全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(5): 773−779 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08002-001, 2009ZX08002-006B)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 张增艳, E-mail: zhangzy@mail.caas.net.cn
Received(收稿日期): 2011-11-08; Accepted(接受日期): 2012-01-19; Published online(网络出版日期): 2012-03-05.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120305.1040.015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00773
抗纹枯病、根腐病的转 SN1基因小麦的获得与鉴定
王金凤 1,2 杜丽璞 1 李 钊 1 黄素萍 1,2 叶兴国 1 冯 斗 2 张增艳 1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物遗传育种重点实验室, 北京
100081; 2 广西大学农学院, 广西南宁 530004
摘 要: SN1 是源于马铃薯的一种抗菌肽, 可以抑制多种植物病原菌的生长。小麦纹枯病(主要病原菌为禾谷丝核菌
Rhizoctonia cerealis)和根腐病(主要病原菌为平脐蠕孢菌 Bipolaris sorokiniana)是小麦的主要土传真菌病害。本研究利
用基因工程技术构建了 SN1基因的单子叶植物表达载体 pA25-SN1, 它受玉米泛素(ubiquitin)启动子的控制;采用基因
枪法将 pA25-SN1转化小麦推广品种扬麦 18幼胚愈伤组织 4 000块, 获得 203株再生植株, 通过 PCR检测出阳性植
株 55株, 转化率为 1.38%。对外源 SN1转基因小麦 T0~T2代植株, 进行目标基因的 PCR、Southern blot、RT-PCR、
荧光定量 RT-PCR (Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病菌与根腐病菌接种及其抗病性鉴定。结果表明, 转入的 SN1基因已
经整合到转基因小麦的基因组中, 能够在转基因小麦中遗传、转录与表达。SN1 基因的表达提高了转基因植株对小
麦纹枯病和根腐病的抗性, 其抗病性可以遗传。
关键词: SN1基因; 转基因小麦; 小麦纹枯病菌; 小麦根腐病菌; 抗性
Development and Characterization of SN1 Transgenic Wheat Plants with En-
hanced Resistance to Rhizoctonia cerealis and Bipolaris sorokiniana
WANG Jin-Feng1,2, DU Li-Pu1, LI Zhao1, HUANG Su-Ping1,2, YE Xing-Guo1, FENG Dou2, and
ZHANG Zeng-Yan1,*
1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Genetic and Breeding, Ministry of Agriculture /
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 College of Agronomy, Guangxi University, Nanning
530004, China
Abstract: SN1 is an anti-microbial peptide in potato, and can inhibit the growth of important phytopathogens. In this study, the
transformation vector of SN1 gene expressing highly in monocot plants, pA25-SN1, was correctly constructed, in which SN1 gene
was driven by maize ubiquitin promoter. Four thousand embryo calli of Yangmai 18 were bombarded by the particle containing
pA25-SN1. Among the regenerated 203 plants, 55 positive transgenic individuals were identified by PCR assay in the T0 genera-
tion with a transformation frequency of 1.38%. The transgenic wheat plants from T0 to T2 generations were subjected to PCR,
Southern blot, RT-PCR, and Q-RT-PCR assays. The disease responses of these positive transgenic plants were also evaluated by
inoculating with Rhizoctonia cerealis and Bipolaris sorokiniana. The results showed that SN1 gene was integrated into these
transgenic lines, inherited from T0 to T2, and expressed in the wheat background. The transgenic wheat plants expressing SN1
displayed an enhanced resistance to R. cerealis and B. sorokiniana compared with the untransformed Yangmai 18, and the en-
hanced resistance was inheritable.
Keywords: SN1 gene; Transgenic wheat; Rhizoctonia cerealis; Bipolaris sorokiniana; Resistance
近年来, 我国小麦生产区的土传真菌病害呈加
重发生态势。小麦纹枯病(主要病原菌为禾谷丝核菌,
Rhizoctonia cerealis[1]), 已成为我国小麦主产区的主
要病害之一, 主要危害小麦的茎秆基部, 造成植株
倒伏、枯死和白穗, 导致小麦产量严重损失, 一般地
块减产 10%~30%, 严重时超过 50%[2]。由平脐蠕孢
菌 Bipolaris sorokiniana (有性态为禾旋孢腔菌
Cochliobolus sativus)等引起的小麦根腐病, 发生于
774 作 物 学 报 第 38卷

