全 文 :园 艺 学 报 2012,39(3):509–515 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期:2011–09–19;修回日期:2011–11–24
基金项目:国家农业行业专项计划项目(nyhyzx200903017-08)
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:whni@mail.hzau.edu.cn;Tel:027-87283278)
芋花叶病毒的 RT-PCR 检测及外壳蛋白基因序
列分析
施世明 1,王国平 1,2,徐文兴 1,王利平 1,洪 霓 1,2,*
(1 华中农业大学植物科技学院,湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室,武汉 430070;2华中农业大学,农业
微生物学国家重点实验室,武汉 430070)
摘 要:采用 RT-PCR 技术对采自中国湖北、浙江和山东的 91 份芋[Colocasia esculenta(L.)Schott]
样品的芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)进行了检测,检出率为 26.4%。对其中 14 个 DsMV
分离物的 317 bp 扩增产物(为外壳蛋白基因的一部分)序列分析的结果显示,各分离物内的核苷酸变异
相对较低,而分离物间存在较大的分子变异,相似性为 68.3% ~ 97.8%。对来自湖北和浙江的 2 个 DsMV
分离物 DsMV-SCS 和 DsMV-JH 的外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)进行了测序,全长分别为 951 bp
和 987 bp,二者 cp 核苷酸和氨基酸序列相似性分别为 79.0%和 82.3%,与已报道 DsMV 的 cp 核苷酸和氨
基酸序列相似性分别为 73.0% ~ 92.1%和 74.8% ~ 98.2%,在构建的系统发育树上聚在两个不同的簇,各
DsMV 分离物的系统进化关系与其寄主和地理来源无显著相关性。
关键词:芋;芋花叶病毒;RT-PCR;外壳蛋白基因;序列分析
中图分类号:S 632.3 文献标识码:A 文章编号:0513-353X(2012)03-0509-07
The Detection of Dasheen mosaic virus by RT-PCR and Sequence Analysis
of Its Coat Protein Gene
SHI Shi-ming1,WANG Guo-ping1,2,XU Wen-xing1,WANG Li-ping1,and HONG Ni1,2,*
(1College of Plant Science and Technology,Key Lab of Crop Disease Monitoring and Safety Control in Hubei,Huazhong
Agricultural University,Wuhan 430070,China;2National Key Lab of Agromicrobiology,Huazhong Agricultural University,
Wuhan 430070,China)
Abstract:Reverse transcription PCR(RT-PCR)was used for the detection of Dasheen mosaic virus
(DsMV)in taro[Colocasia esculenta(L.)Schott] from Hubei,Zhejiang and Shandong Provinces. Results
revealed that the average viral infection frequency in 91 collected taro samples was 26.4%. RT-PCR
products of 317 bp(covering partial coat protein gene)from 14 isolates were sequenced. Results showed
that the obtained sequences had high intra-isolate nucleotide similarities,but inter-isolate nucleotide
similarities were varied from 68.3% to 97.8%. The cp genes of two DsMV isolates named DsMV-SCS and
DsMV-JH were sequenced,and their sizes were 951 bp and 987 bp,respectively. Their cp genes shared
similarities of 79.0% at nucleotide(nt)level and 82.3% at amino acid(aa)level to each other and
similarities of 73.0%–92.1% at nt level and 74.8%–98.2% at aa level to reported cp sequences of
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DsMV,respectively. The phylogenetic trees constructed based on nucleotide and deduced amino acid
sequences of the cp of DsMV showed that isolates DsMV-SCS and DsMV-JH clustered into two different
groups. There was no obvious correlation between phylogenetic positions and host or geographical origins
of different DsMV isolates.
