全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（3）：441–448 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–10–10；修回日期：2013–02–27
基金项目：河北省自然科学基金项目（C2010000773）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zzh@hebau.edu.cn）
低温逆境下两个抗寒性不同的核桃幼叶 Ca2+的
亚细胞定位的变化
田景花 1，王红霞 2，张志华 2,*，高 仪 1
（1 河北农业大学园艺学院，河北保定 071001；2 河北农业大学山区研究所，河北保定 071001）
摘 要：为揭示核桃的抗寒机理，研究了低温逆境下不同抗寒性核桃（Juglans regia L.）品种展叶期
叶片细胞中第二信使 Ca2+的分布变化。试验材料为抗寒性较强的核桃品种‘哈特雷’和抗寒性较差的‘晋
龙 2 号’展叶期 1 年生枝的顶端幼叶，将枝叶于 1 ℃低温下分别水培处理 3、12、24、48 和 72 h，以未
经低温处理的叶片作为对照，采用电镜细胞化学方法，定位观察叶肉细胞中的 Ca2+分布。结果表明，展
叶期核桃幼叶细胞中 Ca2+主要分布于液泡和细胞间隙中，线粒体、叶绿体和细胞核中也有较多 Ca2+分布，
基础细胞质中 Ca2+含量较少。1 ℃低温可使细胞质和细胞核中的 Ca2+浓度迅速升高，在低温处理 24 h 时，
抗寒性较强的‘哈特雷’细胞中游离 Ca2+浓度开始下降，处理 72 h 时基本恢复到静息态水平，细胞超微
结构变化不大，叶片无明显冷害症状；而抗寒性较差的‘晋龙 2 号’叶片的细胞质、线粒体及细胞核中
Ca2+浓度始终处于较高水平，到处理 72 h 时细胞超微结构冷害明显，部分幼叶叶缘呈水浸状。可见，低
温逆境下抗寒性较强的品种叶肉细胞质中出现短时间的 Ca2+高峰，随后能恢复到静息态水平；而抗寒性
差的品种难以恢复，不能完成第二信使的信号传导过程，最终导致细胞和组织冷害。因此，低温逆境下
能否恢复第二信使 Ca2+的稳定平衡与核桃的抗寒性密切相关。此外，低温处理 12 h 后核桃幼叶的叶绿体
被膜上普遍出现 Ca2+沉淀，推测此时叶绿体可能起着临时贮存 Ca2+的作用，以促进细胞质中 Ca2+浓度回
落到静息态水平；线粒体可能也具有此作用。
关键词：核桃；抗寒性；低温胁迫；钙离子；细胞化学；透射电子显微镜；超微结构
中图分类号：S 664.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）03-0441-08

Alterations in Subcellular Localization of Ca2+ in Young Leaves of Chilling-
sensitive and Chilling-insensitive Walnut Cultivars Under Chilling Stress
TIAN Jing-hua1，WANG Hong-xia2，ZHANG Zhi-hua2,*，and GAO Yi1
（1College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China；2Mountainous Areas Research
Institute，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China）
Abstract：The changes of the second messenger Ca2+ level in the mesophyll cells of chilling-sensitive
and chilling-insensitive walnut（Juglans regia L.）cultivars were ascertained under chilling stress with the
purpose of exploring the mechanism of cold resistance. The young leaves at the top of one-year-old

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branches of two walnut cultivars during the leaf expansion period were tested. Chilling-insensitive cultivar
is‘Hartley’，and chilling-sensitive cultivar is‘Jinlong 2’. The water culturing branches and leaves
were chilled at 1 ℃ for 3，12，24，48 or 72 h，and leaves untreated were used as controls. The localization
of Ca2+ in the mesophyll cells was investigated with the cytochemical method by transmission electron
microscope. The results were as follows：Calcium antimonate deposits indicating Ca2+ distribution were
localized mainly in the vacuoles and intercellular spaces in the control leaves. Some Ca2+ deposits were
found in the mitochondria，chloroplasts and nuclei，and a few in the cytosol. The Ca2+ level elevated
rapidly in the cytosol and nuclei at 1 ℃ chilling. The cytosolic Ca2+ level decreased in the cells of
‘Hartley’at 1 ℃ for 24 h，and almost restored to Ca2+ homeostasis when chilled up to 72 h. Meanwhile，
the ultrastructure of the mesophyll cells changed slightly，and chilling injury symptoms of the leaves were
not discovered. At the same time，a large number of Ca2+ deposits still existed in the cytosol，mitochondria
and nuclei of‘Jinlong 2’. The ultrastructure of the mesophyll cells was injured obviously and the edges of
part of young leaves were water-soaked status at 1 ℃ for 72 h. It can be seen that the increased cytosolic
and nuclear Ca2+ concentration could restore to a similar low level as those of control in a short time in the
cells of chilling-insensitive cultivar under chilling stress. On the contrary，chilling-sensitive cultivar could
not restore，and could not finish the signal transduction process of second messenger. The cells and tissues
were injured finally. It showed that the cellular Ca2+ homeostasis during chilling stress was closely related
to walnut cold resistance. In addition，some Ca2+ deposits were observed frequently on the chloroplasts
envelope after chilled at 1 ℃ for 12 h. It was deduced that chloroplasts could store Ca2+ temporarily at this
moment，and facilitated cytosolic Ca2+ to resting value. Similarly，mitochondria might be also store Ca2+
temporarily during chilling stress.
