全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（10）：2026–2032 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–06–09；修回日期：2013–09–02
基金项目：国家自然科学基金项目（31070298，30870180）；浙江省科技计划项目（2008C12081）；浙江省自然科学基金项目
（LQ13H280006）；国家级大学生创业创新训练计划项目（201210346002）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：whz62@163.com；Tel：0571-28865330）
兰属植物目标起始密码子（SCoT）遗传多样性
分析
高 岭，冯尚国，何仁锋，赵妙玉，王慧中*
（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江省药用植物种质改良和质量监控重点实验室，杭州 310036）
摘 要：应用 SCoT 分子标记技术对兰属 14 个种的 24 个样品进行遗传多样性分析，27 条引物共扩
增出 259 条 DNA 条带，其中多态性条带 224 条，多态性百分比达 86.49%，条带大小为 100 ~ 2 000 bp，
多数条带分布在 500 ~ 1 300 bp 之间。根据 SCoT 标记计算的遗传距离系数得到的聚类结果可知，24 种兰
属植物可以分为 5 类：A 类：春兰、建兰、蕙兰、莲瓣兰；B 类：墨兰、寒兰；C 类：春剑；D 类：兔耳
兰；E 类：多花兰、文山红柱兰、虎头兰、象牙白、碧玉兰、黄蝉兰，这与传统兰属分类有所区别。
关键词：兰属植物；分子标记；SCoT；遗传多样性
中图分类号：S 682.31 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）10-2026-07

Application of SCoT Molecular Marker in Genetic Diversity of Cymbidium
GAO Ling，FENG Shang-guo，HE Ren-feng，ZHAO Miao-yu，and WANG Hui-zhong*
（College of Life and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Zhejiang Provincial Key Laboratory for
Genetic Improvement and Quality Control of Medicinal Plants，Hangzhou 310036，China）
Abstract：In this research，SCoT markers were applied to detect the genetic diversity among 24
Cymbidum samples of 14 species. Two hundred and fifty-nine DNA bands were generated by 27 primers
including 224 polymorphic bands. The polymorphic percent is 86.49%. Strip size was from 100 bp to
2 000 bp，and most of the bands were concentrated between 500 bp and 1 300 bp. Dendrograms generated
from coefficient of genetic distance between species on the basis of SCoT markers showed that the
germplasms were divided into 5 clusters. Cluster A was composed of C. georingii，C. ensifolium，C.
faberi，and C. tortosepalum；Cluster B included C. sinese and C. kanran；C. goeringii var. ongibracteatum
was cluster C；C. lancifolium belonged to cluster D；Cluster E was composed of C. floribundum，C.
wenshanense，C. hookerianum，C. maguanense，C. lowianum and C. iridioides. The research showed that
part of the result was different from the traditional classification of Cymbidium.
Key words：Cymbidum；molecular marker；SCoT；genetic diversity

兰属为兰科（Orchidaceae）兰族（Trip. Cymbidium）萼足兰亚族（Subtrib. Cyrtopodiinae）（陈
心启和吉占和，1997）。全球有 70 余种兰属植物，按照 Du 和 Cribb（1998）的分类系统，中国有 49

