全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（11）：2115–2126 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–04–10；修回日期：2013–09–16
基金项目：国家自然科学基金重点项目（91125028）；中国博士后基金项目（20090461150）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yhsu@issas.ac.cn；Tel：025-86881529）
豆梨铵转运蛋白基因PcAMT1-1和PcAMT1-2的
克隆与功能鉴定
丛 郁，杨顺瑛，金 曼，郝东利，苏彦华*
（中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室，南京 210008）
摘 要：为探明豆梨（Pyrus calleryana Dcne.）铵转运蛋白基因家族成员的序列特征、生理功能和表
达特点，以豆梨幼苗为材料，运用电子克隆与 3′-RACE 技术获得 2 个铵转运蛋白基因 PcAMT1-1 和
PcAMT1-2，采用酵母互补和半定量 RT-PCR 方法研究它们的生理功能与表达特点。结果表明：PcAMT1-1
和 PcAMT1-2 开放阅读框为 1 518 bp 和 1 515 bp，编码的蛋白分别含 505 和 504 个氨基酸残基。PcAMT1-1
和 PcAMT1-2 分别与甜橙 × 枳后代 CpAMT（ABI52423）和茶 CsAMT1;2（AB114913）的同源性最高
（81.96%和 78.31%）。PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 转入酵母均能使铵转运体缺失突变菌株 31019b 恢复 NH4+
吸收能力，在酸性条件下（pH 4.8 或 5.8）PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 对 31019b 的互补效果均优于中性条件
（pH 6.8）。NH4+有毒类似物 MeA+可以显著抑制转 PcAMT1-1 酵母 31019b 的生长，该物质对转 PcAMT1-2
酵母 31019b 无抑制效果；谷氨酰胺合成酶抑制剂 MSX 可有效抑制 PcAMT1-2 对酵母 31019b 的互补效果，
对 PcAMT1-1 的互补效果无显著影响。正常供铵，PcAMT1-1 主要在叶中表达，PcAMT1-2 主要在根中表
达；无氮处理后，PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 在根中的表达先上调后下降；重新供铵后，它们的表达量恢复；
地上部的表达对上述处理无显著响应。综上所述，PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 在豆梨中具有吸收或转运 NH4+
的功能，并可能具备不同的调控机制。
关键词：豆梨；铵转运蛋白基因；克隆；表达特点；功能互补
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）11-2115-12

Molecular Cloning and Function Analyses of Two Ammonium Transporter
Protein Genes from Pyrus calleryana
CONG Yu，YANG Shun-ying，JIN Man，HAO Dong-li，and SU Yan-hua*
（State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture，Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing
210008，China）
Abstract：The objective of this study was to illuminate sequence feature，physiological function and
expression characteristic of PcAMT1-1 and PcAMT1-2 from ammonium transport protein gene family in
bean pear（Pyrus calleryana Dcne.）. The cDNA sequences of PcAMT1-1 and PcAMT1-2 were cloned from
bean pear seedlings by EST splicing and rapid amplification of cDNA ends（RACE）methods. The yeast
complementation was adapted to preliminary study PcAMT1-1 and PcAMT1-2 physiological functions.

2116 园 艺 学 报 40 卷
Furthermore，their expression patterns were analyzed by semi-quantitative RT-PCR under different
ammonium concentrations. The results showed that PcAMT1-1 cDNA had an open reading frame of 1 518
nucleotides encoding a polypeptide with 505 residues，while PcAMT1-2 cDNA had an opening reading
frame of 1 515 nucleotides encoding a polypeptide with 504 residues. The deduced proteins of PcAMT1-1
and PcAMT1-2 had higher homologies（81.96% and 78.31%）with Citrus sinensis × Citrus trifoliata
CpAMT（ABI52423）and Camellia sinensis CsAMT1;2（AB114913），respectively. Both PcAMT1-1 and
PcAMT1-2 were able to complement the growth defect of yeast（Saccharomyces cerevisiae）ammonium
transport mutant strain 31019b. Furthermore，the complementary effect under acid condition（pH 4.8 or
5.8）was slightly better than neutral condition（pH 6.8）. The presence of toxic NH4+ analog methylamine
（MeA+）markedly inhibited the growth of yeast with PcAMT1-1，whereas yeast cells transformed with
PcAMT1-2 can grow normally. L-methionine sulfoximine（MSX），the glutamine synthetase inhibitors，
could effectively inhibit PcAMT1-2 complementary. However，it had no significant effect on PcAMT1-1.
Under the normal NH4+ concentration condition，transcription of PcAMT1-1 was mainly in the leaves and
PcAMT1-2 expressed mainly in the root. When NH4+ was depleted，PcAMT1-1 and PcAMT1-2 expression
levels in roots increased firstly and then decreased. Moreover，their expression levels were recovered upon
NH4+ resupply. However，their expression levels in shoots were not observably changed when the NH4+
concentration was changed. Taken together，both PcAMT1-1 and PcAMT1-2 play the roles in absorption or
translocate NH4+ in bean pear，which maybe have different regulatory mechanisms.
Key words：Pyrus calleryana；ammonium transport protein gene；cloning；expression feature；
functional complementation