Key words：walnut；cold resistance；chilling stress；Ca2+；cytochemistry；transmission electron
microscope；ultrastructure

核桃（Juglans regia L.）属于喜温树种（郗荣庭和张毅萍，1992），春季萌动后抗寒能力迅速
下降。近年来，由于晚霜引起的核桃花芽、嫩梢、花器官和幼果等寒害时有发生，严重影响产量（陈
金海和罗仁仙，2011），因此防止核桃寒害是生产上需要解决的问题。有关核桃抗寒机理方面的研
究报道较少。Ca2+信使系统是植物细胞内的第二信使，与低温信息的传递密切相关（Poovaiah &
Reddy，1993；Hetherington & Brownlee，2004；Hepler，2005）。因此研究低温逆境下不同抗寒性
核桃品种幼叶细胞中 Ca2+的动态变化，对于阐明核桃的抗寒机理具有重要意义。研究表明，环境胁
迫能通过质膜和胞内钙库膜上的 Ca2+通道提高细胞质中的游离 Ca2+浓度，从而激活 Ca2+调节的靶酶
或与钙调素结合来启动一系列特异的生理生化过程，之后 Ca2+再通过细胞中的 Ca2+跨膜运输系统，
如 Ca2+-ATPase 或 Ca2+/H+反向传递体等迅速外流或被胞内贮钙体吸收，细胞质中 Ca2+浓度回落到静
息态水平，从而完成信息传递。在植物的细胞质、细胞核、叶绿体、质膜等部位已发现可被 Ca2+/CaM
激活的靶酶（Bush，1995；孙大业 等，2001）。适宜温度下植物细胞内的 Ca2+主要分布在细胞间
隙和液泡中，细胞质和细胞核内的 Ca2+水平很低。已有的研究表明，低温胁迫可导致细胞质中的自
由 Ca2+水平升高（Knight et al.，1996；Knight，2002；Wang et al.，2004），并认为细胞质中 Ca2+
水平短暂迅速升降是 Ca2+行使信使功能的关键环节，而高浓度的 Ca2+长期存在会对细胞产生毒害作
用（Sanders et al.，1999；简令成和王红，2008）。本研究中采用焦锑酸钙沉淀法，在透射电镜下定
位观察细胞内的 Ca2+变化特征。通过研究低温逆境下不同抗寒性核桃品种展叶期叶肉细胞中 Ca2+的
定位变化，探讨其抗寒性差异的原因，以期为揭示核桃的抗寒机理提供科学依据。
3 期 田景花等：低温逆境下两个抗寒性不同的核桃幼叶 Ca2+的亚细胞定位的变化 443

1 材料与方法
1.1 试验材料及其低温处理
以展叶期抗寒性不同的两个核桃品种的一年生枝叶为试验材料，抗寒性较强的品种为‘哈特雷’
（Hartley），抗寒性较差的品种为‘晋龙 2 号’。经电导法测定，两个品种展叶期叶片的低温半致
死温度分别为–7.38 ℃和–0.40 ℃（田景花 等，2012）。材料采自河北农业大学标本园，树势中
庸。
在核桃展叶期（2010 年 4 月 22—25 日，日平均气温 16.3 ℃，最低气温平均 10.5 ℃）于早晨 8
时取样。每品种每个处理分别选取 4 个形态长势基本一致的 1 年生生长枝，于智能人工气候箱（宁
波海曙赛福实验仪器厂）中水培，光照强度 4 000 lx，光照时间 12 h，在 5 ℃下预处理 2 h 后缓慢降
温至 1 ℃进行低温处理，分别处理 3、12、24、48 和 72 h 后取材，以未经低温处理的为对照。
1.2 幼叶细胞中 Ca2+的细胞化学定位