世界各国[3], 在我国以北方麦区尤为严重。小麦根腐
病是全生育期典型的多阶段性病害, 从苗期到抽穗
结实期都能发生, 小麦种子、幼芽、幼苗、成株根
系、叶片、茎和穗都可受害, 最终导致小麦减产和
品质下降, 一般减产 10%~20%, 严重地块减产超过
40%。化学药剂防治上述土传病害的效果较差。因
此, 选育和推广抗病小麦品种是控制上述病害最经
济、有效和安全的措施。目前, 生产上大面积推广
品种、高代品系对纹枯病和根腐病的抗性普遍较差,
且这两种土传病害的常规抗病育种进展缓慢。因此,
发掘、利用有效的抗病相关基因, 开展抗纹枯病、
根腐病的小麦基因工程育种非常重要。
抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)具有抗菌谱
广、分子量小、基因操作容易等特点。这类蛋白主
要通过形成离子通道直接破坏细胞膜以杀灭病原真
菌, 且病原真菌很难对其产生抗性。更为重要的是抗
菌肽仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞[4-6]。
马铃薯抗菌肽 SN1是从马铃薯块茎中分离的一种富
含半胱氨酸的新型抗菌肽。体外抑菌研究证明, SN1
可以显著抑制多种植物重要病原真菌的菌丝生长 ,
如番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis)、立枯镰
刀菌 (Fusarium solani)、玉米小斑病菌 (Bipolaris
maydis)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)、
灰霉病菌(Botrytis cinerea)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia
cerealis)和平脐蠕孢菌 (Bipolaris sorokiniana)[7-8]。
SN1 基因过表达显著增强了转 SN1 基因马铃薯对立
枯丝核菌、软腐菌的抗性[9]。然而, SN1基因在小麦
抗病基因工程应用潜力的研究还未见报道。
本研究利用基因工程技术成功构建了 SN1基因
的单子叶植物表达载体 pA25-SN1, 用基因枪法将
该载体转化小麦推广品种扬麦 18, 对转基因小麦 T0
至 T2代材料进行分子检测和接种、抗病鉴定, 分析
SN1 基因在转基因小麦中的整合、遗传、表达水平
和纹枯病、根腐病抗性, 以期明确转 SN1 基因小麦
的纹枯病与根腐病抗性功能及其应用前景。
1 材料与方法
1.1 植物材料与化学试剂
小麦品种扬麦18的幼胚由中国农科院作物科学研
究所小麦分子育种组提供。限制性内切酶 Sma I、Sac I、
Bgl II、EcoR I和 Taq DNA polymerase, T4 DNA po-
lymerase 购自大连宝生物公司; 大肠杆菌 Top10 菌
