去雄，用成熟的‘A1’花粉进行自花授粉，
取未授粉、自花授粉 10 min、30 min、1 h 的柱头，用洁净的毛笔去除柱头上黏附的花粉，置液氮中
速冻保存。同时取开花前 1 ~ 2 d 花蕾、花瓣、萼片、花粉、柱头、叶片，花蕾用于克隆基因，其余
5 种组织用于基因表达分析，置液氮速冻后于–80 ℃冰箱保存备用。
植物基因组 DNA 提取试剂盒，植物总 RNA 提取试剂盒均购自天根公司。荧光定量 PCR 染料
EvaGreen购自Bio-Rad 公司。高保真 DNA聚合酶 FastPfu、大肠杆菌感受态T1、克隆载体 pEASY-Blunt
等购自 TransGen 公司。高保真 DNA 聚合酶 PrimeSTAR、Taq DNA 聚合酶、反转录试剂盒 PrimeScript
RT reagent Kit Perfect Real Time 购自 TaKaRa 宝生物工程有限公司（中国大连）。胶回收试剂盒、质
粒提取试剂盒购自 Bio-Flux 公司。引物和测序由华大基因完成。
1.2 双向电泳及凝胶分析
利用三氯乙酸—丙酮法提取柱头总蛋白（甘露 等，2010），将自花授粉 1 h 后柱头作为处理组，
未授粉柱头作为对照，参照 Sarma 等（2008）方法进行双向电泳，重复 3 ~ 6 次，银染后扫描，利
用 PDQuest 8.0 软件（Bio-Rad 公司）进行图像分析和差异点筛选，通过 PDQuest 软件中 Quantity table
report 中的值统计 3 个生物学重复图像的数值，计算蛋白相对变化量，从胶片上切取差异蛋白质点
后委托深圳华大基因公司进行质谱鉴定。
1.3 甘蓝 gDNA 和总 RNA 提取及 cDNA 合成
根据天根植物基因组 DNA 提取试剂盒提取甘蓝叶片 gDNA。根据天根总 RNA 提取试剂盒说明
书提取各种柱头和花组织的总 RNA，通过测 RNA 浓度，使不同组织的 RNA 量恒定，根据反转录
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试剂盒 PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time说明书反转录成 cDNA第一条链，经NanoVue plus
超微量分光光度计（GE，美国）测定后将反转录产物稀释至同一浓度，–20 ℃保存备用。
1.4 BosiPA1 基因的克隆与生物信息学分析
依据拟南芥 bHLH128（Gene 登录号 AEE27896）核苷酸序列在芸薹属数据库（网址 http：//
brassica.nbi.ac.uk/BrassicaDB/blast_form.html）中检索同源序列，运用 Primer primer 6.0 软件设计扩
增基因引物 siPS：5-ATGTACCAATCATCTTCCCCCAC-3，siPAS：5-CTAGTTTGGTCTCTCACTG
CATTC-3。扩增 BosiPA1 基因片段的 PCR 体系为 25 μL，模板分别为叶片 gDNA 和开花前 1 ~ 2 d 花
蕾 cDNA，具体操作按照高保真 DNA 聚合酶 FastPfu 说明书进行。PCR 扩增参数为：95 ℃预变性 1
min；95 ℃ 20 s；57 ℃ 20 s；72 ℃ 延伸 1 min；35 个循环；72 ℃ 延伸 10 min。PCR 扩增产物
经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的条带，连接克隆载体 pEASY-Blunt载体，热激转化Trans1-T1
大肠杆菌感受态，通过蓝白斑筛选挑取白色菌落，经 PCR 验证阳性克隆子后送华大基因公司测序。
利用 Clustal 软件进行 BosiPA1 基因 DNA 和 cDNA 序列比对，用 DNAStar 软件推导基因编码的
氨基酸序列，用 NCBI（http：//ncbi.nlm.ncih.gov/）中 Blast 在线分析 BosiPA1 基因与其他物种中的同
源性，通过 ProtParam（http：//expasy.org/tools/）在线分析氨基酸的理化性质，利用 PROSITE
（http：//www.expasy.org/prosite）和 InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）预测蛋
白结构域和功能位点，利用 WOLF PSORT （ http ： //wolfpsort.org/ ）和 SignalP （ http ：
//www.cds.dtu.dk/services/）预测蛋白的信号肽，通过 MEGA5.1 软件构建 BosiPA1 系统进化树，利用