Ca2+的细胞化学定位参考张红等（1994）的方法。各处理取枝条顶端幼叶 3 片，用预冷的蒸馏
水冲洗干净，滤纸吸干。所用器具经过预冷，在冰浴上用双面刀片在叶片中脉两侧切取 0.5 mm × 1.0
mm 大小的组织块，迅速投入用 2%焦锑酸钾（pH 7.6）配制的 3%戊二醛固定液中，真空泵抽气 15 min，
待大部分叶块下沉后于 25 ℃下固定 1 h，再于 4 ℃下固定 4 h。洗涤后将材料转移至用 2%焦锑酸钾
（pH 7.6）配制的 1% OsO4 中，4 ℃下固定过夜。漂洗后常规系列乙醇脱水，丙酮过渡，环氧树脂
Spon 812 渗透并包埋。于 37、45 和 60 ℃下分别聚合 12、12 和 24 h。LKB-8800 型超薄切片机切片，
2%醋酸双氧铀 25 ℃下染色 30 min，在 JEM-100SX 型透射电子显微镜下观察并拍照。
对照切片的处理：在电镜下确定某切片中已有电子致密的沉淀物后，将载有该切片的铜网飘浮
在 100 mmol · L-1 的 EGTA（pH 8.0）溶液中，60 ℃处理 1 h，水洗晾干后置透射电镜下观察并拍照。
2 结果与分析
低温处理 3、12、24 和 48 h，两个品种枝叶均没有明显的冷害症状；至处理 72 h 时，抗寒性较
差的‘晋龙 2 号’的枝条顶端部分小叶的叶缘开始呈现水浸状，之后变干，而抗寒性较强的‘哈特
雷’仍无明显症状。
电镜观察结果表明，展叶期早晨 8 时核桃幼叶细胞中标志 Ca2+分布的焦锑酸钙沉淀物主要分布
于液泡和细胞间隙中，线粒体、叶绿体、细胞核中也有一定量的 Ca2+分布，质膜、细胞壁和基础细
胞质中 Ca2+沉淀物较少（图 1，A 0 h，B 0 h）。其中抗寒性较强的‘哈特雷’细胞中少数叶绿体被
膜上有 Ca2+分布（图 1，A 0 h）；抗寒性较差的‘晋龙 2 号’细胞核中以及质膜上钙沉淀物的分布
密度高于‘哈特雷’（图 1，B 0 h）。
核桃幼叶经 1 ℃处理 3 h，细胞内的 Ca2+分布变化明显：两品种细胞质、细胞核中 Ca2+沉淀颗
粒均增多（图 1，A 3 h，B 3 h），其中‘晋龙 2 号’密度更高；液泡中的 Ca2+沉淀物趋向液泡膜呈
较大的颗粒状存在，说明 Ca2+对低温信号反应敏感，低温处理可使细胞间隙和液泡中的 Ca2+迅速释
放入细胞质，同时较多的 Ca2+进入细胞核中。
低温处理 12 h，抗寒性较强的‘哈特雷’细胞质、细胞核、线粒体中以及质膜上的沉淀物进一
步增多，部分叶绿体被膜上可见 Ca2+沉淀存在，而细胞间隙的 Ca2+沉淀明显减少（图 1，A 12 h）。
此时‘晋龙 2 号’细胞质中 Ca2+沉淀颗粒进一步增多，细胞核及线粒体中 Ca2+浓度仍较高；叶绿体
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被膜上也出现明显的 Ca2+沉淀，部分叶绿体略膨胀变形（图 1，B 12 h）。这表明叶绿体被膜上具有
Ca2+跨膜运输系统，可将胞质中高浓度的 Ca2+转运入叶绿体中。



3 期 田景花等：低温逆境下两个抗寒性不同的核桃幼叶 Ca2+的亚细胞定位的变化 445


图 1 ‘哈特雷’（A）和‘晋龙 2 号’（B）核桃幼叶经 1 ℃低温处理 0、3、12、24、48 和 72 h 时细胞 Ca2+分布
Ch：叶绿体；N：细胞核；Pm：质膜；V：液泡；Is：细胞间隙；M：线粒体；W：细胞壁；Cp：细胞质；