Key words:taro;Dasheen mosaic virus;RT-PCR;coat protein gene;sequence analysis
目前世界各国报道的芋病毒主要有 8 种,其中芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)是
发生最普遍的病毒之一(Zettler,1987;杜红梅 等,2006)。DsMV 最早由 Zettler 等(1970)在美
国发现,随后其它国家相继报道有该病毒发生(Zettler,1987;Ram et al.,2003;Revill et al.,2005;
Farreyrol et al.,2006;Ha et al.,2008)。该病毒主要危害天南星科植物(陈集双和李德葆,1996),
感染 DsMV 的芋植株通常表现为叶片产生羽状褪绿,花叶,皱缩,叶脉和茎坏死等症状(李永伟,
2002)。在自然条件下,该病毒主要通过无性繁殖材料及多种蚜虫传播,也可经人工汁液摩擦接种
传播(Abo et al.,1977)。DsMV 为马铃薯 Y 病毒属(Potyvirus)成员,基因组为约 10 kb 的单链
正义 RNA,编码 1 个长的开放式阅读框(ORF)。已有的研究表明,该病毒的不同分离物存在高
度的变异,且其外壳蛋白基因(cp)的变异相对较大(Chen et al.,2001)。
目前有关中国芋上 DsMV 分子特性的研究较少,仅有该病毒 cp 基因部分序列的报道。本研究
中对中国部分地区芋上的 DsMV 进行了分子检测及部分分子特性的研究,旨在进一步明确 DsMV 在
中国栽培芋上的侵染及危害状况,并为建立有效的病毒检测技术提供重要的分子信息。
1 材料与方法
1.1 材料及其叶片组织总 RNA 的提取
2010 年 3 月—2011 年 7 月分别从湖北、浙江、山东共收集芋[Colocasia esculenta(L.)Schott]
叶片样品 91 份,其中武汉市蔬菜科学研究所的 38 份样品采自国家种质武汉水生蔬菜资源圃,其它
样品来自生产田。多数样品植株的叶片表现羽状花叶或褪绿斑等病毒病症状。用于该病毒检测的引
物 DsMV-L/DsMV-R:5′-GGGCTTGGGTGATGATGGA-3′/5′-GCCTTTCAGTGTTCTCGCTTG-3′参照
陈集双(2006)报道的序列合成,扩增片段为 357 bp,扩增区域为 cp 基因中间部分核心序列;用于扩
增cp序列的引物P2F/P2R:5′-AGGTTGTATTGCAGGCAGATG-3′/5′-GCCAATAACTGTGGCCTGTT-3′
根据 Guillermo 等(2009)报道的序列合成,扩增片段约 1 kb,扩增区域为部分复制酶基因
(polymerase NIb)、整个 cp 基因和部分 3′不翻译区(3′-UTR)。所用引物由上海生工生物技术有
限公司合成。
取嫩叶 0.1 g,加液氮磨碎,快速转入 1.5 mL 离心管中,加入 1 mL RNA 提取缓冲液(含 50%
异硫氰酸胍,5 mol · L-1 苯酚等)充分混匀,室温静置 5 min 后离心,上清液经氯仿抽提两次后加入
2/3 体积的异丙醇沉淀核酸,沉淀物经 75%乙醇洗涤 2 次,风干后溶于 30 μL DEPC 处理水,–20 ℃
保存。
1.2 RT-PCR
以提取的总 RNA 为模板,合成 cDNA 第一链。
反应体系为 20 μL,含 5 × 反转录缓冲液 4 μL、dNTPs(5 μmol · μL-1)1 μL、RNA 酶抑制剂
(RNasin,40 U · μL-1)0.5 μL、M-MLV(200 U · μL-1)0.5 μL、随机引物(100 pmol · μL-1)1 μL、
3 期 施世明等:芋花叶病毒的 RT-PCR 检测及外壳蛋白基因序列分析 511
RNA 模板 3 μL 和 DEPC 处理水 10 μL。
PCR 反应总体系为 25 μL,含 10 × PCR 缓冲液 2.5 μL、dNTPs(5 μmol · μL-1)0.5 μL、Taq DNA
聚合酶(5 U · μL-1) 0.2 μL、正反向引物各 0.5 μL(10 μmol · μL-1)、cDNA 2 μL 和灭菌去离子水 18.8
μL。
采用引物 DsMV-L/DsMV-R 的扩增条件为:94 ℃变性 3 min;94 30 s℃ ,56 30 s℃ ,72 30 s℃ ,
35 个循环;72 10 min℃ 。采用引物 P2F/ P2R 的扩增条件为:94 ℃变性 3 min;94 30 s℃ ,50 45 s℃ ,
72 90℃ s,35 个循环;72 10 min℃ 。
1.3 扩增产物克隆及测序