10 期 高 岭等：兰属植物目标起始密码子（SCoT）遗传多样性分析 2027

种兰属植物和一些变种，全部产于秦岭以南地区，包括陕西南部、甘肃南部和河南伏牛山南坡（刘
仲健 等，2006）。人工杂交和栽培选育，以及自然群体杂交，使得兰花品种繁多，这也给兰属植物
的分类、鉴定带来一定程度上的混乱和困难。RAPD、AFLP、ISSR 等分子标记技术的应用为兰属植
物的分类和鉴定提供了许多帮助（文李 等，2001；张俊祥 等，2006；吴振兴 等，2008）。
Collard 和 Mackill（2009）在水稻中提出了一种新型分子标记方法——目标起始密码子多态性
（start codon targeted polymorphism，SCoT）标记。SCoT 标记是一种基于翻译起始位点的目的基因
标记新技术，根据 ATG 翻译起始位点侧翼保守序列来设计单引物，扩增产生偏向候选功能基因区显
性多态性标记。SCoT 分子标记技术与 RAPD、AFLP 相比较具有体系易于建立、重复性好、操作简
单而且多态性丰富的优点（周延清 等，2008；熊发前 等，2009）。目前 SCoT 技术已成功应用于花
生、龙眼、柑橘、马铃薯、杧果等多种植物的遗传学研究之中（陈虎 等，2009；熊发前 等，2010；
Ahmad et al.，2011；韩国辉 等，2011；Cong et al.，2012）。
本研究中采用 SCoT 分子标记技术对 14 个种的 24 份兰属材料进行遗传多样性分析，进而对兰
属植物的系统分类和亲缘关系进行深入研究，为兰属植物的鉴定提供科学依据，并为兰属植物种质
资源的合理利用和保护提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料及其 DNA 的提取与检测
本试验中采用的兰属 14 个种的 24 份材料（表 1）主要采自浙江、云南和广东等省。
表 1 供试的 24 种兰属材料名称
Table 1 Twenty-four species of Cymbidium tested in experiment
种名 Speices 编号 Code 品种名 Cultivar
春兰 Cymbidium georingii（Rchb.f.）Rchb.f. C1 原生种 Natural species
C2 龙字 Longzi
C3 大花富贵 Dahua Fugu
蕙兰 Cymbidium faberi Rolfe C4 原生种 Natural species
C5 仙绿 Xianlü
C6 老染子 Laoranzi
建兰 Cymbidium ensifolium (L.) Sw. C7 原生种 Natural species
C8 大叶白 Dayebai
C9 天荷 Tianhe
墨兰 Cymbidium sinense（Jackson ex Andr）Willd. C10 原生种 Natural species
C11 白墨兰 Baimolan
C12 绿云墨兰 Lüyun Molan
寒兰 Cymbidium kanran Makino C13 原生种 Natural species
C14 天成色 Tianchengse
C15 绿花寒兰 Lühua Hanlan
莲瓣兰 Cymbidium tortosepalum Fukuyama C16
虎头兰 Cymbidium hookerianum Rchb. f. C17
多花兰 Cymbidium floribundum Lindl. C18
象牙白 Cymbidum maguanense F. Y. Liu C19
文山红柱兰 Cymbidium wenshanense Y. S. Wu ex F. Y. Liu C20
春剑 Cymbidium goeringii var. longibracteatum C21
碧玉兰 Cymbidium lowianum（Rchb.f.）Rchb. f. C22
黄蝉兰 Cymbidium iridioides D. Don C23
兔耳兰 Cymbidium lancifolium Hook C24
2028 园 艺 学 报 40 卷
剪取–80 ℃保存的兰属植物叶片 2.5 g 放入研钵，立即加入液氮研磨至粉末，加入 1 mL
CTAB-free 缓冲液[0.5 mol · L-1 EDTA（pH 8.0）100 mL、1.0 mol · L-1 Tris-HCl（pH 8.0）200 mL、
NaCl 14.6 g，定溶至 1 L]，65 ℃震荡水浴 20 min，然后使用生工生物 UNIQ-10 柱式植物基因组 DNA
抽提试剂盒，提取兰属植物基因组 DNA（王慧中，2009）。用 1%琼脂糖胶对所得 DNA 进行电泳检
测，并用紫外分光光度计检测 DNA 浓度，稀释至 50 ng · µL-1。
1.2 SCoT 引物筛选
根据 Collard 和 Mackill（2009）所设计的 36 条通用引物，从中筛选出 27 条能对兰属材料进行
扩增并且得到清晰条带的引物（表 2）。
1.3 SCoT-PCR 分析
PCR 反应体系总体积为 20 µL，包括 1 µL 基因组模板 DNA 50 ng，1 µL 引物（10 mmol · L-1），
2 µL 10× PCR 缓冲液（含 Mg2+），1 µL 底物 dNTPs（2.5 mmol · L-1），0.5 µL Taq 酶（2 U · µL-1）和
14.5 µL ddH2O。
SCoT-PCR 扩增程序：94 ℃预变性 3 min；35 个循环（94 ℃变性 1 min，引物 Tm值复性 1 min，
72 ℃延伸 2 min）；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存（张君玉 等，2011）。
1.4 PCR 产物凝胶电泳和成像分析
用浓度为 1.5%的琼脂糖胶对 PCR 产物电泳检测，并在紫外凝胶成像系统上拍照保存。
1.5 数据统计与分析
ScoT 分子标记是多位点显性标记技术，扩增产物每一条带作为一个位点，有条带记作 1，无条
带记作 0。通过 NTSYS 软件计算出兰属各个物种间的遗传相似性系数和遗传距离，并根据遗传相似
系数构建兰属物种间的二维聚类图，利用 MEGA5.1 软件根据遗传距离进行 UPGMA 聚类分析。
2 结果与分析
2.1 种间多态性
每条引物能在每个 DNA 样品中扩增出 2 ~ 15 条带，片段大小在 100 ~ 2 000 bp 之间（图 1）。