黑箭头：叶绿体被膜上的 Ca2+沉淀；白箭头：核外膜上出现的管状突起。
Fig. 1 Ca2+ distribution in walnut mesophyll cells of ‘Hartley’（A）and ‘Jinlong 2’（B）at 1 ℃
for 0，3，12，24，48 and 72 h
Ch：Chloroplast；N：Nucleus；Pm：Plasma membrane；V：Vacuole；Is：Intercellular space；M：Mitochondrion；
W：Cell wall；Cp：Cytosol；Black arrows indicate Ca2+ deposits on chloroplasts envelope；
White arrows indicate some tubular enations on the nucleus envelope.

低温处理 24 h，‘哈特雷’细胞质、线粒体和细胞核中 Ca2+沉淀开始减少，细胞核中的沉淀物
聚集成较大的颗粒状；质膜上有较多较大的 Ca2+沉淀颗粒；叶绿体被膜上普遍存在丰富的 Ca2+沉淀
颗粒，整个细胞中游离 Ca2+浓度下降，显示出细胞中的 Ca2+分布正在逐渐恢复静息态水平（图 1，
A 24 h）。而抗寒性较差的‘晋龙 2 号’的细胞质、线粒体和细胞核中仍然存在较多 Ca2+沉淀，细
胞核中 Ca2+沉淀仍为高密度分散状存在；叶绿体被膜上可见 Ca2+沉淀；液泡中大部分 Ca2+沉淀物仍
以颗粒状分布于液泡膜内侧（图 1，B 24 h）。
低温处理 48 h，‘哈特雷’细胞的细胞质、细胞核和线粒体中 Ca2+沉淀进一步减少，同时细胞
间隙的 Ca2+沉淀颗粒增大、增多；质膜及叶绿体被膜上仍有正在外排的 Ca2+沉淀颗粒，叶绿体基质
中 Ca2+沉淀颗粒较多（图 1，A 48 h）。此时‘晋龙 2 号’的线粒体、细胞质和细胞核中仍然存在
较多 Ca2+沉淀，在细胞核中沉淀物主要呈分散状存在；同时叶绿体被膜上普遍存在沉淀颗粒（图 1，
B 48 h）。可见，细胞核中 Ca2+沉淀聚集成较大的颗粒状可能对其外排以及减小对细胞核生理功能
的影响有一定作用；‘晋龙2号’细胞质和细胞核中 Ca2+的排出速度明显慢于抗寒性较强的‘哈特雷’。
低温处理 72 h 时，‘哈特雷’细胞内的 Ca2+水平和分布基本恢复到静息态水平，Ca2+主要集中
到了细胞间隙和液泡中，细胞超微结构变化不大（图 1，A 72 h）。而‘晋龙 2 号’线粒体、细胞质
和细胞核中仍然存在较多的 Ca2+沉淀；在细胞核外膜上还可观察到一些明显的、内部定位有 Ca2+沉
淀颗粒的管状突起（图 1，B 72 h，白箭头），其中大部分伸向细胞壁或液泡，可能是新形成的内质
网或一种特殊结构，是细胞核中较长时间存在高浓度 Ca2+时的一种外排渠道；部分损伤较轻的叶绿
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体被膜上仍有 Ca2+沉淀物；同时部分细胞的叶绿体、质膜上遍布大的 Ca2+沉淀颗粒，细胞超微结构
冷害较重，叶绿体严重变形，基粒片层变薄，质壁分离明显，但线粒体结构及其中 Ca2+浓度变化不
大（图 1，B 72 h）。
已确定有电子致密沉淀物的切片经 EGTA 处理后，以上观察到的沉淀颗粒即被消除，在原有
Ca2+分布的液泡、细胞间隙、细胞壁及叶绿体中表现出与原来沉淀物形状相似的电子透明区域（图
