全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（10）：2033–2038 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–07–05；修回日期：2013–09–09
基金项目：教育部热带作物新品种选育工程中心与作物学重点学科联合资助项目（lhxm-2012-7）；海南省自然科学基金项目（313032）；
公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203071）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：tyq68@126.com；suiguangyang@yahoo.com.cn）
鹤顶兰四倍体植株的诱导与鉴定
李豆豆 1，刘芝龙 2，黄明忠 2，陈积天 1，唐燕琼 1,*，杨光穗 2,*
（1 海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南大学农学院，海口 570228；2中国热带农业
科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州 571737）
摘 要：以鹤顶兰原球茎为材料，使用秋水仙素进行了四倍体的离体诱导。结果表明，采用秋水仙
素浸泡法可以诱导鹤顶兰原球茎发生倍性变化，含 0.02%秋水仙素的“花宝一号”溶液浸泡处理 6 d 诱导
率最高，达 22.5%。细胞学鉴定发现，诱变成活植株中有 3 株为四倍体，其植株形态、气孔大小、气孔密
度与二倍体存在差异，细胞核明显增大。
关键词：鹤顶兰；秋水仙素；四倍体；原球茎
中图分类号：S 682.31 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）10-2033-06

Induction and Determination of Tetraploid Plants of Phaius tankervilleae
LI Dou-dou1， LIU Zhi-long2，HUANG Ming-zhong2，CHEN Ji-tian1，TANG Yan-qiong1,*，and YANG
Guang-sui2,*
（1Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Gemplasm Resources，Hainan University，
Ministry of Education；College of Agronomy，Hainan University，Haikou 570228，China；2Tropical Crops Genetic Resources
Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou，Hainan 571737，China）
Abstract：Tetraploids of Phaius tankervilleae were induced through the treatment of protocorms with
colchicine in vitro. The results showed that ploidy levels of protocorms changed with colchicine soaking
and the highest induction rate of 22.5% was obtained by immersing protocorms into 0.02% colchicine
solution for 6 days. Cytological determination of regenerated plants indicated that three tetraploid plantlets
were obtained among mutated plants survived，and the morphology，the number and size of stomata of the
mutants were different from those of the diploid plants，with obviously bigger nucleus.
Key words：Phaius tankervilleae；colchicine；tetraploid；protocorm

鹤顶兰（Phaius tankervilleae）为兰科鹤顶兰属植物（陈心启 等，1999）。其生长茂盛，株高
60 ~ 200 cm，花葶直立，高可达 2 m，着花 10 ~ 25 朵，花形优美，色泽鲜艳，为盆花、切花及园林
景观造景的极好材料；其假鳞茎可入药，具有止咳祛痰、活血止血的功效（国家中医药管理局中华
本草编委会，1999）。
鹤顶兰栽培利用已有 200 多年的历史，鹤顶兰栽培品种十分丰富。目前国内外对鹤顶兰的研究
在离体快繁、杂交育种及分子生物学等方面（李冬妹 等，2008，2010）已有阶段性成果，但尚无多

2034 园 艺 学 报 40 卷
倍体育种的报道。
多倍体植物营养器官肥厚、花大、花期长、抗性强，是花卉育种中重要的种质资源。目前在兰
属（Cymbidium Sw）、石斛属（Dendrobium）和文心兰属（Oncidium）等已有染色体加倍成功的报
道（Stefano，2001；李涵和郑思乡，2005；崔广荣 等，2009；郑宝强 等，2009；季必霞，2011）。
本研究旨在建立鹤顶兰四倍体秋水仙素诱导体系，获得四倍体植株，创造新的种质资源。
1 材料与方法
1.1 材料
将 2011 年采自海南岛尖峰岭的鹤顶兰成熟果荚经无菌播种后获得原球茎。选取发育状况良好、
大小相似、直径约为 0.2 cm 的原球茎为试验材料。
1.2 多倍体的诱导
浸泡法：将无菌原球茎浸入秋水仙素浓度为 0、0.02%、0.04%、0.08%的“花宝一号”（主要
成分是 N︰P︰K = 7︰6︰19 的化肥）液体培养基中，分别处理 3、6 和 9 d，每个处理原球茎 100 个，
置于转速为 70 r · min-1 的摇床上振荡培养。处理后用无菌水冲洗 4 次，转接到 3 g · L-1“花宝一
号”+ 1.0 mg · L-1 BA + 0.5 mg · L-1 NAA + 2 g · L-1 活性炭 + 8 g · L-1 卡拉胶的培养基上，每瓶接种
5 个原球茎。
混培法：取无菌原球茎，将其转入秋水仙素浓度为 0、0.02%、0.04%、0.08%的“花宝一号”固
体培养基中，培养时间分别为 15、30 和 35 d，每个处理原球茎 100 个。处理后转接到 3 g · L-1
“花宝一号”+ 1.0 mg · L-1 BA + 0.5 mg · L-1 NAA + 2 g · L-1 活性炭 + 8 g · L-1 卡拉胶的培养基上，每
瓶接种 10 个原球茎。
培养条件为（25 ± 2）℃，光照 2 500 lx、10 h · d-1。定期将污染苗挑出，3 个月后（此时成活原
球茎已经分化成苗）观察记录死亡率和变异率。
死亡率（%）= 死亡的原球茎数/总数 × 100。
诱导率（%）= 产生变异的原球茎数/总数 × 100。
1.3 植株形态初筛及气孔与染色体鉴定
取变异植株和培养时间相同的对照植株相比，观察其根系直径、叶片厚度和植株形态，初步筛
选出根系粗壮，叶片加厚，植株矮小的变异植株。
取上述植株的叶片，在背面中部均匀涂上一层透明指甲油，凝固后将指甲油膜取下，将其与叶
片接触面向上平铺于载玻片上，在显微镜下观察。
每一植株取 10 个视野，统计气孔密度，每个视野随机取一个气孔测量气孔保卫细胞长度和宽
度，重复 3 次。
取通过以上两种方法初步判断为倍性发生变化的幼苗根尖，冲洗干净后用饱和对二氯苯于 4 ℃
冰箱中预处理 5 h，然后用卡诺氏液于 4 ℃冰箱中固定 4 ~ 24 h，用 1 mol · L-1 盐酸常温解离 12 min
后蒸馏水冲洗 4 ~ 5 次，卡宝品红染色压片、镜检并统计染色体数。
每一植株统计 20 个以上细胞，以四倍体细胞所占比例高于 85%作为纯合体的鉴定指标（王木
桂 等，2010）。
10 期 李豆豆等：鹤顶兰四倍体植株的诱导与鉴定 2035