株感受态细胞, 琼脂糖凝胶回收试剂盒与质粒小量
提取试剂盒购自北京天根生物技术公司。Ampicillin
(Amp.)购自北京拜尔迪公司。其他生化试剂为国产
和进口分析纯、生化纯。引物由北京奥科生物技术
公司合成。
1.2 SN1基因的植物表达载体的构建
根据 SN1基因的 mRNA序列(GU1373071)设计
引物(SN1-F: 5′-ATGAAGTTATTTCTATTAACTC-3′;
SN1-R: 5′-TCAAGGGCATTTAGACTTGC-3′)。利用
PLANTeasy试剂盒提取马铃薯块茎总 RNA, 采用第
1 链 cDNA 合成试剂盒(Invitrogen)将该 RNA 反转
录、合成 cDNA。以该 cDNA为模板用 plus Taq酶
扩增得到 SN1 基因全长编码序列 , 将其连接到
pMD18-T 载体(TaKaRa)的多克隆位点间, 转化大肠
杆菌 TOP10感受态细胞, 通过菌落 PCR筛选出阳性
克隆, 挑选 3个阳性克隆测序分析[8]。以测序正确的
SN1基因载体质粒DNA为模板, 在 SN1基因的两端分
别添加Sma I和Sac I酶切位点, 利用引物(SN1-SMAF:
5′-ATCCCGGGATGAAGTTATTTCTATTAACTC-3′,
下画线指示 Sma I 酶切位点 , SN1-SACR: 5′-GTG
AGCTCAGGGCATTTAGACTTGCC-3′, 下画线指示
Sac I酶切位点)进行 PCR扩增, 然后用 Sma I、Sac I
双酶切该添加 Sma I、Sac I酶切位点的基因以及表
达载体 pAHC25; 利用 T4连接酶将 Sma I、Sac I双
酶切的 SN1基因片段连接到 Sma I、Sac I酶切处理
的 pAHC25 载体上, 构建成马铃薯抗菌肽 SN1 的植
物表达载体 pA25-SN1 (图 1), 转化到大肠杆菌
TOP10感受态细胞中, 进行菌落 PCR筛选、测序分
析, 以鉴定构建的转基因表达载体 pA25-SN1 的正
确性。该载体中 SN1基因表达受 ubiquitin启动子控
制, 另外还具有一个受 ubiquitin 启动子控制的 Bar
基因表达盒, 可为后续选择利用 Bialaphos筛选转化
再生植株提供抗性。
1.3 基因枪法转化小麦幼胚愈伤组织及植株再生
利用徐惠君等 [10]报道的基因枪轰击法 , 将
pA25-SN1 表达载体和适量的金粉混合, 转化小麦
品种扬麦 18幼胚愈伤组织 4 000块, 通过筛选、分
化、再生、移栽成苗等步骤, 获得转 pA25-SN1基因
小麦扬麦 18的 T0代植株。
1.4 转基因小麦的获得及其验证
采用改良 CTAB 法 [ 1 1 ]提取再生植株基因组
DNA 作为 SN1 基因 PCR 检测的模板。根据转 SN1
基因载体的序列设计引物(SN1-TF2: 5′-TGAGATGT
第 5期 王金凤等: 抗纹枯病、根腐病的转 SN1基因小麦的获得与鉴定 775


