全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（4）：721–728 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–12–16；修回日期：2012–03–29
基金项目：国家‘863’计划项目（2011AA100208）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（博导类）（20110008110021）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhaolj5073@sina.com）
切花菊‘神马’细胞分裂素合成酶基因 DgIPT3
参与侧枝发育的功能分析
于 静，董丽丽，郗 琳，赵瑞艳，马 男，赵梁军*
（中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193）
摘 要：利用 RACE 方法，从菊花（Chrysanthemum morifolium）‘神马’中分离得到细胞分裂素合
成异戊烯基转移酶基因的全长 cDNA 序列，命名为 DgIPT3，基因登录号为 JQ711176。序列分析结果表明，
DgIPT3 的 cDNA 全长为 1 171 bp，开放阅读框 ORF 编码 331 个氨基酸，具有 IPT 家族典型的 ATP/GTP
结合位点 MGATGTGKS。系统进化分析显示，DgIPT3 与毛果杨（Populus trichocarpa）的 PtXP02321061
亲缘关系最近。qRT-PCR 分析表明，DgIPT3 在菊花根、茎、叶中均有表达，其表达量为叶 > 茎 > 根。
瞬时转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）原生质体表明 DgIPT3 蛋白定位于细胞质中。过表达 DgIPT3 异源
转化野生型拟南芥，莲座侧枝明显增多，表明 DgIPT3 可能是参与菊花侧枝形成的关键基因。
关键词：菊花；切花菊；异戊烯基转移酶基因 IPT；亚细胞定位；组织特异性表达；过表达
中图分类号：S 682.1+1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）04-0721-08

Isolation and Characterization of Cytokinin Synthase Gene DgIPT3 in
Chrysanthemum‘Jinba’
YU Jing，DONG Li-li，XI Lin，ZHAO Rui-yan，MA Nan，and ZHAO Liang-jun*
（Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，China）
Abstract：Branching is a limiting factor in highly effective production of Chrysanthemum. It is
known that isopentenyl transferase is the key enzyme which catalyzes cytokinin biosythesis in plants.
Here，we isolated full length cDNA of DgIPT3，a gene encoding isopentenyl transferase in Chrysanthemum
using RACE. The DgIPT3 is 1 171 bp in length and its ORF encodes 331 amino acids. GenBank accession
No. JQ711176. Phylogenetic analysis showed that DgIPT3 had the highest similarity with PtXP02321061
from Populus trichocarpa. qRT-PCR indicated that expression level of DgIPT3 in leaves is much higher
than roots and stems，suggesting that expression pattern of DgIPT3 was organ-specific in Chrysanthemum.
The DgIPT3 protein was located in cytoplasm by transient expression of DgIPT3 in mesophyll protoplast
of Arabidopsis. Overexpression of DgIPT3 obviously increased the number of rosette branches in
Arabidopsis，indicating that DgIPT3 is probably the key gene involved in branching of Chrysanthemum.