RT-PCR 扩增产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯下切取含目标产物的凝胶,按琼脂糖凝
胶 DNA 纯化回收试剂盒 V3.0(北京道普生物科技有限公司)方法说明回收目标 DNA,与载体
pMD18-T 连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α 菌株感受态细胞,涂布在含 50 mg · L-1 氨苄
青霉素(Ampicillin,Amp)的 LB 固体培养基上,于 37 ℃培养过夜。
待菌落长出后随机挑取一定数量的白色单菌落,在含 50 mg · L-1 Amp 的 LB 液体培养基中震荡
培养,PCR 鉴定为阳性克隆后,将菌液送由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。DsMV 的序列
比对及 cp 推导编码氨基酸序列采用生物学软件 Clustalx(1.81)和 DNAMAN(5.2.2)完成,系统
发育树构建采用 MEGA4.1 软件中的邻接法(neighbor-joining)进行。采用的已报道的 DsMV cp 参
照序列见表 1。
表 1 用于序列比对和系统进化分析的 DsMV 分离物来源及其 cp 序列 GenBank 登录号
Table 1 Origin and GenBank accession numbers of the cp of DsMV isolates used for sequence
alignments and phylogenetic analyses
寄主
Host
分离物
Isolate
来源
Source
登录号
Accession No.
参考文献
Reference
DsMV-1 新西兰 New Zealand AY994104 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/
DsMV-2 新西兰 New Zealand AY994105 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/
DsMV-U1 美国 America U00122 Pappu et al.,1994
DsMV-U2 美国 America U08124 Pappu et al.,1994
芋 Colocasia esculenta
DsMV-VNCe1 越南 Vietnam DQ925464 Ha et al.,2008
DsMV-M13 中国浙江 Zhejiang,China AJ298033 Chen et al.,2001 马蹄莲 Zantedeschia aethiopica
DsMV-S 中国浙江 Zhejiang,China AF511485 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/
魔芋 Amorphophallus rivieri DsMV-YN80 中国云南 Yunnan,China EF199550 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/
疣柄魔芋 Amorphophallus paeoniifolius DsMV-Amp6 印度 India HQ207533 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/
贝母 Caladium hortulanum DsMV-Ch 美国 America AF048981 Li et al.,1994
香草 Vanilla planifolia DsMV-CI-AT 库克群岛 Cook Islands AJ616720 Farreyrol et al.,2006
天南星科植物 Araceae family plants DsMV-TW 中国台湾 Taiwan,China AF169832 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/
2 结果与分析
2.1 不同来源芋中 DsMV 的 RT-PCR 检测及序列相似性分析
采用引物 DsMV-L/DsMV-R 对 DsMV 进行 RT-PCR 检测的结果(表 2)显示,91 份芋样品中有
24 份的 DsMV 检查结果为阳性,检出率为 26.4%,其中来自湖北不同田间的 78 份样品的 DsMV 检
出率为 21.1% ~ 42.9%;来自浙江金华的 10 份样品的 DsMV 检出率为 40.0%;来自山东的 3 份随机
收集样品中未检测到该病毒。