铵态氮是植物体内氮代谢的核心，它可直接被同化为各种氨基酸，最终合成蛋白质（Lothier et
al.，2011）。植物生长发育所需的铵态氮主要由根系从土壤中吸收获得（Kaiser et al.，2002），此外，
植株对硝酸盐和亚硝酸盐的还原以及内源氨基化合物的分解代谢也是铵态氮的来源（Suárez et al.，
2002；Taira et al.，2004）。
铵转运蛋白（Ammonium transporter protein，AMT）通过与其偶联的 H+-ATPase 所提供的细胞
质膜内外化学渗透势梯度来介导植株对铵态氮的吸收及体内转运（Loqué & von Wirén，2004）。
Ninnemann 等（1994）通过酵母功能互补从拟南芥中鉴定第 1 个植物来源的 AMT 基因。迄今为止，
关于该类基因结构与功能的报道大多以一年生草本植物番茄（Ludewig et al.，2002）、百脉根
（Salvemini et al.，2001；D’Apuzzoet al.，2004）和水稻（Sonoda et al.，2003）等为研究材料。多
年生长的特性使木本植物具有与草本植物截然不同的氮素吸收转运特点，它们的 AMT 同源基因调
控方式与生理功能亦有所差别（Selle et al.，2005；Couturier et al.，2007），因此，从木本植物中分
离并鉴定新的 AMT 同源基因仍有重要意义。
豆梨（Pyrus calleryana Dcne.）为梨生产上常用砧木，分离并解析其 AMT 同源基因的功能，有
利于进一步揭示 AMT 所介导的铵吸收转运过程。
本试验中分离获得豆梨 AMT 基因家族的两个成员 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2，通过酵母互补试验，
初步研究它们的生理功能，并采用半定量 RT-PCR 分析其表达特点，以期为揭示豆梨铵吸收转运的
分子机制提供依据。
11 期 丛 郁等：豆梨铵转运蛋白基因 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的克隆与功能鉴定 2117