Key words：Chrysanthemum；cut chrysanthemum；DgIPT3；isopentenyl transferases gene；subcellular
localization；organ-specific pattern；overexpression

722 园 艺 学 报 39 卷
植物侧枝发生主要受生长素（Auxin）、细胞分裂素（Cytokinin，CKs）和独脚金内酯（Strigolactone，
SL）3 类激素控制（Domagalska & Leyser，2011）。大量模式植物的研究旨在探讨 3 种激素在腋芽生
长过程中如何发挥作用以及如何相互影响。CKs 促进腋芽萌发，SL 及 Auxin 抑制腋芽萌发。由于
Auxin 不直接进入腋芽起作用，而 SL 及 CKs 能够直接进入腋芽并调控其萌发，因此认为 CKs 及 SL
可能作为 Auxin 的第二信使起作用（Brewer et al.，2009）。CKs 可诱导 Auxin 在植物幼嫩根、茎、
叶部位的合成（Jones et al.，2010）和运输（Kalousek et al.，2010），与 SL 拮抗影响腋芽萌发，并
共同作用于 TCP 转录因子 PsBRC1（Pisum sativum）（Dun et al.，2011）。此外，顶端优势中的 Auxin
可抑制茎节处 CKs 的合成。去顶后，CKs 会在茎节处大量合成，随后腋芽处 CKs 增高（Tanaka et
al.，2006），激活腋芽并产生侧枝（Müller & Leyser，2011)。因此，CKs 对侧枝发育有非常重要的
作用。
植物自身代谢产生的 CKs 主要分两种：类异戊二烯型和芳香型，前者在植物体内大量存在。常
见的类异戊二烯型 CKs 以△2–异戊烯基腺嘌呤 iP、反式玉米素 tZ、玉米素 cZ 和二氢玉米素 dZ
（Sakakibara，2006）4 种形式在植物体内存在。拟南芥类异戊二烯型 CKs 合成途径研究表明，无论
是 2–甲基–D–赤藓醇–4–磷酸 MEP 或甲瓦龙酸 MVA 途径，CKs 合成前体 DMAPP（二甲基丙
烯基二磷酸）都需要 IPT 异戊烯基转移酶催化，进而形成各类型 CKs（Takei et al.，2004a）。
异戊烯基转移酶基因 IPTs 是一个小的多基因家族，是 CKs 生物合成的限速酶基因。在拟南芥
中已鉴定到 9 个 IPT 基因（Miyawaki et al.，2004），水稻中发现 8 个 IPT 基因（Hirose et al.，2008），
并且每个 IPT 基因的表达类型彼此不同。AtIPT3 主要在植株的韧皮部表达（Aloni et al.，2005；Hirose
et al.，2008），是氮素依赖型 CKs 合成的关键因子（Takei et al.，2004b）。位于韧皮部的 AtIPT3 会
合成 CKs，并与茎节处积累的 CKs 一起激活受茎顶端控制的侧芽萌发（Aloni et al.，2005）。
目前，少侧枝或无侧枝切花菊品种极为缺乏，侧芽侧蕾发生严重的切花菊‘神马’依然是国际
市场上流行的单头切花菊品种，也是中国出口日本的最主要菊花品种之一。为保证成花品质，在生
长期需要及时将腋芽侧蕾抹除。抹芽除蕾的人工费用占切花生产成本的 1/3 左右。因此，研究菊花
侧枝发生机理，挖掘能够调控侧枝的基因具有非常重要的现实意义。
本研究中利用 RACE 的方法，分离得到切花菊‘神马’CKs 合酶基因 DgIPT3 的全长，利用
qRT-PCR 技术分析 DgIPT3 在菊花中的组织特异性表达。通过亚细胞定位和异源转化拟南芥的方法
初步研究 DgIPT3 基因参与侧枝发生的基本功能，探讨该基因如何参与菊花侧枝形成的分子机制，
为今后利用基因工程技术培育少侧枝切花菊新品种提供基因储备和理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
以切花菊‘神马’（Chrysanthemum morifolium‘Jinba’）为试材，扦插苗来源于中国农业大学科
学园。通过茎段再生获得组培苗，在 MS（Murashige & Skoog，1962）固体培养基上继代快繁，置
于人工培养室中培养。培养条件：温度（21 ± 2）℃，光周期 16 h 光照/ 8 h 黑暗，光照强度为 100 ~
120 µmol · m-2 · s-1（梁建丽，2010）。
1.2 方法
1.2.1 DgIPT3 的克隆
菊花总 RNA 的提取采用 Trizol 试剂（Invitrogen，下同），提取方法按使用说明进行。经过 DNaseⅠ