Vector NTI Advance 11 软件进行 bHLH 同源序列的氨基酸比对。利用 Blast 在芸薹属数据库（网址
http：//brassica.nbi.ac.uk/BrassicaDB/blast_form.html）检索甘蓝自交不亲和信号元件的 ATG 上游核苷
酸序列。
1.5 BosiPA1 基因的表达分析
通过 RT-PCR 技术检测 BosiPA1 基因的组织表达，BosiPA1 的 PCR 扩增参见 1.5，依据 Samuel 等
（2009）和 Chandna 等（2012）对候选内参基因的评价分析结果，以 Actin3 和 UBQ9 作为内参，引
物为：ACTF：5′-GAGTAGAAAATGGCTGATGGTGAAG-3′和 ACTR：5′-TCATCTTCTCACGGTTAGC
CTTTG-3′；UBQF：5′-GGAAGACATGTTTCATTGGCAGG-3′和 UBQR：5′-ATACTTTTGGGTCCA
GGTCCGAG-3′，具体操作按照高保真 DNA 聚合酶 PrimeSTAR 说明书进行。PCR 扩增参数为：98 ℃
预变性 1 min；98 ℃ 20 s；56 ℃ 15 s；72 ℃ 延伸 1 min；30 个循环；72 ℃ 延伸 10 min。PCR
扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察 BosiPA1 基因在开花前 1 ~ 2 d 花瓣、萼片、花粉、柱头、
叶片 5 种组织中表达情况。
根据获得的 BosiPA1 基因序列设计荧光定量 PCR 特异性引物 DsiPS：5′-GATCGCTTCTGAACT
CTATGGTGG-3′，DsiPAS：5′-TTATTGTTGCTGCTGCCAAGATG-3′；参照 Samuel 等（2009）和 Chandna
等（2012）分析结果以 Actin3 以及 UBQ9 作为内参基因，设计内参引物：Dactin3S：5′-ATGGAAAC
ATCGTCCTCAGTGGTG-3′，Dactin3AS：5′-AGTGCTGAGGGATGCCAAGATG-3′，DUBQ9S：5′-CGG
AAGACATGTTTCATTGGCAGG-3′，DUBQ9AS：5′-AACACCTTCGTCCTAAAAGCCACC-3′。模板
为自花授粉 10 min、30 min、1 h 柱头 cDNA 和未授粉柱头 cDNA。反应在 BIO-RAD C1000/CFX 96
荧光定量 PCR 仪上进行，反应体系为 10 μL，方法参照 BIO-RAD 公司 SsoFast EvaGreen Supermix
试剂盒说明书。反应参数：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s；58.3 ℃ 10 s；72 ℃10 s；40 个循环，每个循
环结束时采集荧光信号。40 个循环后 PCR 扩增产物进行溶解曲线分析。利用 BIO-RAD CFX Manager
软件分析实时定量 PCR 数据。
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2 结果与分析
2.1 BosiPA1 蛋白的分离与质谱鉴定
前期采用非线性 IPG 固相胶条(17 cm，pH 3 ~ 10)对甘蓝‘A1’未授粉和自花授粉 1 h 后柱头总
蛋白进行双向电泳，每组选取了 3 张重复性和分离度好的清晰图片载入 PDQuest 软件分析，对差异
表达蛋白进行质谱鉴定，其中蛋白点 9006 肽指纹图谱与拟南芥 bHLH128 匹配性最高，匹配的肽段
序列为 SDSTTCGVNNSSDGQKQLGNNNNNNSNKDIFLDRSYGGFNEISQQHK、GLQHQLQNLKK、
MYQSSSSTSSSSQR、NNFSLNQPTSDYSPQGGSNGGR 和 HSRLKSQLSFTNHDSLAR，占 bHLH128
全部氨基酸的 30.11%，将该蛋白命名为 BosiPA1。双向电泳结果显示 BosiPA1 蛋白的相对分子质量约
40 kD，pI 约为 7.5。在前期完成的甘蓝‘A4’亲和授粉早期差异蛋白质分析中 BosiPA1 蛋白在未授
粉柱头内和亲和授粉 1 h 后柱头内表达量几乎没有变化（陈松 等，2013）。而本试验中自花授粉 1 h
（图 1，b）与未授粉（图 1，a）对比 BosiPA1 蛋白表达量明显上调。依据 PDQuest 软件统计的蛋白
质 Quantity Report，其数字的大小表示蛋白表达量的高低，甘蓝 BosiPA1 蛋白在未授粉时 3 个生物学
重复的平均值为 231.9，在自花授粉 1 h 时为 1 148.2，授粉 1 h 后其表达量上调约 4.95 倍。