1，EGTA），表明切片中的沉淀物是 Ca2+存在的真实反映。
3 讨论
3.1 植物细胞中 Ca2+的分布
适宜温度下植物细胞中的游离 Ca2+主要分布于液泡及细胞间隙中，细胞质、细胞核和线粒体中
Ca2+含量少（Knight，2002；Wang et al.，2004）。本研究表明，展叶期核桃幼叶细胞的线粒体、叶
绿体和细胞核中也有较多的 Ca2+沉淀物，‘哈特雷’细胞中少数叶绿体被膜上也有 Ca2+分布。这可
能与试验的取材时间有关，春季夜间温度较低（最低气温平均 10.5 ℃），流入线粒体、叶绿体和
细胞核内的 Ca2+到早晨 8 时取材时可能尚未恢复到静息态水平。Jian 等（2003，2004）发现在自然
条件下，随着日照时间变短和天气转冷，杨树和云杉等木本植物芽细胞的细胞质和细胞核中 Ca2+浓
度增加，认为可能起着诱导生理休眠的作用，而且细胞核、细胞质中高水平的 Ca2+浓度还起着发展
和保持深度休眠的作用。由此推测，展叶期核桃叶肉细胞的细胞质、细胞核及线粒体等部位较高的
游离 Ca2+浓度可能与防止冷害有关。关于叶绿体被膜上出现 Ca2+的分布少见报道，可能在胁迫程度
较轻、胁迫持续时间较长时容易观察到。对小麦幼苗干旱处理（用 PEG-6000 模拟–1.0 MPa 水势），
水分胁迫 24 h 时可观察到叶绿体被膜上出现明显的 Ca2+分布（王凤茹和张晓红，2002）。用过量
NO3-处理黄瓜幼苗时发现叶肉细胞的叶绿体被膜上出现较多的 Ca2+沉淀颗粒（Yang et al.，2008）。
而黄瓜幼苗在 1 ℃低温胁迫下未观察到此现象（张红 等，1994）。本研究中，在夜间持续低温下
少数叶绿体被膜上可观察到 Ca2+分布，叶绿体被膜上普遍出现 Ca2+是在 1 ℃胁迫 12 h 后。
3.2 低温逆境下叶绿体、线粒体及细胞核中 Ca2+的动态分布
有研究表明，叶绿体在保持胞质内外 Ca2+动态平衡中发挥作用（Miller et al.，1987），叶绿体
膜上存在 Ca2+-ATPase 活性（曾韶西和李美茹，1999；张宗申 等，2001）。本研究中发现随着低温
处理时间的延长，两个核桃品种幼叶的叶绿体被膜上普遍出现 Ca2+沉淀物，显示细胞质中的 Ca2+可
能正在外排入叶绿体中，为叶绿体被膜上存在 Ca2+传递体系提供了直观的证据。另外，在低温处理
前及处理初期的叶绿体被膜上很少观察到 Ca2+沉淀颗粒，而处理中后期叶绿体被膜上普遍存在，由
此推测叶绿体可能在 Ca2+低温信号传导过程中在细胞内起着临时贮存 Ca2+的作用，主要在胞质中
Ca2+浓度持续较高时起作用，以维持细胞信号传导的准确性和敏感性，待信号传导结束后，叶绿体
中的 Ca2+再逐渐排出去。同时可以看出叶绿体被膜上的 Ca2+运输速度较慢，其中的 Ca2+浓度增加不
快；一直到叶绿体严重变形，其膜结构受到一定破坏，叶绿体中的 Ca2+沉淀颗粒才显著增多。前人
研究表明，Ca2+-ATPase 对 Ca2+有较高的亲合性，但运输能力低；而 Ca2+/H+反向转运蛋白相反，与
Ca2+是低亲合，但运输能力强的载体（Shigaki & Hirschi，2006；Pottosin & Schönknecht，2007），
有关叶绿体被膜上的 Ca2+跨膜运输系统有待进一步研究。
线粒体是动物细胞内的主要钙库之一，它在动物细胞 Ca2+调节方面起着持久的、大容量的调节