4 期 于 静等：切花菊‘神马’细胞分裂素合成酶基因 DgIPT3 参与侧枝发育的功能分析 723

（大连宝生物工程有限公司，下同）消化DNA后，使用SuperscriptⅡ reverse transcriptase （Invitrogen，
下同）反转录合成 cDNA 第 1 链。
根据 GenBank 上发表的拟南芥（Arabidopsis thaliana）、白菜（Brassica campestris）、百脉根（Lotus
japonicus）、甜菜（Malus hupehensis）IPT3 保守氨基酸和核苷酸序列，利用 Primer Premier 5 软件（下
同）设计简并引物 P0 和 P1（表 1），以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。扩增条件为：94 ℃预变性 5 min，
94 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 10 s，共 35 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。1%
琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段并连接到载体 p-EASY T1 simple（北京全式金生物技术有限
公司，下同），转化大肠杆菌 DH5α（北京全式金生物技术有限公司，下同），进行 Ampicillin 抗性
筛选及阳性克隆鉴定。DNA 测序（北京中科希林生物科技有限公司，下同），获得 DgIPT3 中间片
段。
利用 RACE 试剂盒（大连宝生物工程有限公司）得到 DgIPT3 基因的 3′ 与 5′ 序列。根据所得中
间片段的测序结果，设计 3′ 特异性引物 P2 和 P3（表 1），扩增得到 DgIPT3 的 3′ 端序列。设计 5′ 特
异性引物 P4、P5 和 P6（表 1），扩增得到 DgIPT3 的 5′ 端序列。利用 DNAMAN 6.0（下同）软件拼
接所得片段，分别在 5′ 端和 3′ 端非翻译区设计特异性引物 P7 和 P8（表 1），以 cDNA 第 1 链为模
板扩增含有 Open Reading Frame（ORF）的 cDNA 全长。
1.2.2 DgIPT3 系统发生分析
将 DgIPT3 基因的 ORF 编码的氨基酸序列在 GenBank 数据库中进行 BLAST 分析，将其与已发
表的拟南芥、毛果杨（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、葡萄（Vitis vinifera）、玉米（Zea
mays）、高粱（Sorghum bicolor）同源基因蛋白序列进行多重比对分析。
多重序列比对用 ClustalX 1.81（Thompson et al.，1997）软件，采用 MEGA 5.0 构建系统进化树
（Tamura et al.，2011），用自展法（Bootstrap）进行 1 000 次重复，数字表示不同节间的进化距离。
1.2.3 DgIPT3 亚细胞定位载体的构建
设计引物 sub1 和 sub2（表 1），在 DgIPT3ORF 的上、下游分别添加 XhoⅠ、SmaⅠ酶切位点。
将 pEZS-NL 载体与带酶切位点的 ORF 分别进行 XhoⅠ和 SmaⅠ双酶切，回收大片段，用 T4 DNA
连接酶（大连宝生物工程有限公司，下同）连接，从而得到 pEZS-DgIPT3-GFP 融合表达载体，转入
DH5α，PCR 筛选阳性克隆并测序验证。将测序正确的阳性克隆提取质粒并准备转化原生质体。
1.2.4 原生质体的制备与转化
按 Damm 和 Willmitzer（1988）的方法制备拟南芥（Col）叶肉细胞原生质体。利用 PEG 介导
法将 pEZS-NL 对照和 pEZS-DgIPT3-GFP 重组质粒转化入拟南芥原生质体，23 ℃黑暗条件下孵育
16 h。使用激光共聚焦显微镜（Nikon Confocal C1）观察融合蛋白表达情况。
1.2.5 菊花 DgIPT3 的组织表达分析
以菊花组培苗的根、茎、叶为材料，提取 RNA 并消化 DNA。利用 PrimeScript® RT reagent Kit
（Perfect Real Time）试剂盒（大连宝生物工程有限公司）反转录，参照使用说明进行。利用 TaKaRa
SYBR® Premix Ex Taq TMⅡ（Perfect Real Time）试剂盒（大连宝生物工程有限公司）进行定量 PCR，