TCAAAGGCAGGA-3′; SN1-NR2: 5′-ATTGCGGGA
CTCTAATCATAAA-3′)。预期扩增片段约为 343 bp。
PCR 扩增体系为 20 µL, 扩增程序为 94℃预变性 5
min; 进入 94℃ 40 s, 54℃ 35 s, 72℃ 40 s, 共 5个循
环; 94℃ 40 s, 52℃ 35 s, 72℃ 40 s, 共 30个循环; 最
后 72℃后延伸 5 min。用扬麦 18为阴性对照, 质粒
pA25-SN1 为阳性对照 , 反应结束后 , 扩增产物经
2%琼脂糖+EB凝胶电泳分离、分析。
用限制性内切酶 Bgl II和 EcoR I 分别酶切 20
μg基因组 DNA, 0.7%琼脂糖凝胶电泳后, 将其转移
到尼龙膜上, 用 α-32p-dCTP标记的 SN1基因序列为
探针, 参照 Southern杂交方法[12]。

图 1 SN1基因转化载体 pA25-SN1构建流程
Fig. 1 Construction of pA25-SN1 expression vector

1.5 SN1基因的转录水平
用 TRIZOL 试剂(道普公司)提取叶片总 RNA,
按 RNA kit ver.3.0试剂盒(TaKaRa)说明书合成第 1
链 cDNA, 以第 1链 cDNA为模板, 首先用 Actin基
因特异引物(ACT-A: 5′-CACTGGAATGGTCAAGG
CTG-3′; ACT-B: 5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′)
对各样本 cDNA扩增, 使各样本 cDNA模板量均一
化; 然后用 SN1 基因特异的引物(SN-QF: 5′-ACTC
TGCTTTTGGTCACTCTTG-3′; SN-QR: 5′-TACCAT
AAGTTCCAGAAGGCAC-3′)进行半定量 RT-PCR
表达分析。扩增条件为 94℃预变性 5 min; 94 35 s, ℃
55 30 s, 72 35 s, ℃ ℃ 共 35个循环; 最后 72℃延伸
5 min; 3次独立重复。在 ABI PRISMR7000实时荧
光定量 PCR 仪(美国 ABI 公司)上进行实时荧光定
量 RT-PCR (Q-RT-PCR)分析。反应体系 25 μL, 按
照 SYBR Premix ExTaq (TaKaRa)反应体系进行, 以
Actin 为内参照(引物为 ACT-A 和 ACT-B)。反应条
件为 95℃预变性 5 min; 进入 95℃变性 15 s, 60℃
退火 31 s, 40个循环。每个反应均有 3次独立的重复
验证。
776 作 物 学 报 第 38卷

1.6 抗病性鉴定
1.6.1 纹枯病抗性 参考蔡士宾等 [13]报道的牙
签菌接种法, 略作修改。在小麦分蘖盛期, 用消毒镊
子夹取长满禾谷丝核菌 R0301 菌丝的牙签段, 轻轻
地嵌入麦苗叶鞘内, 每个叶鞘嵌入一个有菌牙签段,
至少保湿 3 d, 于小麦收获期对单株进行抗病调查,
采用蔡士宾等 [13]的 0~5 级分级方法鉴定小麦纹
枯病。
病情指数:
5 5
0 0
( )i i
i i
PI = iX / X
= =
×5×100∑ ∑
式中, i 表示病级, Xi分别表示病级为 i 级的茎
秆数。
1.6.2 根腐病抗性 参考 Dong 等[14]报道的麦粒
菌接种法, 略作修改。在小麦分蘖盛期, 用夹取长满
平脐蠕孢菌菌丝的麦粒, 轻轻嵌入麦苗叶鞘内, 每
个叶鞘嵌入一个有菌麦粒, 至少保湿 3 d。小麦收获
期进行单株调查, 采用 Dong 等[14]的 0~4 级分级方
法, 包括 IT 0 (无病)、IT 1 (叶鞘变褐, 但不侵入茎
秆)、IT 2 (叶鞘变褐, 病斑侵入茎秆, 不超过茎周的
1/2)、IT 3 (侵入茎秆的病斑环茎 1/2~3/4)、IT 4 (侵
入茎秆的病斑 3/4以上或茎秆软腐)。
病情指数:
4 4
0 0
( n n
n n
PI = nX / X
= =
)× 4×100∑ ∑
式中, n为病级数, Xn分别表示病级为 n级的茎
秆数。
2 结果与分析
2.1 SNI 基因转化载体的构建与转基因小麦的
获得
由图 1 和测序结果可知 , SNI 基因转化载体
pA25-SN1, 受玉米泛素(ubiquitin, Ubi)启动子的控
制, 可以在单子叶植物中高效表达, 对于创制转基
因小麦新材料具有一定价值。通过基因枪将 pA25-
SN1轰击小麦推广品种扬麦 18的 4 000个幼胚愈伤
组织中, 经筛选、分化, 获得 203株再生植株, 通过
PCR检测出阳性植株 55株, 转化率为 1.38%。
2.2 转基因小麦的分子检测
提取转 SN1基因小麦 T0至 T2代植株的叶片基因
组 DNA, 作为转基因植株外源目标基因检测的模板,
利用 SNI基因转化载体的序列设计的特异 PCR引物进
行 PCR检测。结果表明, 每代材料均可以检测到转入
的 SN1基因(图 2), 并可在转基因小麦中遗传。

图 2 转 SN1基因小麦 T2代植株的 PCR检测
Fig. 2 PCR analyses on T2 plants of SN1 transgenic wheat
M: 200 bp DNA ladder; P: 转基因载体质粒 pA25-SN1; WT: 未转基因扬麦 18; CK: ddH2O; 1~14: 转基因株系。
M: 200 bp DNA ladder; P: SN1 transformed vector plasmid pA25-SN1; WT: untransformated Yangmai 18; CK: ddH2O;
1–14: transgenic plant lines.