2 结果与分析
2.1 秋水仙素处理对鹤顶兰原球茎的影响
浸泡法处理结果如表 1 所示：秋水仙素不同处理浓度和处理时间的组合对鹤顶兰原球茎的诱导
率有明显影响。方差分析结果显示，秋水仙素浓度为 0.02%、0.04%、0.08%的原球茎平均死亡率分
别为 52.4%、73.3%和 52.2%，相互之间差异不显著，但匀显著高于对照（4.7%）。0.02%秋水仙素的
诱导率显著高于对照，而与其他浓度的诱导率没有显著差异。

表 1 秋水仙素溶液不同浓度和处理时间对鹤顶兰原球茎的诱变结果
Table 1 The induction effects of colchicines concentration and duration on Phaius tankervilleae
秋水仙素/%
Colchicine
浸泡天数/d
Immersion
days
变异株数
Numbers of
polyploidy plants
统计总数
Total numbers of
protocotms
四倍体株数
Number of
tetraploid plants
死亡率/%
Death rate
死亡率
均值/%
Mean 诱导率% Induction rate 诱导率 均值/% Mean
3 14 90 0 35.6 15.6
6 4 70 0 54.3 5.7
0.08
9 0 75 0 66.7
52.2 a
0
7.10 ab
3 7 70 0 60.0 10.0
6 8 80 2 70.0 10.0
0.04
9 0 90 0 90.0
73.3 a
0
6.67 ab
3 11 55 1 18.0 20.0
6 18 80 0 52.5 22.5
0.02
9 0 90 0 86.7
52.4 a
0
14.17 a
0 3 0 80 0 0 4.7 b 0 0 b
6 0 75 0 5.3 0
9 0 90 0 8.9 0
注：同一列数据后字母为邓肯氏多重比较的差异显著性，小写字母表示 P < 0.05 显著水平。
Note：Values followed by the same letter are not significantly different according to Duncan’s multiple range test at P < 0.05.

处理 9 d 时原球茎的死亡率（63.08%）显著高于 3 d 的（28.40%），而与 6 d 的死亡率差异不显
著；秋水仙素处理 3 d 的诱导率（11.40%）显著高于 9 d 的，但与 6 d 的诱导率差异不显著（表 2）。
处理时间 6 d 以下各试验浓度均有多倍体产生，处理时间为 9 d 时各浓度诱导率为 0。秋水仙素
浓度 0.02%处理 6 d 诱导率最高达 22.5%。秋水仙素浓度 0.02%处理 3 d 和 0.04%处理 6 d 下得到纯
合四倍体。处理时间、药剂浓度与其毒害强度呈正相关。变异植株生长缓慢，叶片深绿，均表现出
一定的畸形现象。而处理时间为 6 d 时死亡率达到 50%以上。

表 2 秋水仙素溶液不同处理时间原球茎死亡率、诱导率的邓肯氏法检验
Table 2 mortality and induction rate of protocorm treated with colichicines for
diffenerent days by Duncan’s multiple range test
浸泡天数/d
Immersion days
死亡率/%
Death rate
诱导率/%
Induction rate
3 28.40 b 11.40 a
6 45.53 ab 9.55 ab
9 63.08 a 0 b

