全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（6）：1157–1166 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–01–15；修回日期：2014–05–07
基金项目：国家自然科学基金项目（30900991，31372095 和 31000920）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ma_nan@cau.edu.cn）
月季切花乙烯受体RhETR3互作蛋白RhTSPO1
的筛选和鉴定
杨若韵 1，陈 雯 1，薛璟祺 2，田 佶 1，张 帅 1，朱春彦 1，高俊平 1，
马 男 1,*
（1 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：利用已构建的月季分裂泛素酵母双杂文库，以月季乙烯受体蛋白 RhETR3 为诱饵，筛选能
够与 RhETR3 结合的互作蛋白。经酵母回转验证共得到 26 个阳性克隆。在候选蛋白中发现一个 TspO/MBR
蛋白家族的成员，命名为 RhTSPO1。通过 RACE 分离了 RhTSPO1 基因全长，共 777 bp，开放阅读框（ORF）
为 579 bp，编码 192 个氨基酸。在酵母中，利用酵母生长和 β–半乳糖苷酶活性（β-gal）验证了 RhETR3
和 RhTSPO1 之间确实存在互作。将 RhETR3-GFP 和 RhTSPO1-mCherry 融合蛋白共转入烟草，激光共聚
焦显微镜观察发现 RhTSPO1 和 RhETR3 蛋白共同定位于内质网上。月季花朵自然开放过程中，RhTSPO1
在花瓣中的表达呈现先增强后减弱的趋势，与开放和衰老过程紧密联系，表明 RhTSPO1 可能参与了花朵
开放过程。本试验结果表明乙烯受体蛋白水平的互作调节可能也参与月季花朵开放和衰老的调节。
关键词：月季；花朵开放；乙烯受体；蛋白互作
中图分类号：S 685.12 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1157-10

Screening and Identification of RhTSPO1，an Interacting Protein of
Ethylene Receptor RhETR3 in Cut Roses
YANG Ruo-yun1，CHEN Wen1，XUE Jing-qi2，TIAN Ji1，ZHANG Shuai1，ZHU Chun-yan1，GAO
Jun-ping1，and MA Nan1,*
（1Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，
China；2Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：It is known that RhETR3 plays an important role in ethylene-regulated flower opening of
roses（Rosa hybrida）. Here，RhETR3 was used as a bait to screen its potential interacting proteins in rose
petals by using split ubiquitin yeast two-hybrid system. Of 26 positive clones which were identified and
confirmed by retransformation in yeast，a TSPO/MBR protein was isolated by RACE and was named as
RhTSPO1. The full length of RhTSPO1 was 777 bp which contained a 579 bp open reading frame，
encoding 192 amino acids residues. The interaction between RhETR3 and RhTSPO1 was confirmed by
β-galactosidase activity test in yeast. In addition，RhTSPO1 was fused with a mCherry fluorescent protein.
The resultant RhTSPO1-mCherry fusion protein was used to conduct the fluorescence co-localization with

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RhETR3-GFP. The results indicated that these two proteins both located in the endoplasmic reticulum. The
expression of RhTSPO1 increased as flower opening in the petals of cut roses，while it started to decrease
when flower reached full opening，implying that RhTSPO1 may be involved in the flower opening process.
Key words：cut rose；flower opening；ethylene receptor；protein interaction