2.3 转 SN1基因小麦的 Southern blot分析
从转 SN1 基因小麦 T2代中, 选择 6 个 PCR 检
测阳性的抗病株系(N1~N6), 提取基因组 DNA, 分
别用限制性内切酶 Bgl II和 EcoR I 消化、转膜, 随
后与标记的转 SN1基因 PCR检测的特异片段探针进
行 Southern杂交。结果显示, SN1基因以双拷贝的形
式整合到 N1、N2、N3、N5和 N6株系的基因组中; 以
四拷贝的形式整合到 N4株系的基因组中。图 3中杂
交带的不同位置说明 N1、N2 与 N3、N4、N5、N6
为不同转化事件的后代。
2.4 转 SN1基因小麦中 SN1的转录水平
半定量 RT-PCR 分析结果表明, 转 SN1 基因 T2
代抗病植株中 SN1基因的转录水平高于未转基因小
麦扬麦 18 (受体)。进一步利用 Q-RT-PCR定量分析
这些抗病植株中 SN1基因的相对表达量。结果表明,
抗病植株N1~N6中 SN1基因的表达水平明显高于未
转基因小麦扬麦 18 (受体), 不同植株中的表达量存
在差异, 表达量越高抗病性越强(图 4和表 1)。
2.5 转 SN1基因小麦的纹枯病与根腐病抗性
转 SN1 基因小麦 T1代 PCR 阳性植株的纹枯病
平均病级为 1.68, 病情指数为 32.88, 未转基因小麦
扬麦 18的纹枯病平均病级为 2.75, 病情指数为 58.46。
转 SN1 基因小麦 T2代 PCR 阳性植株的纹枯病平均
病级为 1.49, 病情指数为 30.26, 其中 N1-N6株系的
第 5期 王金凤等: 抗纹枯病、根腐病的转 SN1基因小麦的获得与鉴定 777


纹枯病抗性提高显著(表 1), 未转基因小麦扬麦 18的
纹枯病平均病级为 2.71, 病情指数为 54.12。由此可
知, SN1 基因的表达提高了转 SN1 基因小麦对纹枯
病的抗性。

图 3 转 SN1基因小麦 T2代植株的 Southern blot分析
Fig. 3 Southern blot assay on SN1 gene in T2 plants
M: λDNA/Hind III marker; N1~N6: 转基因株系; P: pAHC25-SN1质粒; WT: 未转基因扬麦 18。
M: λDNA/Hind III marker; N1–N6: transgenic lines; P: pA25-SN1expression vector; WT: untransformed Yangmai 18.


图 4 转 SN1基因小麦中 SN1表达的 RT-PCR(A)和定量 RT-PCR(B)分析
Fig. 4 PR-PCR(A) and Q-RT-PCR (B) assays on SN1 transcript in transgenic wheat plants
N1~N6: 转基因株系; WT: 未转基因的扬麦 18。
N1–N6: transgenic lines; WT: untransformed Yangmai 18.

转 SN1基因小麦 T2代植株的根腐病平均病级为
1.45, 病情指数为 29.02; 受体扬麦 18根腐病平均病
级为 2.84, 病情指数为 56.8。由此可知, SN1基因的
表达提高了转 SN1基因小麦对根腐病的抗性。
3 讨论
随着寄主-微生物互作研究的深入, 抗病有效基
因的克隆以及基因转化技术的发展 , 植物抗病基
778 作 物 学 报 第 38卷