1 材料与方法
1.1 材料
2009 年 11 月于浙江省嵊州市长乐镇（E120.58，N30.01）收集豆梨单株成熟种子。层积及培养
条件参考李慧等（2010）的方法。选择大小一致、生长健壮的 6 叶幼苗移至无氮改良 1/4MS 营养液
（以 4.7 mmol · L-1 KCl 代替 4.7 mmol · L-1 KNO3，并去除 NH4NO3）培养 3 d，转至含有 10 mmol · L-1
NH4Cl 的无氮改良 1/4MS 营养液处理 2 h，分别收集植株根、茎、叶，保存于–70 ℃冰箱待用。以
上所有试验处理均每次 5 株，3 次重复。
酵母铵缺失突变体菌株 31019b（mep1Δ，mep2Δ：：LEU2，mep3Δ：：KanMX2 ura3）由德国 Hohenheim
大学 von Wirén 教授惠赠，当 NH4+作为唯一 N 源，培养基中其浓度低于 5 mmol · L-1 时该酵母突变
体不能正常生长。酵母表达载体 pYES2 购于 Invitrogen 公司，YNB 培养基购于 Difco 公司，半乳糖、
精氨酸、氯化铵、L–蛋氨酸亚砜亚胺（L-methionine sulfoximine，MSX）和甲基胺（Methylamine，
MeA+）购于 Sigma 公司，RNA plant plus Reagent 和 Plant Genomic DNA Kit 购自天根生化科技（北
京）有限公司，M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 和 DNA marker 购自宝生物工程（大连）有限公司，
T4 DNA 连接酶、限制性核酸内切酶 KpnⅠ和 XbaⅠ购于 New England Biolabs 公司，引物由上海英
骏生物技术有限公司合成。
1.2 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 基因的扩增
豆梨幼苗总 RNA 用 RNA plant plus Reagent 提取，M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 合成单链
cDNA，用拟南芥 AtAMT1;1 基因氨基酸序列（CAA53473）检索 NCBI 苹果 EST 数据库，获得相关
片段 DT043026 和 DT002136，分别设计引物 PcAMT1-1-EST-F（5′-TCGAATTCCGTTGCTGTCGA
G-3′）/PcAMT1-1-EST-R（5′-GCGATGCCTCCGACCATATG-3′）和 PcAMT1-2-EST-F（5′-CGAATTC
CGTTGCTGTCGCG-3′）/PcAMT1-2-EST-R（5′-TCAGCGGACCAAAACCAATG-3′）扩增 5′端起始
片段。以 3′-AP[5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAAC(T)17-3′]为反转录引物合成单链 cDNA，
PcAMT1-1-GSP-F（5′-CGTCGCCTACCTCATTTACTCCTCC-3′）/PcAMT1-1-NGSP-F（5′-CGCTTCT
CTCGTCGTTCTGG-3′）和 PcAMT1-2-GSP-F（5′-CGACAACACTTACCTCCTCTTCTCCGCC-3′）/
PcAMT1-2-NGSP-F（5′-CCCTCTCCTATTACCTCTTCGGCTTTGC-3′），分别与 3′-AUAP（5′-GGCCA
CGCGTCGACTAGTAC-3′）配对进行 3′-RACE 的第一轮和第二轮扩增，PCR 扩增体系及条件参照
M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 说明书。利用 CAP3（http：//pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php）拼接 5′
端起始片段和 3′-RACE 测序结果，获得 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 基因 cDNA 序列。豆梨幼苗总 DNA
用 Plant Genomic DNA Kit 提取，以 PcAMT1-1-ORF-F（5′-ATGGCCACTCTGACCTGCACAG-3′）/
PcAMT1-1-ORF-R（5′-TTATGCAGGACTGGCATCATTAAC-3）和 PcAMT1-2-ORF-F（5-ATGGCG
ACCTGGGCAACACT-3′） /PcAMT1-2-ORF-R（5′-CACAGAAGTCGGCGGCGTGGAAG-3′）扩增
cDNA 开放阅读框（Open reading frame，ORF）及其对应的 DNA 序列。PCR 产物经连接、转化 DH5α
后，阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.3 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 基因的生物信息学分析
PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 基因核苷酸翻译采用 BioXM2.6（黄骥和张红生，2004），氨基酸序列
比对采用 DNAMAN6.0，MEGA5.0 构建系统进化树。InterProScan Sequence Search（http：//www.ebi.ac.
uk/Tools/pfa/iprscan/）分析蛋白家族特征结构，Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）
2118 园 艺 学 报 40 卷
分析蛋白功能结构（Sigrist et al.，2010），TM predict 分析蛋白序列跨膜区（Hofmann & Stoffel，1993）。
1.4 重组酵母工程菌的制备及功能互补
通过 PCR 的方法，将 KpnⅠ和 XbaⅠ酶切位点引入 PcAMT1-1 或 PcAMT1-2 ORF 的两端，并将
它们分别构建到酵母表达载体 pYES2 中，获得重组质粒 pYES2-PcAMT1-1 和 pYES2-PcAMT1-2，
保存于–20 ℃待用。采用电转化仪 Micro Pulser（Bio-Rad 公司）将 pYES2-PcAMT1-1 或 pYES2-
PcAMT1-2 转入酵母铵转运体缺失突变菌株 31019b 感受态细胞，电击后加入 1 mL 预冷的 1 mol · L-1
山梨醇，30 ℃度温育 2 h，于酵母选择培养基（0.17% YNB W/O 氨基酸和硫酸铵 + 2 mmol · L-1 精
氨酸 + 2%半乳糖）平板上 30 ℃黑暗培养 3 d，单菌落在酵母液体选择培养基中 30 ℃震荡培养 36 h，
经 PCR 鉴定为阳性的单菌落即为重组酵母。重组酵母菌株在 YNB 液体选择培养基上培养至 OD600 =
1.0，经 10 倍梯度稀释后分别取 5 μL 点样于不同处理的 YNB 固体培养基上，于 30 ℃黑暗培养 72 h，
观察菌落生长状况并照相。所有处理均以转空载体 pYES2 的 31019b 酵母为对照。
1.5 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 基因的表达研究
以 1 µg 豆梨幼苗不同处理根、茎或叶的总 RNA 为模板，采用 M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit
合成单链 cDNA。用 PcAMT1-1-SEMI-F（5-CTGTTTGCGAGGGAGAAGTAC-3）/PcAMT1-1-SEMI-R
（5-AATCACGCTCGGCTTCTGCT-3）扩增 PcAMT1-1 基因，用 PcAMT1-2-SEMI-F（5-TCTGTTGG
GTGGTTTTGCCG-3）/PcAMT1-2-SEMI-R（5-GGCTCAACCCTCCTCATCAT-3）扩增 PcAMT1-2
基因。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28 个循环；72 ℃ 5 min。
用 PcActin-F（5-GGAATGGTCAAGGCTGGGTT-3）/PcActin-R（5-CAAAGCATCTGTGAGGTCAC
G-3）扩增 Actin 基因作为内参基因，在相同条件下进行半定量 RT-PCR，分析不同供铵水平下
PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的表达情况。
2 结果与分析
2.1 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的获得与序列分析
以豆梨幼苗 cDNA 为模板，采用 PcAMT1-1-EST-F/PcAMT1-1-EST-R 和 PcAMT1-2-EST-F/
PcAMT1-2-EST-R 为引物进行 PCR 扩增，分别获得长度为 880 bp（图 1，A）和 604 bp（图 1，B）
的 5′端起始序列。采用 3′-RACE 获得它们的 3′端序列（图 1，C、D），用 CAP3 拼接 5′端起始序列
与 3′端序列，得到 1 825 bp 和 1 811 bp 的两条序列，命名为 PcAMT1-1（GenBank 登录号：JQ396251）
和 PcAMT-1-2（GenBank 登录号：JQ396252）。用 PcAMT1-1-ORF-F/PcAMT1-1-ORF-R 和 PcAMT1-2-
ORF-F/PcAMT1-2-ORF-R 扩增 cDNA ORF（图 1，E、F），测序结果与拼接序列的 ORF 完全一致。
同时，采用上述引物扩增豆梨基因组 DNA，所获 PCR 产物与 cDNA 序列的 ORF 相同，表明 PcAMT1-1
和 PcAMT1-2 基因 ORF 均不含内含子。
PcAMT1-1 ORF 为 1 518 bp，编码蛋白含 505 个氨基酸；PcAMT1-2 ORF 为 1 515 bp，编码蛋白
含504个氨基酸。PcAMT1-1和PcAMT1-2编码氨基酸序列中DFAGSGVVHMVGGIAGLWGAFIEGPR
（图 2）和 DFAGSGVVHMVGGIAGLWGAVIESPR（图 3）均符合 AMT 蛋白家族特征结构
D-[FYWS]-[AS]-G-[GSC]-x(2)-[IV]-x(3)-[SAG](2)-x(2)-[SAG]-[LIVM-F]-x(3)-[LIV-MFYWA]
(2)-x-[GK]-x-R（Ninnemann et al.，1994），表明 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 为植物铵转运蛋白家族成
员。