参照使用说明选择 50 μL 反应体系，两步法 PCR 反应条件。每个处理重复 3 次。反应结束后分析溶
解曲线以及基因相对表达量。用于分析 DgIPT3 基因表达的特异性引物为：qRT1 和 qRT2；18S rRNA
（表 1）作为内参。
1.2.6 DgIPT3 过表达载体的构建及转化野生型拟南芥
设计引物 Tr1 和 Tr2（表 1），扩增上、下游分别带有 XbaⅠ、SacⅠ酶切位点的 DgIPT3ORF，
构建 pBI121-DgIPT3 融合过表达载体。转化构建正确的载体质粒和 pBI121 空载质粒到农杆菌
（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 中，花序浸蘸法转化 Columbia 野生型拟南芥（Clough & Bent，
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1998）。用含 50 mg · L-1 卡那霉素（kanamycin）的 MS 培养基筛选转化子，将筛选到的 T2 代转基因
株系进行表型分析。移栽阳性株系 30 d 后，提取对照和 T2 代阳性植株莲座叶的 RNA，反转录合成
cDNA 第 1 链。以 P0 和载体 pBI-R 为引物，Actin2（表 1）作为内参，检测 DgIPT3 的表达量。同时，
统计转基因株系和对照高于 0.5 cm 的莲座侧枝数量，利用 SPSS 软件统计分析。

表 1 引物名称及对应序列
Table 1 Primer names and corresponding sequences
引物名称
Primer name
对应序列
Corresponding sequence
P0 5′-GACATHGTCACCAACAARATCAC-3′
P1 5′-CCACGCCDCGTCAGCMTCCDCCT-3′
P2 5′-ATTTCGTTAGCACGGCTTCTCTTAC-3′
P3 5′-ATCAAGATACGACTGTTGCTTCCTA-3′
P4 5′-TGATCATCAATTAATGCTTC-3′
P5 5′-AACTTCTTCAACAATACCTG-3′
P6 5′-ATTTCATCGTAAGAGAAGCCGTG-3′
P7 5′-TCAAGTTGCCACATAAGAATA-3′
P8 5′-ACTACCATTCTCTTATTCGCACA-3′
Sub1 5′-TTTGGAGAGGACACG CTCGAG ATGAAAATGACTATGATCGG-3′
Sub2 5′-CGGCAGCAGCCGGAT CCCGGG CAAGAGCGGCAGCAACCA-3′
qRT1 5′-TAAAGTAGTAGTCGTTATGGGTGCT-3′
qRT2 5′-CATCGTAAGAGAAGCCGTGC-3′
Tr1 5′-ACGGGGGAC TCTAGA ATGAAAATGACTATGATCGG-3′
Tr2 5′-GGGAAATTC GAGCTC CTAAAGAGCGGCAGCAACCA-3′
18S-F 5′-CTCATGGGATGTGGCTTCTT-3′
18S-R 5′-GCGTTCAAAAACTCGATGGT-3′
pBI-R 5′-TTATTGCCAAATGTTTGAACG-3′
Actin2-F 5′-TGTTCCCAAGTATTGTTGGTCGTC-3′
Actin2-R 5′-GCTGAGGGATGCAAGGATTGATC-3′
2 结果与分析
2.1 菊花 DgIPT3 基因全长的获得
利用 RACE 的方法，从菊花中分离得到 DgIPT3 基因全长，结构示意如图 1 所示。该基因 cDNA
全长为 1 171 bp，包括 5′UTR 96 bp，ORF 996 bp 和 3′UTR 79 bp，起始密码为 ATG，终止密码为 TAG，
共编码 331 个氨基酸（图 2），具有 IPT 家族典型的 ATP/GTP 结合位点 MGATGTGKS（图 1，图
2）。利用蛋白质理化性质预测软件（http：//web. expasy. org/protparam/）对该蛋白加以分析，得到
蛋白质等电点为 8.70，分子量为 37.05 kD。多重比对分析（图 3）表明 DgIPT3 蛋白在 N–端和 C–
端与其他植物 IPT3 具有较高的同源性。







图 1 菊花 DgIPT3 基因结构示意图
Fig. 1 Schematic structure of DgIPT3
4 期 于 静等：切花菊‘神马’细胞分裂素合成酶基因 DgIPT3 参与侧枝发育的功能分析 725