表 1 转 SN1基因小麦 T2代纹枯病病情指数与抗性
Table 1 Disease index and resistance of SN1 transgenic wheat
T2 plants against Rhizoctonia cerealis
株系
Line
病情指数
Disease index
抗性
Resistance
扬麦 18 Yangmai 18 54.12 MS
扬麦 158 Yangmai 158 58.25 MS
N1 25.67** R
N2 24.15** R
N3 31.02* R
N4 29.85* R
N5 26.14** R
N6 28.71* R
数据为 T2代转基因株系中阳性植株平均值。*和**分别表示
在 P<0.05和 P<0.01水平与对照扬麦 18有显著差异。MS: 中感;
R: 抗病。
Data are means of positive transgenic plants in each line.
* and ** indicate significant differences compared with Yangmai 18
at P < 0.05 and P < 0.01, respectively. MS: medium susceptibility;
R: resistance

因工程育种正在成为植物育种的重要途径之一。近
年来 , 抗菌肽具有抗菌谱广等优点受到广泛关注 ,
关于抗菌肽基因工程提高作物抗病性的报道日益增
多[2,9,15-16]。
针对小麦纹枯病, 根腐病危害日趋严重, 小麦
中缺乏抗病基因资源, 抗纹枯病、根腐病小麦常规
育种进展缓慢等问题, 我们拟利用基因工程方法培
育转 SN1基因抗病小麦。为了明确 SN1基因对小麦
抗纹枯病菌、根腐病菌的作用, 本课题组首先构建
SN1 基因原核表达载体, 使 SN1 在大肠杆菌细胞中
大量表达, 获得有活性的 SN1 蛋白, 然后用有活性
的 SN1蛋白对小麦纹枯病原菌、根腐病菌进行体外
抑菌实验。研究结果显示, SN1蛋白可以通过抑制菌
丝生长和菌核萌发、破坏菌丝形态结构, 阻止该病
菌的侵染和扩展[8]。为明确 SN1 基因在小麦抗病基
因工程应用潜力, 本研究构建了在小麦高效表达的
转基因载体, 利用基因枪将 SN1 基因转入推广小麦
品种中。通过对转 SN1 基因小麦 T0代到 T2代植株
中进行 PCR检测和转录表达分析, 获得表达 SN1转
基因小麦植株; 抗性鉴定结果表明, SN1基因表达的
转基因小麦植株对纹枯病菌、根腐病菌抗性得到提
高, 证明 SN1 基因在基因工程培育抗纹枯病、根腐
病小麦上具有一定潜力。然而, 本研究也发现, 一些
转 SN1基因的小麦植株中虽然可检测到 SN1基因但
不抗病, 可能与这些植株中抗菌肽基因的不表达或
表达量低或与该基因转录后沉默有关。另外, SN1基
因在小麦抗病基因工程应用方面仍存在一些问题 ,
如抗病性水平中等, 需要今后通过与其他抗病有效
基因共同转化、协同作用加以解决。
4 结论
创制出抗纹枯病、根腐病的转 SN1基因小麦的
新资源, 证明 SN1 基因在转基因小麦中能够遗传、
表达, 可以提高转 SN1 基因小麦对纹枯病和根腐病
的抗性。转 SN1基因小麦阳性植株对纹枯病和根腐
病的抗性程度与 SN1表达量呈正比。
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Rhizoctonia solani. Transgenic Res, 2009, 18: 59−69



科学出版社生物分社新书推介
《水稻分子育种技术指南》生命科学实验指南系列
钱前 著
出版时间：2012年 3月
书号：978-7-03-033039-0
定价：￥98.00
本书系统地介绍了水稻农艺性状和生理特性及鉴定、遗传资源评价、
经典（分子）遗传分析法等系列基本操作技术、水稻杂交法、常规育种
方法、分子育种方法、育种技术的发展和变迁。展示了水稻功能基因组
和功能基因/标记的最新进展。阐述了表型和基因（P-G）在分子水平的有
机结合及 PG应用技术。反映了水稻分子育种技术平台建设方面获得的成
果。全书共分 4部分 13章，各章节前后呼应，又独立成章，是一本涵盖
了等多方面理论和实际操作技术的最新参考书。

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