11 期 丛 郁等：豆梨铵转运蛋白基因 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的克隆与功能鉴定 2119

图 1 豆梨 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 基因的 PCR 扩增结果
M 为 DL2000 DNA marker；A、C 和 E 分别为 PcAMT1-1 5′端起始序列、3′-RACE 和 ORF 扩增产物；
B、D 和 F 分别为 PcAMT1-2 5′端起始序列、3′-RACE 和 ORF 扩增产物。
Fig. 1 The PCR amplification results of PcAMT1-1 and PcAMT1-2 from bean pear
M：DL2000 DNA marker. A，C and E were 5 sequence amplification product，3′-RACE product and ORF product of PcAMT1-1，respectively.
B，D and F were 5 sequence amplification product，3′-RACE product and ORF product of PcAMT1-2，respectively.

2.2 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的生物信息学分析
PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 蛋白均具有 11 个跨膜域，它们的 N 端和 C 端分别位于膜外侧和内侧
（图 2，图 3）。PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的 N–糖基化、酪蛋白激酶磷酸化和蛋白激酶 C 磷酸化位
点的数量均不相同：PcAMT1-1 含有 3 个 N–糖基化位点，1 个酪蛋白激酶磷酸化位点和 3 个蛋白
激酶 C 磷酸化位点；而 PcAMT1-2 的 N–糖基化位点仅为 1 个，酪蛋白激酶磷酸化位点却有 3 个，
蛋白激酶 C 磷酸化位点多达 9 个（图 2，图 3）。
PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 编码氨基酸与木本植物 AMT 之间有较高同源性（表 1），其中 PcAMT1-1
与甜橙 × 枳杂交后代 CpAMT1 相似度最高（81.96%），PcAMT1-2 与茶 CsAMT1;2 的相似度最高
（78.31%）。

表 1 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 与木本植物 AMT 的同源性比对
Table 1 Homology analysis of PcAMT1-1 and PcAMT1-2 with several AMT proteins from woody plants
相似度/ % Identities 物种
Specie
登录号
Accession
说明
Description PcAMT1-1 PcAMT1-2
柑橘 Citrus sinensis × Poncirus trifoliata DQ887678 CitAMT1 81.96 75.10
AB117640 CsAMT1;1 76.71 72.41 茶 Camellia sinensis
AB114913 CsAMT1;2 75.82 78.31
XM_002314482 PtrAMT1;1 80.08 74.90
XM_002325754 PtrAMT1;2 73.95 77.78
XM_002311667 PtrAMT1;3 78.93 74.71
XM_002303068 PtrAMT1;4 73.18 73.95
XM_002301801 PtrAMT1;5 71.07 72.41
杨树 Populus trichocarpa
XM_002314070 PtrAMT1;6 56.90 58.43
XM_002285522 Hypothetical protein 79.23 74.23
XM_002266540 Hypothetical protein 72.31 78.27 葡萄 Vitis vinifera
XM_002278459 Hypothetical protein 58.85 60.58
豆梨 Pyrus calleryana JQ396251 PcAMT1-1 100.00 76.47
JQ396252 PcAMT1-2 76.47 100.00
2120 园 艺 学 报 40 卷


图 2 PcAMT1-1 基因的 cDNA 序列及编码氨基酸
双下划线：N–糖基化位点；虚线：酪蛋白激酶磷酸化位点；方框：蛋白激酶 C 磷酸化位点；单下划线：跨膜域；
TM1 ~ TM11：跨膜域序号；灰色底纹：铵转运蛋白特征序列。
Fig. 2 Nucleotide sequences and their translated amino acid sequences of PcAMT1-1
Double underline：N-glycosylation site；Dashed：Tyrosine kinase phosphorylation site；Pane：Protein kinase C phosphorylation site；
Single underline：Trans-membrane domain；TM1–TM11：Serial number of trans-membrane domain；
Grey shading：Ammonium transporters signature.