图 2 菊花 DgIPT3 基因的 ORF 及其编码的氨基酸
Fig. 2 ORF and putative amino acid sequences of DgIPT3


图 3 DgIPT3 氨基酸同其他物种 IPT3 氨基酸序列比对
Fig. 3 Alignment of the putative amino acid sequence of DgIPT3 with IPT from other species
2.2 DgIPT3 系统发生分析
将 DgIPT3 的氨基酸序列与 GenBank 上 IPT 同源蛋白序列 AtIPT1-9（拟南芥）、SbIPT（高粱，
XP002459547）、ZmIPT（玉米，001121195）、OsIPT（水稻，NP001051662）、VvIPT（葡萄，XP002271962）、
PtIPT（毛果杨，XP002321061）进行多重比对，结果显示 DgIPT3 与毛果杨的亲缘关系最近。
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图 5 DgIPT3 在菊花不同组织中的表达
Fig. 5 DgIPT3 gene expression pattern in different
tissues of Chrysanthemum
图 6 野生型拟南芥、空载与 35S::DgIPT3 转基因植
株（a ~ c）的侧枝表型及表达量
Fig. 6 Comparison of phenotypes of Arabidopsis thaliana wild
type，vector，and wild type transformed with 35S::DgIPT3
2.3 DgIPT3 蛋白亚细胞定位
利用 PEG 介导法，将融合表达载体 pEZS-DgIPT3-GFP 和对照 pEZS-NL 分别转入拟南芥叶肉细
胞原生质体。经过 16 h 暗培养，使用激光共聚焦显微镜观测。488 nm 蓝光激发下，对照的 GFP 蛋
白均匀分布在原生质体的细胞膜、细胞核和细胞质中，而融合蛋白仅分布在细胞质中（图 4）。结果
显示，DgIPT3 有胞质定位功能。

图 4 DgIPT3 蛋白在拟南芥叶肉细胞原生质体中的瞬时表达
1 ~ 3：对照；4 ~ 6：融合蛋白。1，4：明场观察的细胞形态；2，5：GFP 荧光表达情况；3：1 和 2 重叠；6：4 和 5 重叠。
Fig. 4 The transient expression of DgIPT3 in the mesophyll cells protoplast of Arabidopsis thaliana
1–3：Control；4–6：Fusion protein. 1，4：Observation of cell morphology with bright field；2，5：GFP fluorescence expression；
3：Merge 1 and 2；6：Merge 4 and 5.
2.4 菊花‘神马’DgIPT3 组织特异性表达
如图 5 所示，DgIPT3 在‘神马’的根、茎、叶都有表达，但表达量不同，叶中相对表达量最
高，茎中次之，根中最低，且叶的 DgIPT3 表达量比根高出 68 倍，比茎高出 11 倍。


4 期 于 静等：切花菊‘神马’细胞分裂素合成酶基因 DgIPT3 参与侧枝发育的功能分析 727

2.5 DgIPT3 过表达拟南芥的表型分析
经 RT-PCR 检测，共获得 18 个 T2 代纯合转基因株系。从中选择 3 个表达量不同的株系进行表
型观测，结果表明，野生型、空载、转基因株系的平均侧枝数分别为 2.0、2.3、4.8，转基因株系侧
枝明显增多，并且转基因株系 DgIPT3 基因表达量高的植株，侧枝数增多更加显著（图 6）。
3 讨论
目前，对于侧枝发育问题的研究多集中于 Auxin、CKs 和 Strigolactone 以及三者之间的相互作
用。CKs 是被熟知的可影响植物侧枝的激素，但是 CKs 究竟如何发挥作用目前还不清楚（Foo et al.，
2007）。
本研究中从菊花中克隆到 DgIPT3 基因。经过氨基酸同源性分析及系统发育比较发现，DgIPT3
具有 IPT 家族保守的 ATP/GTP 结合域，并与 VvIPT（XP002271962）、PtIPT（XP002321061）、AtIPT3
有较高同源性。
DgIPT3 蛋白定位于细胞质中，与 AtIPT3、MdIPT5a（苹果 Malus domestica Borkh.）、MhIPT3