图 1 自花授粉诱导甘蓝柱头 BosiPA1 蛋白差异表达
a：未授粉；b：自花授粉后 1 h；箭头所指为 BosiPA1 蛋白所在位置。
Fig. 1 Differential expression of protein BosiPA1 in Brassica oleracea stigma before and after self-pollination
a：Without pollination；b：1 h after being self-pollinated；The arrows indicated the location of protein BosiPA1.
2.2 甘蓝 BosiPA1 基因 gDNA 和 cDNA 序列的克隆
以甘蓝叶片 gDNA和开花前 1 ~ 2 d花蕾 cDNA为模板，以 siPS和 siPAS为引物 PCR扩增BosiPA1
基因的 gDNA 和 cDNA 序列，产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳，结果表明 gDNA 序列的 PCR 产物大小
约 3 700 bp（图 2，A），cDNA 序列的 PCR 产物约 1 100 bp（图 2，B）。测序结果表明 PCR 扩增所
获得的 BosiPA1 基因的 gDNA 序列长度为 3 730 bp，cDNA 序列长度为 1 092 bp，包含了 BosiPA1 基
因完整的编码框。

图 2 甘蓝BosiPA1基因gDNA（A）和cDNA（B）PCR产物电泳图
A：条带为甘蓝gDNA中BosiPA1基因；B：条带为甘蓝cDNA中BosiPA1基因。
Fig. 2 The agrose gel electrophoresis of gDNA（A）and cDNA（B）PCR product of Brassica oleracea BosiPA1
A：The band represent gDNA sequence of BosiPA1 in Brassica oleracea；B：The band represent cDNA
sequenceof BosiPA1 in Brassica oleracea.
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2.3 BosiPA1 基因序列的生物信息学分析
通过 Clustal 软件进行 BosiPA1 基因 DNA 和 cDNA 序列比对，结果表明该基因由 6 个外显子
（481 bp、290 bp、129 bp、66 bp、69 bp）、5 个内含子（1 970 bp、239 bp、204 bp、105 bp 和 120 bp）
组成，内含子剪切位点完全遵守经典的 GT-AG 法则（图 3）。BosiPA1 基因全长 ORF 为 1 092 bp，编
码 363 个氨基酸，分子量为 39 148.72 Da，等电点为 7.42，BosiPA1 分子量和等电点与双向电泳分析
中蛋白点 9006 的值基本一致，BosiPA1 推导的氨基酸序列与肽指纹图谱序列完全匹配，表明扩增的
BosiPA1 基因就是蛋白质点 9006 的编码序列，BosiPA1 的 GenBank 登录号为 KF314579。

图 3 BosiPA1 基因的结构图
单划线部分为 BosiPA1 的外显子，其余序列为内含子。
Fig. 3 The structure of BosiPA1
The single-underlined sequence means extrons of BosiPA1，the remainding sequence are introns.
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通过 WOLF PSORT 在线分析表明 BosiPA1 没有跨膜域，有 1 个双向核定位信号（287 ~ 303 氨
基酸处），利用 Predict protein 分析 BosiPA1 定位于细胞核，可信度达 94%，BosiPA1 蛋白有 4 个 N–
糖基化位点（85 ~ 88、161 ~ 164、205 ~ 208 和 353 ~ 356 氨基酸处），6 个蛋白质激酶 C 磷酸化位点
（12 ~ 14、74 ~ 76、244 ~ 246、307 ~ 309、346 ~ 348 和 359 ~ 341 氨基酸处），7 个酪蛋白激酶Ⅱ磷
酸化位点（40 ~ 44、147 ~ 150、193 ~ 196、208 ~ 211、228 ~ 231、296 ~ 299 和 325 ~ 328 氨基酸处）
以及 9 个 N–豆酰化位点（19 ~ 24、31 ~ 36、47 ~ 52、69 ~ 74、83 ~ 88、94 ~ 99、130 ~ 135、175 ~
180 和 212 ~ 217 氨基酸处）。经 PROSITE 在线分析该蛋白具有的 basic helix-loop-helix（bHLH）功
能域（290 ~ 340 氨基酸处）（图 4）。

图 4 甘蓝 BosiPA1 cDNA 及其推导的氨基酸序列
单线划线序列为引物，双下划线序列为bHLH结构域。
Fig. 4 The cDNA sequence of Brassica oleracea BosiPA1 and its deduced amino acid sequence
The single-underlined sequence means primes，the double-underlined sequence means bHLH domain.