作用。线粒体吸入 Ca2+后，能以不影响细胞代谢的速度释放 Ca2+（孙大业 等，2001；Sergeant et al.，
3 期 田景花等：低温逆境下两个抗寒性不同的核桃幼叶 Ca2+的亚细胞定位的变化 447

2008），在植物细胞中尚缺乏这方面的报道。本研究表明，低温逆境下核桃叶肉细胞线粒体中 Ca2+
含量快速提高，抗寒性较差的‘晋龙 2 号’线粒体中 Ca2+含量始终较高，而抗寒性较强的‘哈特雷’
在低温处理 48 h 后线粒体中的 Ca2+含量显著减少，推测线粒体在植物细胞中也具有临时贮存 Ca2+
的作用。同时，低温逆境下线粒体结构相对稳定，这样才能维持正常的呼吸代谢并释放更多的热量
抵御低温。一旦线粒体结构被破坏，表明组织接近或者已经死亡（田景花 等，2002）。
Xi 等（2012）在植物细胞核中鉴定出一种植物特有的三螺旋转录因子 AtGT2L，并证明为 Ca2+
依赖型钙调素结合蛋白，低温胁迫和盐胁迫下表达增强，其过量表达可以促进冷诱导的标志基因
RD29A 的高表达。可见，Ca2+可以通过调控核基因的表达来影响植物的抗寒性。本研究发现，随着
低温处理，细胞核中的 Ca2+浓度迅速升高，几乎与细胞质中同时进行，甚至浓度高于细胞质，这可
能与较大的核孔有关。细胞核的快速反应有助于其迅速接受低温信号，调控基因表达，以适应低温
逆境。另外，在低温处理 72 h 的‘晋龙 2 号’细胞核外膜上观察到一些内含 Ca2+沉淀颗粒的管状突
起，其中大部分伸向细胞壁或液泡，这一点尚未见文献报道。可能是新形成的内质网或一种特殊结
构，有助于细胞核中高浓度 Ca2+的迅速外排。
3.3 低温逆境下叶肉细胞中 Ca2+的分布变化与植物抗寒性的关系
作为植物细胞内第二信使，Ca2+对低温逆境反应敏感。不抗寒植物在低温下其质膜和核膜的
Ca2+-ATPase 失活，胞质内和核内增加的 Ca2+不能被泵回胞外或钙库，造成细胞死亡（Jian et al.，
1999）。本研究表明，随着低温处理，核桃幼叶细胞的细胞质和细胞核中 Ca2+浓度迅速升高；处理
24 h 时，抗寒性较强的‘哈特雷’细胞中 Ca2+分布情况正在恢复，到 72 h 时基本恢复到静息态水平，
完成了第二信使的功能；而抗寒性较差的‘晋龙 2 号’细胞质及细胞核中 Ca2+浓度持续较高，可能
与低温逆境下质膜、核膜及液泡膜等上的 Ca2+跨膜运输系统（Ca2+泵或 Ca2+/H+反向传递系统）的失
活或活性下降有关，导致这些区域的代谢及生理功能异常，使细胞结构和组织表现出冷害症状。这
与在葡萄（Wang et al.，2004）上的研究结果基本一致。
一些研究认为质膜和细胞内膜系统上普遍存在 Ca2+传递系统（Hetherington & Brownlee，2004；
Shigaki & Hirschi，2006；Pottosin & Schönknecht，2007）。本研究结果证明，除了质膜和液泡膜，
其它细胞内膜系统，如叶绿体膜、线粒体膜和核膜等上的 Ca2+传递系统不仅调控了低温逆境下这些
细胞器中的生理反应，而且对于维持植物细胞内的 Ca2+稳态平衡，保证低温信号传导具有重要作用。
低温胁迫下质膜及细胞内膜系统上 Ca2+传递系统的冷稳定性与植物的抗寒性密切相关。关于植物细
胞内膜系统上的 Ca2+传递系统了解尚少，值得深入研究。

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