11 期 丛 郁等：豆梨铵转运蛋白基因 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的克隆与功能鉴定 2121


图 3 PcAMT1-2 基因的 cDNA 序列及编码氨基酸
双下划线：N–糖基化位点；虚线：酪蛋白激酶磷酸化位点；方框：蛋白激酶 C 磷酸化位点；单下划线：跨膜域；
TM1 ~ TM11：跨膜域序号；灰色底纹：铵转运蛋白特征序列。
Fig. 3 Nucleotide sequences and their translated amino acid sequences of PcAMT1-2
Double underline：N-glycosylation site；Dashed：Tyrosine kinase phosphorylation site；Pane：Protein kinase C phosphorylation site；
Single underline：Trans-membrane domain；TM1–TM11：Serial number of trans-membrane domain；
Grey shading：Ammonium transporters signature.

系统进化分析结果表明：PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 均属于 AMT1 亚家族，但分别隶属于不同的
类型；PcAMT1-1 与百脉根 LjAMT1;1 的亲缘关系最近，并且 PcAMT1-1、LjAMT1;1、PtrAMT1;1、
PtrAMT1;3 和 LeAMT1;1 聚类在同一进化分支上；PcAMT1-2 与百脉根 LjAMT1;2 的亲缘关系最近，
并且 PcAMT1-2、LjAMT1;2、PtrAMT1;2、LeAMT1;2 和 AtAMT1;2 聚类在同一进化分支上（图 4）。
2122 园 艺 学 报 40 卷
























图 4 植物来源的 AMT 蛋白系统进化树
分枝上的数值为 1 000 次建树中该位置出现的置信度值；标尺代表核苷酸的置换距离。
Fig. 4 Phylogenetic analysis of AMT proteins from plants
The numbers at the nodes are the occurrence percentage with 1 000 bootstrap re-samplings.
The scale bar represents the evolutionary distance.

2.3 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的功能互补
在以 0.02、0.2 或 2 mmol · L-1 NH4+为唯一氮源的 YNB 培养基上，转空载体酵母 pYES2/31019b
不能生长；当 NH4+为 0.02 和 0.2 mmol · L-1 时，重组酵母 pYES2-PcAMT1-1/31019b 和 pYES2-
PcAMT1-2/31019b 均能够生长，当 NH4+为 2 mmol · L-1 时，两个重组酵母表现出完全互补功能（图
5，A），即 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的转入能使酵母铵转运体缺失突变菌株 31019b 恢复 NH4+吸收能
力，它们是有功能的铵转运蛋白基因。
在酸性培养基（pH 4.8 或 5.8）条件下，PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 对酵母 31019b 的互补效果优于
中性条件（pH 6.8）。在酸性条件下，PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的互补效果相当，而在中性 pH 条件下，
PcAMT1-2 的互补效果优于 PcAMT1-1（图 5，B）。
MeA+为 NH4+的有毒化学类似物，过多吸收可造成细胞死亡。25 mmol · L-1 MeA+对重组酵母
pYES2-PcAMT1-1/31019b 和 pYES2-PcAMT1-2/31019b 的生长均无抑制作用，100 mmol · L-1 MeA+可
11 期 丛 郁等：豆梨铵转运蛋白基因 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的克隆与功能鉴定 2123

显著抑制 pYES2-PcAMT1-1/31019b 的生长，对 pYES2-PcAMT1-2/31019b 的生长无明显影响（图 5，
C），即 PcAMT1-1 对 MeA+的吸收能力强于 PcAMT1-2。
MSX 为谷氨酰胺合成酶不可逆抑制剂，50 μmol · L-1 MSX 可显著抑制 pYES2-PcAMT1-2/31019b
的生长，对 pYES2-PcAMT1-1/31019b 的生长无明显影响（图 5，D），表明 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2
存在着不同的反馈调控机制。

图 5 重组酵母 pYES2-PcAMT1-1/31019b 和 pYES2-PcAMT1-2/31019b 的功能互补
Fig. 5 The function complements of recombinant yeast engineered bacteria
pYES2-PcAMT1-1/31019b and pYES2-PcAMT1-2/31019b