月季（Rosa hybrida）切花的采后流通中，乙烯可导致出现僵蕾、僵花、开放畸形、开放过速以
及花瓣脱落等问题，严重损害切花品质，是导致月季切花采后损耗的重要原因（高俊平 等，1997；
蔡蕾 等，2002），因此乙烯作用机制成为月季采后生理研究的一大热点问题。
植物通过乙烯受体蛋白感受乙烯信号。乙烯受体基因是一个小基因家族。在拟南芥和番茄中各
发现了 5 个和 6 个乙烯受体基因（Bleecker，1999；Klee & Tieman，2002）。之前的研究表明，乙烯
对月季花朵开放的影响是通过对乙烯受体基因的上调来实现的（Ma et al.，2006；Tan et al.，2006；
Xue et al.，2008）。在已发现的 5 个月季乙烯受体基因中，RhETR3 属于亚家族Ⅱ型受体。RhETR3
基因的表达随着月季花朵的开放逐渐升高。乙烯处理导致 RhETR3 表达出现剧烈升高，乙烯抑制剂
则可完全抑制 RhETR3 的表达。其余受体基因的表达量在花朵开放中均无明显变化，也不能对乙烯
和乙烯抑制剂发生响应（Ma et al.，2006）。因此，从转录层面上看，RhETR3 是月季花朵开放中响
应乙烯，介导乙烯对花朵开放调节作用的重要受体基因。
乙烯受体蛋白与互作蛋白共同调节了乙烯信号输出。乙烯受体一般形成同源二聚体定位于内质
网行使功能。又有研究发现，拟南芥的 ETR1 和 ERS1 在与其他受体基因结合时共同抑制乙烯的响应，
表明乙烯受体蛋白之间存在异源结合（Liu & Wen，2012）。近来研究发现，1 个膜结合蛋白 RTE1
（REVESION-TO-ETHYLENE SENSITIVITY1）以一种依赖于 ETR1 的方式调节了拟南芥对乙烯的
响应。RTE1 是拟南芥乙烯响应的负调控因子。亚细胞定位发现，拟南芥体内 RTE1 和 ETR1 共同定
位于内质网和高尔基体（Zhou et al.，2007；Dong et al.，2008）。BIFC 以及 Co-IP 试验证明了 RTE1
和 ETR1 存在直接的结合（Dong et al.，2010）。
多种形式的转录后调控模式在受体信号输出中发挥了关键作用，且这种调控具有物种和发育过
程特异性。而明确乙烯受体的互作蛋白是阐明受体作用机制的一个关键内容。因此，对于月季，筛
选 RhETR3 的互作蛋白，分离与 ETR3 结合影响乙烯信号输出的重要蛋白对于进一步明确 RhETR3
在月季花瓣发育过程中的转录后调节机制及其与月季花瓣生长发育的内在关联具有重要意义。本研
究中发现了一个与 RhETR3 互作的膜蛋白 RhTSPO1，并对其表达和亚细胞定位等特性进行了分析，
所获结果对于理解乙烯受体在月季花瓣发育过程中介导乙烯的作用机制具有一定意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2011—2013 年在中国农业大学完成。供试材料为切花月季‘Samantha’，采自北京市昌
平区花卉生产基地。
切花于开花级数 0 级（Ma et al.，2005）时采收，采后插于自来水中，2 h 内运回实验室。按照
花枝长 25 cm，留 3 片复叶的标准修剪。采收后的花材经复水处理后重新置于去离子水中，置于瓶
插室内观察。瓶插室内环境保持温度 23 ~ 25 ℃，相对湿度 30% ~ 40%，光强 40 µmol · m-2 · s-1，12 h
光照/12 h 黑暗。在花材开放过程中，分别于开花级数为 0 ~ 6 级时收集中层花瓣，经液氮速冻后存
于–80 ℃条件下，每个取样点至少取 5 朵花，作为 5 个生物学重复备用。
6 期 杨若韵等：月季切花乙烯受体 RhETR3 互作蛋白 RhTSPO1 的筛选和鉴定 1159