图 1 12 号引物扩增结果
Fig. 1 SCoT profiles generated by primer 12

27 条 SCoT 引物对 24 种兰属植物材料扩增共检测出 259 个位点，平均每条引物检测出 9.9 个位
点，多态性位点 224 个，多态性百分比达 86.49%。多态性最高的是 7、9、29、30 号引物，多态性
10 期 高 岭等：兰属植物目标起始密码子（SCoT）遗传多样性分析 2029

达 100%，多态性最低的是 6 号引物，多态性为 50%（表 2）。

表 2 SCoT 引物序列及其扩增条带数
Table 2 SCoT primer sequence and the number of SCoT bands
引物编号
Primer code
引物序列
Primer sequence
退火温度/℃
Tm
扩增条带数
Number of
amplified bands
多态性条带数
Polymorphic
bands
多态性百分比/%
Polymorphism
percentage
1 CAACAATGGCTACCACCA 49.86 7 6 85.70
2 CAACAATGGCTACCACCC 50.73 10 8 80.00
3 CAACAATGGCTACCACCG 51.27 13 12 92.31
4 CAACAATGGCTACCACCT 49.5 12 9 75.00
5 CAACAATGGCTACCACGA 50.1 4 3 75.00
6 CAACAATGGCTACCACGC 52.05 2 1 50.00
7 CAACAATGGCTACCACGG 51.27 8 8 100.00
8 CAACAATGGCTACCACGT 50.41 8 7 87.50
9 CAACAATGGCTACCAGCA 50.32 9 9 100.00
11 AAGCAATGGCTACCACCA 51.37 9 8 88.89
12 ACGACATGGCGACCAACG 55.93 11 10 90.91
13 ACGACATGGCGACCATCG 55.39 9 5 55.56
14 ACGACATGGCGACCACGC 55.58 7 6 85.71
16 ACCATGGCTACCACCGAC 49.86 8 7 87.50
18 ACCATGGCTACCACCGCC 57.90 8 7 87.50
22 AACCATGGCTACCACCAC 51.85 9 7 77.78
23 CACCATGGCTACCACCAG 52.43 14 12 85.71
24 CACCATGGCTACCACCAT 51.58 9 8 88.89
28 CCATGGCTACCACCGCCA 57.10 11 10 90.91
29 CCATGGCTACCACCGGCC 57.90 15 15 100.00
30 CCATGGCTACCACCGGCG 58.32 15 15 100.00
31 CCATGGCTACCACCGCCT 56.77 10 8 80.00
32 CCATGGCTACCACCGCAC 55.94 13 12 92.31
33 CCATGGCTACCACCGCAG 55.62 12 11 91.67
34 ACCATGGCTACCACCGCA 56.27 10 8 80.00
35 CATGGCTACCACCGGCCC 57.90 8 5 62.50
36 GCAACAATGGCTACCACC 51.53 8 7 87.50
总数 Total 259 224 86.49