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表 3 DsMV 分离物内 cp 部分核苷酸序列相似性
Table 3 Percent nucleotide identities intra-isolate
based on partial cp sequences
分离物
Isolates
克隆数
Clone number
分离物内相似性/%
Intra-isolate similarities
MJD-1 4 99.7 ~ 100.0
MJD-9 2 98.1
JH-2 3 94.1 ~ 95.9
JH-4 3 70.5 ~ 96.8
JH-5 3 99.7 ~ 100.0
JH-7 3 91.8 ~ 96.5
SCS-1 3 89.9 ~ 100.0
SCS-2 3 93.4 ~ 100.0
SCS-3 1 –
SH-3 1 –
XT-2 1 –
HN-3 1 –
HN-5 1 –
HN-6 1 –
表 2 不同来源芋的 DsMV RT-PCR 检测结果
Table 2 RT-PCR detection of DsMV in Colocasia esculenta plants from different fields
样品来源
Sample source
样品代号
Sample ID
样品数 Number
of detected samples
阳性样品数 Number of
positive samples
发生频率/%
Frequency
蔡甸索河 Caidian Suohe SH 7 3 42.9
蔡甸马家渡 Caidian Majiadu MJD 10 3 30.0
仙桃 Xiantao XT 4 1 25.0
武汉蔬菜所 Wuhan Vegetable
Research Institute
SCS 38 9 23.7
湖北 Hubei Province
华中农业大学 Huazhong
Agricultural University
HN 19 4 21.1
浙江 Zhejiang Province 金华 Jinhua JH 10 4 40.0
山东 Shandong Province 临沂 Linyi LY 3 0 0
总计 Total 91 24 26.4
对其中 14 个 DsMV 阳性样品的 RT-PCR
产物进行克隆,每份产物随机选取 1 ~ 4 个克
隆进行测序,共得到 30 个克隆的序列,除来自
样品 JH-4 的 1 个克隆为 316 bp 外,各克隆产
物全长均为 317 bp(不含引物序列)。
序列比对的结果显示,各分离物内的分子
变异相对较低,除 JH-4 的 1 个分子变种与其它
2 个分子变种的核苷酸相似性仅 70.5%外,其
它各分离物内的克隆间核苷酸相似性均达
89.9% ~ 100%(表 3)。
分离物间存在较大的分子变异,除分离
物HN-5与HN-6的核苷酸相似性达 97.8%外,
其它各分离物间相似性为 68.3% ~ 95.6%(表
4)。
表 4 DsMV 分离物间 cp 部分核苷酸序列相似性
Table 4 Percent nucleotide identities inter-isolate based on partial cp sequences
分离物间相似性/% Intra-isolate similarities 分离物
Isolates
克隆数
Clone
number MJD-1 MJD-9 JH-2 JH-4 JH-5 JH-7 SCS-1 SCS-2 SCS-3 SH-3 XT-2 HN-3 HN-5
MJD-1 4
MJD-9 2 84.2 ~ 85.2
JH-2 3 91.5 ~ 93.7 85.8 ~ 88.0
JH-4 3 75.6 ~ 85.2 72.1 ~ 89.0 73.0 ~ 86.8
JH-5 3 94.3 ~ 95.0 84.9 ~ 85.2 92.4 ~ 95.0 75.6 ~ 84.9
JH-7 3 90.2 ~ 92.7 83.3 ~ 85.8 89.6 ~ 93.7 75.6 ~ 84.9 90.9 ~ 92.7
SCS-1 3 90.2 ~ 93.4 84.9 ~ 87.1 90.5 ~ 94.0 75.9 ~ 85.5 90.9 ~ 93.7 89.3 ~ 92.7
SCS-2 3 83.3 ~ 83.9 87.7 ~ 89.6 83.0 ~ 87.7 68.3 ~ 94.0 82.6 ~ 83.5 80.4 ~ 84.2 81.4 ~ 85.4
SCS-3 1 83.6 ~ 83.9 88.0 ~ 88.3 84.9 ~ 86.8 70.5 ~ 92.7 83.0 ~ 83.3 82.3 ~ 84.2 83.0 ~ 84.5 92.1 ~ 97.2