2.4 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的表达特点
在正常供铵（2.5 mmol · L-1 NH4+）条件下，PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 在豆梨幼苗的根、茎、叶中
均有表达，其中 PcAMT1-1 在地上部的表达量高于地下部，PcAMT1-2 在地下部的表达量高于地上
部（图 6）。无氮处理后，PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 在根中的表达先上升后下降，但它们表达高峰出
现的时间有所差异，PcAMT1-1 表达高峰出现在处理 2 d，PcAMT1-2 出现在处理 1 d；无氮处理 3 d
2124 园 艺 学 报 40 卷
后加入 10 mmol · L-1 NH4+处理 2 h，PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的表达水平重新上调；PcAMT1-1 和
PcAMT1-2 在植株茎和叶片中的表达受无氮或高铵处理影响不明显（图 6）。由此表明，PcAMT1-1
和 PcAMT1-2 在植株根部的表达主要受到低氮诱导的调控。

图 6 不同铵浓度处理对豆梨幼苗 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 表达的影响
Fig. 6 Effects of different ammonium concentration on expression levels in bean pear seedlings of
PcAMT1-1 and PcAMT1-2 genes
3 讨论
高等植物的铵转运蛋白由多基因家族所编码，该家族可被分为 AMT1 和 AMT2 两个亚家族
（Loque & von Wirén，2004）。在不同植物种类中 AMT1 亚家族成员数量有所不同：拟南芥有 5 个
AMT1，水稻，番茄以及百脉根都只有 3 个 AMT1。不同的 AMT1 成员所执行的功能亦有所差别：拟
南芥 AtAMT1-4 仅在花器官运输铵态氮以确保花粉的活性（Yuan et al.，2009），AtAMT1-1 和 AtAMT1-2
主要在根中吸收铵态氮（Shelden et al.，2001）。本研究克隆获得的 2 个 AMT1 亚家族成员（PcAMT1-1
和 PcAMT1-2）均具备铵吸收功能，但是它们的表达特点与调控机制存在差异，需要通过进一步的
转基因试验来明确上述两个基因在豆梨铵吸收转运过程中所起的具体作用。
AMT 功能蛋白是由 3 个单体蛋白组装构成的双轴晶体，其空间结构一般有 10 ~ 12 个跨膜区
（Blakey et al.，2002），最保守的特征序列存在于第 5 个或第 6 个跨膜区上（Saier，1998）。豆梨
PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 均含有 11 个跨膜区，其特征序列（PcAMT1-1 为 D205 ~ R230，PcAMT1-2
为 D206 ~ R231）分别位于第 5 个（图 2）和第 6 个跨膜区上（图 3），它们与大肠杆菌 EcAmtB 第 5
跨膜区上的特征序列 D160FAGGTVVHINAAIAGLVGAYLIGK-R186（Javelle et al.，2004）高度相似。
点突变试验证实 D160 是 EcAmtB 基因结合 NH4+的重要位点（Javelle et al.，2004），PcAMT1-1 的 D205
和 PcAMT1-2 的 D206 是否具备相同的功能，仍需进一步试验加以证明。此外，AMT 的功能受磷酸
化位点的调控，外界高铵条件可以诱导 AtATM1;1 C 端 T460，S488 和 S490 的磷酸化/去磷酸化，使 AMT
蛋白失活，NH4+吸收停止，避免细胞铵浓度过高所导致的中毒死亡（Lanquar et al.，2009）。PcAMT1-1
和 PcAMT1-2 的酪蛋白激酶磷酸化和蛋白激酶 C 磷酸化位点的数量和位置均不相同（图 2，图 3），
表明它们的调控机制可能存在差异。
AMT1 对 NH4+的吸收转运存在多种机制。番茄 LeAMT1-1（Ludewig et al.，2002）和 LeAMT1-2
（von Wirén et al.，2003）是 NH4+的单向转运体，它们转运铵的过程不需要 H+参与，因此不受环境
11 期 丛 郁等：豆梨铵转运蛋白基因 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的克隆与功能鉴定 2125