蛋白的定位情况一致。AtIPT 定位于质体或者细胞质中，催化 CKs 的合成。但是，AtIPT3 是法尼酰
基转移酶蛋白的底物，被法尼酰化后其蛋白定位于细胞核或细胞质中，未被法尼酰化的蛋白仍定位
在质体中（Galichet et al.，2008）。MdIPT5a 洋葱表皮细胞和拟南芥原生质体的亚细胞定位研究，推
测 MdIPT5a 可能定位在细胞质内的线粒体中，因为其绿色荧光与叶绿体自发红色荧光并不重合，断
定其不存在于叶绿体中（李皓 等，2011）。因此，需要更进一步的试验来证明 DgIPT3 蛋白在细胞
质中的精确定位。
qRT-PCR 结果表明，DgIPT3 在菊花根、茎、叶 3 个器官中均有表达，其表达量在叶中最高，
茎中次之，根中最低。CKs 不仅是在根中合成，在整个植株叶片、顶端分生组织、未成熟种子中都
有合成（Mok & Mok，1994）。AtIPT3 基因在拟南芥的根、茎、莲座叶、茎生叶的韧皮部均有表达
（Miyawaki et al.，2004）。大量研究表明，IPT 基因的表达与植株的营养状态有关。其中，AtIPT3
基因是响应氮素合成细胞分裂素的关键基因（Takei et al.，2004b）。根中 AtIPT3 基因的表达量与根
部硝态氮的吸收量相关。据此推测，植株的营养吸收状态决定根中和叶中 DgIPT3 基因相对表达量
的高低。另外，参与茎侧枝调控的 CKs 主要是茎节处局部合成的，而 Auxin 会抑制茎中 CKs 的合
成（Foo et al.，2007），降低 IPT 基因的表达量。因此，在菊花顶芽存在的情况下，内源 IAA 的旺
盛合成与向基运输，DgIPT3 在茎中的表达量可能会下降。
DgIPT3 过表达野生型拟南芥的莲座侧枝明显增多，并且 DgIPT3 表达量高的株系侧枝增多显著。
今后可利用 DgIPT3 来异源转化拟南芥 ipt3 突变体，观察转化株的恢复表型并进一步验证 DgIPT3
与侧枝发生的关系，确定其是否为侧枝发生的关键基因。
侧枝发育是植株地上部形态建成的关键，CKs 是促进侧枝发育的激素之一。但是，CKs 如何在
侧枝发育中发挥作用，其远程信号与局部信号如何协调以及 CKs 如何与其他激素相互作用，目前尚
不明确。由于菊花侧枝严重制约切花生产，因此以菊花为材料揭示侧枝发生与激素的关系，明确激
素调控网络尤为重要。

References
Aloni R，Langhans M，Aloni E，Dreieicher E，Ullrich C I. 2005. Root-synthesized cytokinin in Arabidopsis is distributed in the shoot by the
transpiration stream. Journal of Experimental Botany，56 (416)：1535–1544.
Brewer P B，Dun E A，Ferguson B J，Rameau C，Beveridge C A. 2009. Strigolactone acts downstream of auxin to regulate bud outgrowth in pea and
728 园 艺 学 报 39 卷
Arabidopsis. Plant Physiology，150 (1)：482–493.
Clough S J，Bent A F. 1998. Floral dip：A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal，
16 (6)：735–743.
Damm B，Willmitzer L. 1988. Regeneration of fertile plants from protoplasts of different Arabidopsis thaliana genotypes. Molecular and General
Genetics，213 (1)：15–20.
Domagalska M A，Leyser O. 2011. Signal integration in the control of shoot branching. Nature Reviews Molecular Cell Biology，12：211–221.
Dun E A，Germain A S，Rameau C，Beveridge C A. 2011. Antagonistic action of strigolactone and cytokinin in bud outgrowth control. Plant
Physiology，158 (1)：487–498.