SH-3 1 91.8 ~ 92.1 82.3 89.0 ~ 91.8 74.9 ~ 81.4 92.4 ~ 92.7 90.5 ~ 92.4 89.6 ~ 90.9 79.8 ~ 80.1 80.4
XT-2 1 84.5 ~ 84.9 95.3 ~ 95.9 85.8 ~ 87.4 72.4 ~ 88.6 84.5 ~ 84.9 83.6 ~ 85.2 85.8 87.1 ~ 88.9 88.6 81.7
HN-3 1 94.3 ~ 94.6 83.9 91.8 ~ 93.7 76.2 ~ 83.0 94.3 ~ 94.6 91.8 ~ 93.4 91.8 ~ 93.4 81.7 ~ 82.6 82.6 93.7 83.9
HN-5 1 93.4 ~ 93.7 84.2 ~ 84.9 92.4 ~ 94.3 75.6 ~ 83.6 94.3 ~ 94.6 92.1 ~ 93.1 93.1 ~ 93.4 82.6 ~ 83.5 83.6 91.8 84.2 95.6
HN-6 1 92.4 ~ 92.7 85.8 ~ 86.4 91.8 ~ 95.3 76.2 ~ 85.5 93.4 ~ 93.7 90.9 ~ 93.4 91.8 ~ 95.3 84.2 ~ 85.1 84.9 91.5 85.8 93.4 97.8
3 期 施世明等:芋花叶病毒的 RT-PCR 检测及外壳蛋白基因序列分析 513
2.2 DsMV cp 序列分析
采用引物 P2F/P2R 分别从采自武汉市蔬菜所的样品 SCS-3 和浙江金华的样品 JH-5 中扩增获得
预期大小的产物,对扩增产物进行了克隆和测序。
序列分析结果显示,SCS-3 的 4 个克隆产物的全长为 998 bp,而 JH-5 的 3 个克隆产物全长为 1
034 bp,均包含 DsMV 的部分 NIb(14 bp)和部分 3′-UTR(33 bp)及完整的 cp。两个分离物内的
各克隆间核苷酸序列相似性均为 99%以上,而分离物 SCS-3 和 JH-5 扩增片段的核苷酸序列相似性
仅为 81.6% ~ 82.0%(详细数据未列出),且二者的 cp 大小存在差异,分离物 SCS-3 的 cp 为 951 bp,
分离物 JH-5 的 cp 为 987 bp。
从这两个 DsMV 分离物中各选取一个代表性克隆的 cp 序列(分别命名为 DsMV-SCS 和
DsMV-JH),与 GenBank 登录的该病毒 cp 序列(表 1)进行多重比对,结果显示不同来源 DsMV
分离物的 cp 存在高度变异,核苷酸序列相似性为 68.6% ~ 92.6%,氨基酸序列相似性为 72.2% ~
98.2%。本研究中获得的分离物 DsMV-SCS 和 DsMV-JH 与已报道的 DsMV 的 cp 的核苷酸相似
性分别为 73.0% ~ 78.9%和 74.3% ~ 92.1%,氨基酸相似性分别为 77.0% ~ 86.5%和 74.8% ~ 98.2%
(表 5)。
表 5 DsMV 不同分离物 cp 核苷酸(左下)和氨基酸(右上)序列相似性比较
Table 5 Percent nucleotide identities(below diagonal)and amino acid identities(above diagonal)between
DsMV isolates based on cp sequences /%
分离物 Isolates M13 S U2 CH TW U1 YN80 JH VNCe1 CI-AT 1 2 Amp6 SCS
M13 – 95.9 95.2 93.6 92.4 89.2 86.6 87.6 83.4 80.9 82.8 82.5 76.5 86.5
S 91.7 – 95.2 92.0 93.0 88.6 86.0 86.7 83.4 80.6 81.9 81.6 77.1 85.8
U2 89.4 90.4 – 93.0 94.9 91.4 89.2 89.5 83.1 80.6 82.8 82.8 75.8 84.8
CH 88.4 87.6 88.0 – 91.1 89.1 87.2 87.9 84.3 79.2 82.1 82.1 75.7 83.8
TW 87.6 87.9 88.1 86.3 – 87.2 85.4 85.7 80.5 77.5 81.8 81.8 76.7 83.9
U1 86.3 85.9 86.1 84.8 83.4 – 97.0 96.7 79.9 76.9 80.2 79.9 75.4 83.2
YN80 84.4 83.9 85.1 82.7 82.3 92.6 – 98.2 79.9 76.6 80.5 80.5 75.1 82.3