混培法处理鹤顶兰原球茎，未死亡的原球茎均产生膨大现象。将膨大的原球茎转入不含秋水仙
素的培养基中培养 6 个月后，死亡率达到 90%以上，而存活材料叶片浅绿，边缘褐化，出现逐渐死
亡的趋势，根尖中未检测出多倍体细胞，即未能获得多倍体。
2036 园 艺 学 报 40 卷
2.2 鹤顶兰多倍体再生植株的鉴定
变异植株叶片颜色深绿、有裂叶、植株矮小、粗壮并表现出一定的畸形现象（图 1）。纯合四倍
体与嵌合体的气孔长度、宽度、叶片下表皮细胞均显著大于二倍体，气孔密度则显著小于二倍体（图
2，表 3）。经根尖染色体压片法鉴定 3 株为纯合四倍体，其根尖细胞四倍体细胞所占比例分别为 95%、
90%及 86%。四倍体 2n = 4x = 76，二倍体为 2n = 2x = 38（图 3），其余 55 株变异植株根尖细胞由二
倍体和四倍体细胞组成。未观察到六倍体及六倍体以上的细胞。对照植株根尖未检测到多倍体细胞。

图 1 浸泡法获得变异植株形态对比
Fig. 1 Comparison of plant that obtained from immersion method


图 2 四倍体与二倍体及嵌合体叶片下表皮的比较
Fig. 2 Comparison of the leaf lower epidermis of tetraploid，diploid and mixoploid













图 3 二倍体与四倍体染色体条数对比
Fig. 3 Comparison of the chromosome numbers of tetraploid and diploid
10 期 李豆豆等：鹤顶兰四倍体植株的诱导与鉴定 2037

表 3 四倍体与二倍体气孔比较
Table 3 The stoma comparison of tetraploid plants
材料
Material
气孔长度/μm
Length
气孔宽度/μm
Width
气孔密度/（个 · mm-2）
Frequency
四倍体 Teraploid 17.187 ± 1.547 a 14.339 ± 1.936 a 326 ± 7.25 b
二倍体 Diploid 11.870 ± 0.855 b 8.368 ± 0.729 b 1 124 ± 6.37 a
嵌合体 Mixoploid 15.196 ± 3.078 a 13.287 ± 2.962 a 383 ± 12.65 b

3 讨论
化学诱变育种技术与植物组织培养技术相结合具有不受环境条件限制、获得多倍体材料易扩繁、
缩短育种周期、诱变效率高等优点而成为诱导多倍体的有效途径（吴伟刚 等，2005；沈河溪 等，
2011）。本研究中通过秋水仙素处理获得了鹤顶兰的变异植株，丰富了鹤顶兰种质资源。秋水仙素处
理时间越长，鹤顶兰原球茎的死亡率越高，但处理浓度与死亡率之间无明显的对应关系，此结果与
王木桂等（2010）在大花蕙兰四倍体的诱导结果相同。
对比浸泡法与混培法诱导效果发现，混培法培养 30 d 后存活原球茎生长点均有膨大现象，但其
后期培养鹤顶兰再生植株未检测出多倍体，再生植株死亡率高。浸泡法处理变异率小于混培法但其
变异相稳定，变异植株培养 1 年后未观察到回复突变现象，此研究与张志胜等（2007）红掌四倍体
的离体诱导及其鉴定的结果不同，可能因材料不同而有所差异。由于鹤顶兰变异植株生长缓慢，且
存在生长不同步的现象，无法对其形态数据进行测量。
变异植株生长缓慢，叶片深绿，植株粗壮，叶片表面粗糙，气孔增大，气孔密度减小，均表现
出不同程度的畸形现象，与其它兰科植物试验结果类似（李涵 等，2005；季碧霞，2011）；而染色
体鉴定结果表明其染色体数加倍，细胞核仁明显增大，这与童俊等（2009）的研究结果类似，仅观
察到二倍体及四倍体两种细胞类型，与宋新红（2012）研究结果不同。流式细胞仪以其快速、简单
等优点而在植物的倍性分析中频繁应用，鹤顶兰流式细胞仪鉴定时未裂解到细胞而导致试验失败，
可能与裂解液的选取有关，其裂解液成分有待摸索。
秋水仙素浸泡法处理鹤顶兰原球茎诱导多倍体苗获得成功，以秋水仙素浓度 0.02% ~ 0.08%处理
时间 3 ~ 6 d 为宜，最佳诱导组合为秋水仙素浓度 0.02%处理时间 6 d，诱导率高达 22.5%。变异材料
经鉴定有 3 株根尖细胞 85%以上为四倍体细胞，可以认定为纯合四倍体。其余 55 株为二倍体与四
倍体嵌合体。变异植株矮小粗壮、叶片肥厚深绿且生长缓慢表现出一定的畸形现象。叶片下表皮细
胞及气孔显著增大。

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