通过 NCBI 网站 Blast 检索表明 BosiPA1 与 AtbHLH128（NP_563749）的核苷酸序列和推导氨基
酸的一致性都是最高，分别为 85%和 82%。说明 BosiPA1 是 1 个新的甘蓝 bHLH 转录因子。在线收
集 bHLH 同源序列，利用 MEGA5.1 软件构建 bHLH 转录因子功能域的分子进化树，图 5 进化树中
来自于拟南芥的 bHLH 分支模式与 Toledo-Ortiz 等（2003）分析的结果一致，说明本文构建的进化
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树是可信的。甘蓝 BosiPA1 与 AtbHLH128 距离最近，与 TgGBOF-1 次之，与 AtHEC1/2/3 一起处在
同一个分支（图 5）。

图 5 甘蓝BosiPA1及其同源氨基酸序列关系分析
Fig. 5 The phylogenetic relationship of amino acid sequences between Brassica oleracea BosiPA1
with its homologous proteins

同源 bHLH 氨基酸序列比对表明（图 6），甘蓝 BosiPA1 具有典型 bHLH 功能域，包含 DNA 结
合域（basic）和负责形成异源或同源二聚体的螺旋–环–螺旋结构域（helix-loop-helix），在甘蓝
BosiPA1 的 DNA 结合域具有保守的 13E-16R 氨基酸位点，说明该转录因子能特异识别结合基因启动


图 6 BosiPA1 及其同源序列 bHLH 结构域比对
箭头表示bHLH结构域保守的氨基酸位点，星号表示参与二聚体形成的位点。
Fig. 6 bHLH domain alignment between BosiPA1 with other homologous proteins
Arrows indicate the conserved amino acids of bHLH domian，star indicates amino acid involved in formation of dimer.
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子区域的 E-box 序列（5′-CANNTG-3′，其中 N 代表任意核苷酸），与仅仅特异性识别 E-box 序列中
最常见 G-box 序列（5′-CACGTG-3′）的 bHLH 中保守 9H-13E-17R 氨基酸位点不同的是，BosiPA1
第 9 位氨基酸为 Arg，同时与其关系较近的 HEC1/2/3 和 AtbHLH128 中分别为 Gln 和 Arg，但甘蓝
BosiPA1 中第 13 位和第 17 位氨基酸与 9H-13E-17R 一致。BosiPA1 螺旋中具有参与同源和异源二聚体
形成的关键氨基酸位点 Leu27 位点（Heim et al.，2003）。
2.4 甘蓝自交不亲和元件中包含 E-box 序列基因的筛选
甘蓝 BosiPA1 功能域分析表明该转录因子能特异性识别 E-box 序列，通过芸薹属数据库检索，
收集已知自交不亲和信号元件上游启动子序列，结果表明 Exo70A1 上游序列在芸薹属数据库中的编
号为 EM：BZ458864，其 ATG 上游 432 bp 处具有的 CAAATG 序列。SRK 上游序列在芸薹属数据库
中的编号为 EM：AB298899，在其 ATG 上游 11 bp 处有 CAGATG 序列。SCR 上游序列在芸薹属数
据库中的编号为 EM：AB070623，在其 ATG 上游 113 bp 处有 CAGTTG 序列，上述 3 个序列均符合
E-box 序列 5′-CANNTG-3′（其中 N 代表任意的核苷酸）特征。
2.5 甘蓝 BosiPA1 基因的表达分析
以开花前 1 ~ 2 d 甘蓝 A1 的花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片的 cDNA 为模板，Actin3 和 UBQ9
为内参基因进行 RT-PCR 检测 BosiPA1 基因的表达，图 7 显示 5 种 cDNA 中均能扩增得到约 1 083 bp
左右的条带。说明 BosiPA1 基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中都有表达。
利用实时荧光定量 PCR 技术，以甘蓝 Actin3 和 UBQ9 为内参基因，检测 BosiPA1 基因在甘蓝
A1 自花授粉后柱头内的表达情况。从图 8 可以看出，自花授粉后 BosiPA1 表达量逐渐升高，自花授
粉 1 h 后 BosiPA1 基因的表达量是未受粉时的 5 倍。这与双向电泳检测的 BosiPA1 蛋白表达量上升的
变化趋势一致。