2.2 遗传相似性分析
利用 NTSYS 软件计算出 24 种兰属植物的遗传相似系数，并制作成二维图（图 2）。24 种兰属
植物的遗传相似系数在 0.62 ~ 0.83 之间，其中建兰‘大叶白’和建兰‘天荷’之间遗传相似性系数
最高，为 0.83，春兰‘大花富贵’和‘兔耳兰’遗传相似性系数最低，为 0.62，表明它们具有较大
的遗传基础差异。总体来说，24 种供试的兰属植物材料存在丰富的遗传多样性。
2.3 SCoT 聚类分析
利用 MEGA5.1 软件对 24 种参试兰属植物进行聚类分析，由聚类结果（图 3）可知，24 种兰属
植物可以分为 5 类：A 类：春兰、建兰、蕙兰、莲瓣兰；B 类：墨兰、寒兰；C 类：春剑；D 类：
兔耳兰；E 类：多花兰、文山红柱兰、虎头兰、象牙白、碧玉兰、黄蝉兰。


2030 园 艺 学 报 40 卷


图 2 根据 SCoT 标记计算各物种间相似系数的二维图
Fig. 2 Two-dimension drawing generated from genetic similarity between species on the basis of SCoT markers



图 3 根据 SCoT 标记计算的遗传距离系数获得的聚类图
Fig. 3 Dendrograms generated from coefficient of genetic distance between species on the basis of SCoT markers
10 期 高 岭等：兰属植物目标起始密码子（SCoT）遗传多样性分析 2031

3 讨论
SCoT 分子标记技术是基于单引物扩增反应（single primer amplification reaction）开发出来的，
根据 ATG 侧翼保守序列设计引物，能有效产生与功能基因相关与性状联系的标记，多态性丰富，为
种质资源遗传分析和分子辅助育种提供依据（陈虎 等，2010）。SCoT 标记技术对于兰属植物 DNA
多态性鉴定、遗传多样性评价和系统发育具有一定的功能性和有效性，对兰属植物鉴定、品种选育
和遗传图谱的构建具有重要意义。
按照刘仲健等（2006）的分类，本研究中所用到的兰属植物 14 个种共包括 3 个亚属 4 个组。
其中，多花兰属于兰亚属的多花组；黄蝉兰、虎头兰、碧玉兰、文山红柱兰属于大花亚属种的大花
组；建兰、墨兰、蕙兰、寒兰、春兰以及春剑则属于建兰亚属的建兰组；兔耳兰属于建兰亚属的兔
耳兰组。
根据本研究中引物扩增的条带结果显示，23 号和 27 号引物能将所有种区分开，种间差异明显，
但是在品种间的差别较小，仅在建兰品种间的变异较高，因此可将 SCoT 分子标记技术作为兰属植
物鉴定可信度较高的一种方法。从聚类结果分析看，A 类、B 类包括建兰组的 5 个种，C 类为春剑，
D 类为兔耳兰组的兔耳兰，A、B、C、D 四类同属建兰亚属。E 类包括多花兰、黄蝉兰、虎头兰、
碧玉兰、文山红柱兰。遗传相似性系数作图（图 2）与聚类结果（图 3）结果基本一致，但与传统分
类比较，春剑和多花兰的分类有所差别。程少丽等（2006）利用 RAPD 技术分析云南兰属部分种种
间关系结果表明春剑与春兰亲缘关系较远，不支持传统分类中把春剑作为建兰亚属建兰组的一个品
种。本研究中春剑单独聚为一类，也不支持传统分类中对春剑的划分。杨光穗等（2011）利用 SRAP
技术分析海南野生兰属植物亲缘关系结果显示寒兰、建兰、墨兰、兔耳兰可聚为一类，与传统分类
结果基本一致，本研究的结果同样支持将寒兰、建兰、墨兰分为一类，但兔耳兰则单独聚为一类，
与季祥彪等（2008）利用 RADP 技术对贵州 12 种兰属植物资源分析结果中兔耳兰和矮珍珠聚为一
类的结果相似。SCoT 标记对兰属的分类与传统的形态学分类基本相似，在个别种上有部分差异，
因此本研究对兰属植物分类的研究具有重要的补充作用。本研究与其他研究结果有所区别，这种区
别可能是由物种、地域差异所导致，有待在今后研究中做进一步考证。