pH 的影响；菜豆 PvAMT1-1（Pantoja et al.，2011）转运 NH4+的过程需要 H+的共转运，而小麦 TaAMT1;1
（Zeuthen et al.，2009）为 NH3/H+共转运，它们对 NH4+的转运受到环境 pH 的影响。通过酵母互补
试验发现，外界环境 pH 能够影响 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 对铵的转运（图 5），表明 H+参与 NH4+
转运过程，但是它们的转运类型为 NH4+/H+还是 NH3/H+尚需进一步试验来明确。
MeA+为 NH4+的毒性同系物，和后者吸收途径类似，通常用于 AMT 吸收试验。100 mmol · L-1
MeA+存在条件下，重组酵母 pYES2-PcAMT1-1/31019b 和 pYES2-PcAMT1-2/31019b 的生长情况不
同（图 5），表明 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 对 MeA+的吸收量不同，它们对铵的吸收转运能力有差异。
植物细胞吸收 NH4+后，通过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循环途径将其同化为谷氨酸。MSX 是谷
氨酸的同系物，它作为谷氨酰胺合成酶的不可逆抑制剂可以阻止铵进一步同化成谷氨酸，导致铵离
子在细胞中积累（Rhodes et al.，1986），抑制细胞生长。添加 50 μmol · L-1 MSX，pYES-PcAMT1-1/
31019b 正常生长，pYES-PcAMT1-2/31019b 生长受抑制。由此推测两种重组酵母细胞中铵离子含量
有差异，而 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的功能差异是造成这一现象的重要原因。
PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 在豆梨植株根部的表达均受低氮调控（图 6），这一特性与柑橘 CitAMT1
（Camañes et al.，2009）和杨树 PtrAMT1;2（Couturier et al.，2007）类似。无氮处理初期（1 和 2 d），
PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 在根中表达量上升，以促进根部贮藏的 NH4+向地上部输送，处理后期（3 d），
根部的 NH4+逐渐消耗，吸收和转运的底物减少，PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的表达量也随之下降，间
接证明它们均参与豆梨根部对铵的吸收转运过程。目前，已经证实 AMT 在叶片中参与细胞光呼吸过
程中的铵转运代谢和铵的回流贮藏过程（Suárez et al.，2002）。结合 PcAMT1-1 的表达特点[正常供
铵（2.5 mmol · L-1 NH4+）条件下 PcAMT1-1 在豆梨植株叶片中的表达丰度明显高于根和茎，其在叶
片中的表达不受无氮或高铵处理影响（图 6）]，推测 PcAMT1-1 除了在根部吸收转运 NH4+外，可
能也参与豆梨地上部 NH4+的转运。PcAMT1-2 在叶片中的表达同样不受无氮或高铵处理影响，但是
正常供铵（2.5 mmol · L-1 NH4+）条件下，该基因主要在根中表达，推测 PcAMT1-2 仅负责在根部吸
收转运 NH4+。此外，光照、铵态氮/硝态氮比例、根际酸碱度以及碳源形态等因素亦能调控 AMT 的
表达（Camañes et al.，2007）。为进一步明确 PcAMT1-1 和 PcAMT1-2 的表达调控特点，它们的表达
谱正在分析中。