图 7 BosiPA1 基因在不同组织中的表达检测 图 8 柱头内 BosiPA1 响应自花授粉后表达模式
Fig. 7 Expression analysis of BosiPA1 in different organs Fig. 8 Expression pattern of BosiPA1 in stigma in response to
self-pollination
3 讨论
自交不亲和性在显花植物中广泛存在，是植物防止自交衰退、保持物种多样性的重要机制
（Chapman & Goring，2010；Ivanov et al.，2010）。利用自交不亲和系杂交制种是芸薹属作物重要的
育种方式。bHLH 是植物体内仅次于 MYB 家族的一大类转录因子（Carretero-Paulet et al.，2010）。
典型的 bHLH 功能域由两个部分组成，其 N 端约 15 个氨基酸组成的 DNA 结合区能特异性结合不同
形式的 E-box（CANNTG）核心序列（Massari & Murre，2000）；其 C 端由螺旋–环–螺旋组成的结
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构域负责 bHLH 同源或异源二聚体的形成（Atchley et al.，1999）。研究表明转录因子在植物的生殖
器官的形成和发育过程中发挥了重要的功能（Feller et al.，2011；Sánchez-León et al.，2012），本文
从高度自交不亲和甘蓝‘A1’中获取了 BosiPA1 基因的编码序列，通过其氨基酸功能域的分析表明
其编码的蛋白具有典型的 bHLH 功能域，属于转录因子 bHLH 家族。经蛋白质和基因表达两种水平
检测结果均表明 BosiPA1 在自交不亲和甘蓝‘A1’柱头内受自花授粉诱导上调表达。
拟南芥花柱内形成的从基部到顶部由低到高的生长素梯度在调控雌蕊发育和增强自交不亲和
性方面都发挥了重要的作用（Nemhauser et al.，2000；Tantikanjana & Nasrallah，2012）。bHLH 转录
因子 SPT 正向调控拟南芥子房内隔膜的形成、心皮发育、花柱内花粉粒导管和柱头组织正常发育等
过程（Heisler et al.，2001）。
HEC1/2/3 具有与 SPT 类似的功能，且可以调控花粉管在柱头内的延伸。SPT 和 HEC1/2/3 的表
达都受生长素的调控（Gremski et al.，2007）。最新的研究表明生长素反应因子 3（Auxin response factor
3，ARF3）既是雌蕊发育的正向调控元件，也能增强材料的自交不亲和性，推测其可能是直接或者
间接调控相关基因的表达来增强材料的自交不亲和性（Tantikanjana & Nasrallah，2012）。
SRK 和 MLPK 等自交不亲和信号元件表达量的变化与柱头发育过程具有协同性，随着柱头的
发育信号元件编码基因表达量逐渐升高，到开花当天表达量达到最大值（Stein et al.，1991；Kakita et
al.，2007）。甘蓝自交不亲和性的强弱及其排斥自花花粉的反应都与信号元件编码基因的表达调控密
切相关，通过反义抑制 ARC1 基因的表达或增强 Exo70A1 基因的表达都能降低材料的自交不亲和性
（Samuel et al.，2009；Indriolo et al.，2012）。甘蓝排斥自花花粉的过程中伴随着柱头内 SRK 的消
耗，SRK 基因不断转录翻译，使 SRK 蛋白始终稳定在一定的生理水平，自花授粉后柱头内 ARC1
蛋白水平急剧上升（Stone et al.，2003；Ivanov & Gaude，2009），但是目前对自交不亲和信号传导
元件编码基因表达调控的分子机制尚不清楚。
Gremski 等（2007）针对与本试验得到的 BosiPA1 亲缘关系较近且处在同一个分支 bHLH 转录因
子 HEC1/2/3 的功能研究表明，HEC1/2/3 表达受生长素调控，除了具有与 SPT 类似的功能外还能调
控花粉管在花柱内的延伸。HEC1/2/3 调控花粉管延伸的表型与甘蓝排斥自花花粉过程中花粉管在柱
头内的伸长生长受到抑制的表型相似（Stead et al.，1979）。
此外甘蓝‘A1’自花授粉后柱头内 BosiPA1 的蛋白质和基因表达水平都呈上升趋势。甘蓝 BosiPA1
功能域具有完全保守的 13E-16R 氨基酸位点，特异性识别并结合基因启动子区域的 E-box 序列，进
而在转录水平上对基因的表达进行调控。本试验中通过数据库检索，在自交不亲和信号元件 SCR、
SRK 和 Exo70A1 的 ATG 上游序列中都找到了 BosiPA1 能够识别的 E-box 序列，且已有的结果表明
柱头排斥自花花粉的过程涉及了 SRK 和 Exo70A1 表达量的变化（Stone et al.，2003；Ivanov & Gaude，
2009）。因此，上述内容表明 BosiPA1 可能通过调控自交不亲和信号元件的表达来参与甘蓝柱头排斥
自花花粉的反应。这为进一步通过试验的手段鉴定 BosiPA1 在甘蓝柱头生殖发育和排斥自花花粉中
的功能提供了依据。

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