References
Ahmad M G，Peter P，Zsolt P，Janos T. 2011. Efficiency of arbitrarily amplified dominant markers（SCOT，ISSR，RAPD） for diagnostic
fingerprinting in tetraploid potato. Am J Pot Res，88：226–237.
Chen Hu，He Xin-hua，Luo Cong，Gao Mei-ping，Zhu Jian-hua. 2009. The optimization of SCoT-PCR system of longan （Dimocarpus
longan）.Genomics and Applied Biology，28 (5)：970–974. (in Chinese)
陈 虎，何新华，罗 聪，高美萍，朱建华. 2009. 龙眼 SCoT-PCR 反应体系的优化. 基因组学与应用生物学，28 (5)：970–974.
Chen Hu，He Xin-hua，Luo Cong，Zhu Jian-hua，Li Feng. 2010. Analysis on the genetic diversity of 24 longan（Dimocarpus longan）accessions
by SCoT markers. Acta Horticulturae Sinica，37 (10)：1651–1654. (in Chinese)
陈 虎，何新华，罗 聪，朱建华，李 峰. 2010. 龙眼 24 个品种的 SCoT 遗传多样性分析. 园艺学报，37 (10)：1651–1654.
Chen Xin-qi，Ji Zhan-he. 1997. The orchids of China. Beijing：Chinese Forestry Publishing House：70–100. (in Chinese)
陈心启，吉占和. 1997. 中国兰花全书. 北京：中国林业出版社：70–100.
Cheng Shao-li，Li Zhi-lin，Zhang Jun-xiang，Fan Cheng-ming，Zhao Ming-fu，He Yue-qiu. 2006. Similarity analyses of some species of Cymbidium
（Orchidaceae）from Yunnan Province using RAPD technique. Acta Botanica Yunnanica，28 (6)：565–569. (in Chinese)
程少丽，李枝林，张俊祥，范成明，赵明富，何月秋. 2006. 利用 RAPD 技术分析云南兰属部分种的种间关系. 云南植物研究，28 (6)：
565–569.
2032 园 艺 学 报 40 卷
Collard B C Y，Mackill D J. 2009. Start codon targeted（SCoT）polymorphism：A simple，novel DNA marker technique for generating gene-targeted
markers in plants. Plant Mol Biol Rep，27：86–93.
Cong Luo，He Xin-hua，Chen Hu，Hu Ying，Ou Shi-jin. 2012. Genetic relationship and diversity of Mangifera indica L.：Revealed through SCoT
analysis. Gene Resour Crop Evol，59：1505–1515.
Du Puy D，Cribb P J. 1998. The genus Cymbidium. Poregon：Timber Press.
Han Guo-hui，Xiang Su-qiong，Wang Wei-xing，Jia Zhi-gang，Hong Qi-bin，Liang Guo-lu. 2011. Establishment and application of SCoT molecular
marker system for citrus. Acta Horticulturae Sinica，38 (7)：1243–1250. (in Chinese)
韩国辉，向素琼，汪卫星，贾志刚，洪棋斌，梁国鲁. 2011. 柑橘 SCoT 分子标记技术体系的建立及其在遗传分析中的应用. 园艺学报，
38 (7)：1243–1250.
Ji Xiang-biao，Wang Guo-ding，Kang Ji-chuan，Qiao Guang，Wen Xiao-peng. 2008. A comparative study of RAPD and morphological approaches
to characterize the genetic relationships of the twelve species of Cymbidium in Guizhou. Seed，27 (2)：56–59. (in Chinese)
季祥彪，王国鼎，康继川，乔 光，文晓鹏. 2008. 贵州 12 种兰属植物资源形态学和 RAPD 标记的比较分析. 种子，27 (2)：56–59.
Liu Zhong-jian，Chen Xin-qi，Ru Zheng-zhong，Chen Li-jun. 2006. Chinese Cymbidum plants. Beijing：Science Press：1–20. (in Chinese)
刘仲健，陈心启，茹正忠，陈利君. 2006. 中国兰属植物. 北京：科学出版社：1–20.