Foo E，Morris S E，Parmenter K，Young N，Wang H，Jones A，Rameau C，Turnbull C G N，Beveridge C A. 2007. Feedback regulation of xylem
cytokinin content is conserved in pea and Arabidopsis. Plant Physiology，143 (3)：1418–1428.
Galichet A，Hoyerova K，Kaminek M，Gruissem W. 2008. Farnesylation directs AtIPT3 subcellular localization and modulates cytokinin biosynthesis
in Arabidopsis. Plant Physiology，146 (3)：1155–1164.
Hirose N，Takei K，Kuroha T，Kamada-Nobusada T，Hayashi H，Sakakibara H. 2008. Regulation of cytokinin biosynthesis，compartmentalization
and translocation. Journal of Experimental Botany，59 (1)：75–83.
Jones B，Gunneras S A，Petersson S V，Tarkowski P，Graham N，May S，Dolezal K，Sandberg G，Ljung K. 2010. Cytokinin regulation of auxin
synthesis in Arabidopsis involves a homeostatic feedback loop regulated via auxin and cytokinin signal transduction. The Plant Cell，22 (9)：2956
–2969.
Kalousek P，Buchtova D，Balla J，Reinoehl V，Prochazka S. 2010. Cytokinins and polar transport of auxin in axillary pea buds. Acta Universitatis
Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis，58 (4)：79–87.
Li Hao，Zhang Wen，Zhao Xu-mian，Ren Xue-qin，Zhu Yuan-di. 2011. Molecular cloning of isopentenyl transferases genes family in Malus
domestica Borkh. and a preliminary functional analysis of MdIPT5a. Scientia Agricultura Sinica，44 (19)：4029–4036. (in Chinese)
李 皓，张 文，赵旭勉，任雪芹，朱元娣. 2011. 苹果异戊烯基转移酶基因家族（MdIPTs）的克隆与 MdIPT5a 功能分析. 中国农业科
学，44 (19)：4029–4036.
Liang Jian-li. 2010. Isolation and chracterization of DgCCD8 genes and its promoter from Chrysanthemum[Ph. D. Dissertation]. Beijing：China
Agricultural University. (in Chinese)
梁建丽. 2010. 菊花 DgCCD8 基因及其启动子的克隆和功能分析[博士论文]. 北京：中国农业大学.
Miyawaki K，Matsumoto-Kitano M，Kakimoto T. 2004. Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis：Tissue
specificity and regulation by auxin，cytokinin，and nitrate. The Plant Journal，37 (1)：128–138.
Mok D W S，Mok M C. 1994. Cytokinins：Chemistry，activity and function. Boca Raton：CRC Press.
Murashige T，Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum，15：473–497.
Müller D，Leyser O. 2011. Auxin，cytokinin and the control of shoot branching. Annuals of Botany，107 (7)：1203–1212.
Sakakibara H. 2006. Cytokinins：Activity，biosynthesis，and translocation. Annual Review of Plant Biology，57：431–449.
Takei K，Ueda N，Aoki K，Kuromori T，Hirayama T，Shinozaki K，Yamaya T，Sakakibara H. 2004b. AtIPT3 is a key determinant of nitrate-dependent
cytokinin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell Physiol，45 (8)：1053–1062.
Takei K，Yamaya T，Sakakibara H. 2004a. Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of
trans-zeatin. Journal of Biological Chemistry，279：41866–41872.
Tamura K，Peterson D，Peterson N，Stecher G，Nei M，Kumar S. 2011. MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum
likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution，28：2731–2739.
Tanaka M，Takei K，Kojima M，Sakakibara H，Mori H. 2006. Auxin controls local cytokinin biosynthesis in the nodal stem in apical dominance. The
Plant Journal，45 (6)：1028–1036.
Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，Jeanmougin F，Higgins D G. 1997. The ClustalX windows interface：Flexible strategies for multiple
sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research，24：4876–4882.