JH 84.1 84.8 85.7 83.4 82.6 89.7 92.1 – 80.5 76.3 80.5 79.6 74.8 82.3
VNCe1 83.8 83.7 83.4 84.6 81.9 79.6 80.9 81.6 – 74.0 85.8 84.3 73.4 78.8
CI-AT 78.2 77.4 76.6 75.7 75.4 74.4 75.4 75.3 72.1 – 77.6 77.9 72.2 76.3
1 78.1 78.2 78.6 78.1 77.1 77.5 78.2 77.7 77.0 78.1 – 93.1 72.5 81.3
2 78.6 78.6 79.7 78.3 78.3 79.4 78.7 78.8 76.4 78.4 87.2 – 72.2 80.7
Amp6 74.3 74.1 73.9 75.2 73.9 74.7 73.8 74.3 73.1 68.6 70.3 71.1 – 77.0
SCS 78.7 78.9 78.1 77.5 77.3 77.9 77.9 79.0 76.4 73.0 74.4 75.4 78.9 –
根据 DsMV cp 基因核苷酸序列及推导编码氨基酸序列建立系统进化树的结果表明,所有报道的
DsMV 分离物可分为两大簇。
本研究中所获分离物 DsMV-SCS 和印度疣柄魔芋的分离物 DsMV-Amp6 聚为一簇(Ⅱ);
DsMV-JH 则与来自中国云南的魔芋分离物 DsMV-YN80 亲缘关系最近,与其它分离物聚为较大的一
簇(Ⅰ),在该簇中存在两个明显的亚分支(Ⅰa 和Ⅰb)。
各分离物的 cp 基因系统进化关系与其寄主及地理来源无明显的相关性,已报道的来源于芋的
DsMV 分离物 cp 基因序列有 7 条,其中 5 条来自中国大陆(即 DsMV-M13、DsMV-S、DsMV-YN80
和本研究中测定的 DsMV-SCS 和 DsMV-JH),这些分离物与其它寄主或地理来源的分离物分别聚在
不同的分支或亚分支中(图 1,A、B)。
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图 1 芋花叶病毒 cp 核苷酸序列(A)和推导编码氨基酸序列(B)的系统进化分析
▲ 本研究中鉴定的分离物。
Fig. 1 Phylogenetic analysis of Dasheen mosaic virus(DsMV)based on nucleotide(A)and
deduced amino acid(B)sequences of its cp
▲ The isolates sequenced in this study.
3 讨论
本研究结果显示,DsMV 侵染在中国保存和栽培芋上均有发生,但不同地区及田块的芋受侵染
状况存在一定的差异。分析的 91 份样品中大部分样品在田间表现明显的病毒病及类似病害症状,而
采用 RT-PCR 检测 DsMV 的阳性率仅为 26.4%,分析其原因之一是,DsMV 虽可引起典型的花叶症
状,但由于侵染芋的病毒有多种可引起不同程度的叶片花叶症状,且不同病毒的混合侵染对植物病
害症状表现也会产生影响(Revill et al.,2005),这些样品中是否存在其它病毒还有待进一步明确,
因此尚不能根据症状表现确定病毒种类。DsMV 具有高度的分子变异,已报道的不同来源 DsMV 分
离物的 cp 大小为 936 ~ 1 008 bp,推导编码的外壳蛋白为 312 ~ 336 个氨基酸,该基因 5′端及编码蛋
白的 N 端多个位点存在连续的核苷酸及氨基酸缺失或插入(数据未列出)。
3 期 施世明等:芋花叶病毒的 RT-PCR 检测及外壳蛋白基因序列分析 515
本试验中采用的引物虽是根据 cp 相对保守区域设计的,但该基因的高度变异特点有可能影响
RT-PCR 检测灵敏度,各分离物的 CP 氨基酸序列差异也会直接影响常规血清学检测的效果。因此,
随着对该病毒基因组分子组成研究的深入,有必要开发具有更高通量的分子检测技术。蚜虫对该病
毒的传播起着重要的作用(Abo et al.,1977),但来源于同一地区栽培芋及同一保存圃不同品种芋上
的 DsMV 分离物也存在较高的分子变异,推测这种变异可能与其最初来源有更密切的关系。目前仅
报道有 1 个来自马蹄莲的 DsMV 分离物(DsMV-M13)全长基因组序列(Chen et al.,2001),不同
DsMV 分离物在基因组结构上是否存在差异,及其 cp 高度分子变异特点是否与该病毒株系及致病性
分化有关,还有待进一步研究。
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