References
Blakey D，Leech A，Thomas G H，Coutts G，Findlay K，Merrick M. 2002. Purification of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB reveals
a trimeric stoichiometry. Biochemical Journal，364：527–535.
Camañes G，Cerezo M，Primo-Millo E，Gojon A，García-Agustín P. 2007. Ammonium transport and CitAMT1 expression are regulated by light and
sucrose in Citrus plants. Journal of Experimental Botany，58：2811–2825.
Camañes G，Cerezo M，Primo-Millo E，Gojon A，García-Agustín P. 2009. Ammonium transport and CitAMT1 expression are regulated by N in Citrus
plants. Planta，229：331–342.
Couturier J，Montanini B，Martin F，Brun A，Blaudez D，Chalot M. 2007. The expanded family of ammonium transporters in the perennial poplar
plant. New Phytologist，174：137–150.
D’Apuzzo E，Rogato A，Simon-Rosin U，El Alaoui H，Barbulova A，Betti M，Dimou M，Katinakis P，Marquez A，Marini A M，Udvardi M
K，Chiurazzi M. 2004. Characterization of three functional high-affinity ammonium transporters in Lotus japonicus with differential
transcriptional regulation spatial expression. Plant Physiology，134：1763–1774.
Hofmann K，Stoffel W. 1993. TMbase-A database of membrane spanning proteins segments. Biological Chemistry Hoppe-Seyler，347：166–174.
Huang Ji，Zhang Hong-sheng. 2004. Development of nucleotide sequence analysis software based on Windows. Chinese Journal of Bioinformatics，
(2)：13–17. (in Chinese)
黄 骥，张红生. 2004. 基于 Windows 的核酸序列分析软件的开发. 生物信息学，(2)：13–17.
2126 园 艺 学 报 40 卷
Javelle A，Severi E，Thornton J，Merrick M. 2004. Ammonium sensing in Escherichia coli-Role of the ammonium transporter AmtB and AmtB-GlnK
complex formation. Journal of Biological Chemistry，279：8530–8538.
Kaiser B N，Rawat S R，Siddiqi M Y，Masle J，Glass A D. 2002. Functional analysis of an Arabidopsis T-DNA“Knockout”of the high-affinity NH4+
transporter AtAMT1;1. Plant Physiology，130：1263–1275.
Lanquar V，Loque D，Hormann F，Yuan L，Bohner A，Engelsberger W R，Lalonde S，Schulze W X，von Wiren N，Frommer W B. 2009. Feedback
inhibition of ammonium uptake by a phospho-dependent allosteric mechanism in Arabidopsis. Plant Cell，21：3610–3622.
Li Hui，Cong Yu，Wang Hong-wei，Sheng Bao-long，Lin Jing，Chang You-hong. 2010. Molecular cloning and expression analysis of a phytochelatin
synthase gene，PcPCS1，from Pyrus calleryana Dcne. Acta Horticulturae Sinica，37：880–890. (in Chinese)
李 慧，丛 郁，王宏伟，盛宝龙，蔺 经，常有宏. 2010. 豆梨植物络合素合酶 PcPCS1 基因克隆及其表达分析. 园艺学报，37：880–890.
Loqué D，von Wirén N. 2004. Regulatory levels for the transport of ammonium in plant roots. Journal of Experimental Botany，55：1293–1305.
Lothier J，Gaufichon L，Sormani R，Lemaître T，Azzopardi M，Morin H，Chardon F，Reisdorf-Cren M，Avice J C，Masclaux-Daubresse C. 2011.
The cytosolic glutamine synthetase GLN1;2 plays a role in the control of plant growth and ammonium homeostasis in Arabidopsis rosettes when
nitrate supply is not limiting. Journal of Experimental Botany，62：1375–1390.
Ludewig U，von Wirén N，Frommer W B. 2002. Uniport of NH4+ by the root hair plasma membrane ammonium transporter LeAMT1;1. Journal of
Biological Chemistry，277：13548–13555.
Ninnemann O，Jauniaux J C，Frommer W B. 1994. Identification of a high-affinity NH4+ transporter from plants. The EMBO Journal，13：3464–
3471.
Pantoja O，Ortiz-Ramirez C，Mora S I，Trejo J. 2011. PvAMT1;1，a highly selective ammonium transporter that functions as H+/NH4+ symporter.
Journal of Biological Chemistry，286：31113–31122.
Rhodes D，Deal L，Haworth P，Jamieson G C，Reuter C C，Ericson M C. 1986. Amino acid metabolism of Lemna minor L.：I. Responses to
methionine sulfoximine. Plant Physiology，82：1057–1062.
Saier Jr M H. 1998. Molecular phylogeny as a basis for the classification of transport proteins from bacteria，archaea and eukarya. Advances in
Microbial Physiology. R. K. Poole：Academic Press：40：81–136.
Salvemini F，Marini A，Riccio A，Patriarca E J，Chiurazzi M. 2001. Functional characterization of an ammonium transporter gene from Lotus
japonicus. Gene，270：237–243.
Selle A，Willmann M，Grunze N，Gessler A，Weiss M，Nehls U. 2005. The high-affinity poplar ammonium importer PttAMT1.2 and its role in
ectomycorrhizal symbiosis. New Phytology，168：697–706.
Shelden M C，Dong B，de Bruxelles G L，Trevaskis B，Whelan J，Ryan P R，Howitt S M，Udvardi M K. 2001. Arabidopsis ammonium transporters，
AtAMT1;1 and AtAMT1;2，have different biochemical properties and functional roles. Plant and Soil，231 (1)：151–160.
Sigrist C J A，Cerutti L，de Castro E，Langendijk-Genevaux P S，Bulliard V，Bairoch A，Hulo N. 2010. PROSITE，a protein domain database for
functional characterization and annotation. Nucleic Acids Research，38：D161–D166.
Sonoda Y，Ikeda A，Saiki S，von Wirén N，Yamaya T，Yamaguchi J. 2003. Distinct expression and function of three ammonium transporter genes
（OsAMT1;1-1;3）in rice. Plant and Cell Physiology，44：726–734.
Suárez M F，Avila C，Gallardo F，Cantón F R，García-Gutiérrez A，Claros M G，Cánovas F M. 2002. Molecular and enzymatic analysis of ammonium
assimilation in woody plants. Journal of Experimental Botany，53：891–904.
Taira M，Valtersson U，Burkhardt B，Ludwig R A. 2004. Arabidopsis thaliana GLN2-encoded glutamine synthetase is dual targeted to leaf
mitochondria and chloroplasts. The Plant Cell，16：2048–2058.
von Wirén N，Ludewig U，Wilken S，Wu B H，Jost W，Obrdlik P，El Bakkoury M，Marini A M，Andre B，Hamacher T，Boles E，Frommer
W B. 2003. Homo- and hetero-oligomerization of ammonium transporter-1 NH4+ uniporters. Journal of Biological Chemistry，278：45603–
45610.
Yuan L X，Graff L，Loqué D，Kojima S，Kojima S，Tsuchiya Y N，Takahashi H，von Wirén N. 2009. AtAMT1;4，a pollen-specific high-affinity
ammonium transporter of the plasma membrane in Arabidopsis. Plant and Cell Physiology，50 (10)：13–25.
Zeuthen T，Sogaard R，Alsterfjord M，MacAulay N. 2009. Ammonium ion transport by the AMT/Rh homolog TaAMT1;1 is stimulated by acidic pH.
Pflugers Archiv-European Journal of Physiology，458：733–743.