Sun Cai-yun，Zhang Ming-yong，Ye Xiu-lin，Liang Cheng-ye，Xia Kuai-fei. 2005. Studies on relationship between species，cultivars of Cymbidium
using RAPD. Acta Horticulturae Sinica，32 (6)：1121–1124. (in Chinese)
孙彩云，张明永，叶秀粦，梁承邺，夏快飞. 2005. 中国兰属植物种间及品种间亲缘关系的 RAPD 分析. 园艺学报，32 (6)：1121–1124.
Wang Hui-zhong. 2009. Methods in molecular Biology：A laboratory course manual. Beijing：Chinese Agriculture Technology Press：1–4. (in Chinese)
王慧中. 2009. 分子生物学实验指南. 北京：中国农业科学技术出版社：1–4.
Wen Li，Ye Qing-sheng，Wang Xiao-jing，Pan Rui-chi. 2001. Analysis of relationship among Cymbidium cultivars using RAPD. Chinese Journal of
Applied and Environmental Biology，7 (1)：29–32. (in Chinese)
文 李，叶庆生，王小菁，潘瑞炽. 2001. 利用 RAPD 技术分析兰属品种间的亲缘关系. 应用与环境生物学报，7 (1)：29–32.
Wu Zhen-xing，Wang Hui-zhong，Shi Nong-nong，Zhao Yan. 2008. The genetic diversity of Cymbidium by ISSR. Hereditas，30 (5)：627–632. (in
Chinese)
吴振兴，王慧中，施农农，赵 艳. 2008. 兰属植物 ISSR 遗传多样性分析. 遗传，30 (5)：627–632.
Xiong Fa-qian，Jiang Jing，Zhong Rui-chun，Han Zhu-qiang，He Liang-qiong，Li Zhong，Zhuang Wei-jian，Tang Rong-hua. 2010. Application
of SCoT molecular marker in genus Arachis. Acta Agronomica Sinica，36 (12)：2055–2061. (in Chinese)
熊发前，蒋 菁，钟瑞春，韩柱强，贺梁琼，李 忠，庄伟建，唐荣华. 2010. 目标起始密码子多态性（SCoT）分子标记技术在花生
属中的应用. 作物学报，36 (12)：2055–2061.
Xiong Fa-qian，Tang Rong-hua，Chen Zhong-liang，Pan Ling-hua，Zhuang Wei-jian. 2009. SCoT：A novel gene targeted marker technique based
on the translation start codon. Molecular Plant Breeding，7 (3)：635–638. (in Chinese)
熊发前，唐荣华，陈忠良，潘玲华，庄伟建. 2009. 目标起始密码子多态性（SCoT）：一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术. 分
子植物育种，7 (3)：635–638.
Yang Guang-sui，Ren Yu，Wang Rong-xiang. 2011. Analysis of genetic relationship of wild Cymbidium in Hainan by using SRAP. Chinese Journal
of Tropical Agriculture，31 (9)：1–3. (in Chinese)
杨光穗，任 羽，王荣香. 2011. 利用 SRAP 技术分析海南野生兰属植物的亲缘关系. 热带农业学报，31 (9)：1–3.
Zhang Jun-xiang，Li Zhi-lin，Fan Cheng-ming，Cheng Shao-li，Zhao Ming-fu，He Qiu-yue. 2006. Phylogenetics analysis of the Chinese orchids in
Yunnan Province using AFLP technique，33 (5)：1141–1144. (in Chinese)
张俊祥，李枝林，范成明，程少丽，赵明富，何月秋. 2006. 云南野生兰属主要种间亲缘关系的 AFLP 分析. 园艺学报，33 (5)：1141–1144.
Zhang Jun-yu，Guo Da-long，Gong Ying，Liu Chong-huai，Li Meng，Zhang Guo-hai. 2011. Optimization of start codon targeted polymorphism PCR
（SCoT-PCR）system in Vitis vinifera. Journal of Fruit Science，28 (2)：209–214. (in Chinese)
张君玉，郭大龙，龚 莹，刘崇怀，李 猛，张国海. 2011. 葡萄目标起始密码子多态性反应体系的优化. 果树学报，28 (2)：209–214.
Zhou Yan-qing，Yang Qing-xiang，Zhang Gai-na. 2008. Genetic marker and application. Beijing：Chemical Industry Press：153–174. (in Chinese)
周延清，杨清香，张改娜. 2008. 生物遗传标记与应用. 北京：化学工业出版社：153–174.