1.2 互作蛋白的筛选
采用分裂泛素化酵母双杂交系统（DUALSYTEMS BIOTECH，Swiss）进行互作蛋白的筛选。
通过蛋白拓扑结构分析，发现 RhETR3 具有 4 个跨膜域，N 端游离于细胞质中，C 端位于内质网膜
内，选择 pBT3-STE 载体，并且采用了两个 Sfi I 限制性酶切位点。构建载体时，首先，用 Pfu 和 Taq
酶通过 PCR 扩增 RhETR3 基因的 ORF 区段，在扩增的同时将 SfiⅠ位点附加在基因的 5′和 3′末端，
设计引物（表 1，编号 1、2）电泳后回收片段，采用 SfiⅠ单酶切后回收片段，定向连入酶切后的载
体 pBT3-STE 两个 SfiⅠ位点之间，转化大肠杆菌后挑选阳性克隆，测序。测序获得正确序列之后转
化 NYM51 酵母株系筛选 RhETR3 互作蛋白。
月季花瓣 cDNA 文库的筛选：将构建成功的载体转入酵母 NYM51 菌株，经载体活性验证之后，
通过预筛库筛选 3–氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）浓度，最后确定于每个培养基添加 2.5 mmol · L-1
3-AT。继而进行文库筛选，挑出 4 种氨基酸缺陷型培养基生长的单克隆，划线备份，进行 β–半乳
糖苷酶活性检测。将显色良好的单克隆提取质粒转化大肠杆菌，用载体 pPR3N 引物进行 PCR 检测，
挑取阳性克隆测序，通过 NCBI 和月季库比对呈阳性的蛋白。
1.3 烟草中的亚细胞定位
根据目的基因 RhETR3 序列设计引物对（表 1，编号 3、4）；根据 GFP 基因的序列设计引物对
（表 1，编号 5、6），分别扩增 RhETR3 和 GFP 开放阅读框（不包含终止子），产生的 PCR 产物回
收后通过 overlapping PCR 扩增，得到 RhETR3-GFP 融合基因。根据目的基因 RhTSPO1 序列设计引
物对（表 1，编号 7、8）；根据 mCherry 基因的序列设计引物对（表 1，编号 9、10），扩增产物回
收纯化后连接到克隆载体 pGM T-easy 上，测序验证后获得重组质粒，分别用 Spe /Ⅰ KpnⅠ进行双酶
切，回收目的片段后，与经用 Spe /Ⅰ KpnⅠ双酶切的 Super1300 载体用 T4 连接酶进行连接，构建成
瞬时表达载体 pSuper1300-RhETR3-GFP 和 pSuper1300-RhTSPO1-mCherry。获得的连接产物转化到
E. coli DH5α，经酶切和测序鉴定正确后，筛选阳性克隆并提取质粒。构建好的质粒及 P19 质粒转化
到农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 中。
取活化的农杆菌挑取单菌落接种到 5 mL 液体 LB 中，28 ℃震荡培养 14 ~ 16 h，至 OD600 值在
1.5 ~ 2.0 之间。将 RhETR3-GFP、RhTSPO1-mCherry 和 P19 农杆菌混合，使终浓度 OD600 值分别为
0.5、0.5 和 0.3。按终体积 10 mL 计算每种组合中各个菌液的用量。混合每组菌液，集菌，用侵染液
（10 mmol · L-1 MgCl2，10 mmol · L-1 MES 和 100 mmol · L-1 乙酰丁香酮，pH 5.6）悬浮。室温下静
置 2 ~ 3 h。用 1 mL 不含针头的注射器注射侵染烟草下表皮，暗培养 1 d 后，正常条件下培养 2 d。
取烟草叶片的下表皮，用 Olympus FV10 共聚焦系统检测荧光信号。mCherry 和 GFP 分别在 543 nm
和 488 nm 的激光下激发，分别于 560 ~ 615 nm 和 505 ~ 530 nm 下观察。
1.4 RT-PCR 分析
提取不同花瓣样品总 RNA，利用 Powerscript reverse transcriptase（Clontech）反转录成 cDNA，
再根据 RhTSPO1 全长序列，选取非保守区设计特异引物（表 1，编号 11、12），用于半定量 RT-PCR
分析。扩增条件：94 ℃预变性 5 min，然后 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，28 个
循环，最后 72 ℃延伸 8 min。同时选取 Actin5 作为 RT-PCR 内标（表 1，编号 13、14）。扩增条件：
94 ℃预变性 5 min，然后 94 ℃变性 30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，30 个循环，最后 72 ℃延
伸 8 min。PCR 产物经 1.2%的琼脂糖凝胶进行分离后用 GoldViewTM染料染色观察，同时条带用 Alpha
Ease FCTM 2200（Alpha Innotech，Version 3.2.1）软件量化。每个时间点样本均设 3 次生物学重复。
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1.5 实时定量 RT-PCR
按照 Real Master Mix（SYBR Green）PCR 试剂盒操作指导，采用实时荧光定量 PCR（Real-time
quantitative PCR，RT-qPCR）的方法，检测基因的相对表达量。扩增 RhTSPO1 转录本的引物见表 1
（编号 15、16），以 RhUBI2（表 1，编号 17、18）作为内参基因。对反转录所得的 cDNA 分别进行
4 倍梯度稀释，实施荧光定量反应。反应程序为：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 20 s，52 ℃退火 30
s，72 ℃延伸 30 s，40 次循环，每次循环第 3 步进行荧光采集，最后 95 ℃变性 1 min，退火至 55 ℃
（每 10 s 上升 0.15 ℃）后保温 1 min，接着检测其荧光值，绘制熔点曲线。标准品 cDNA 和待测样
品均设置 3 次重复。

表 1 各种载体构建及 TSPO1 表达检测引物
Table 1 Primers of vector generation and the expression of TSPO1
编号
No.
引物
Primer
引物序列
Primer sequence
1 RhETR3-bait-upper 5′-ATTAACAAGGCCATTACGGCCTTAAAGGCATTAGCATCTGG-3′
2 RhETR3-bait-lower 5′-AACTGATTGGCCGAGGCGGCCCCCACAATTTTGTTTGCCTG-3′
3 RhETR3-GFP-upper SpeⅠ 5′-GTCACTAGTATGTTAAAGGCATTAGCATCTGGG-3′
4 RhETR3-GFP-lower KpnⅠ 5′-GGTGGTACCTTACTTACTTGTACAGCTCGTC-3′
5 GFP-over-upper 5′-CAAACAAAATTGTGATGGTGAGCAAGGGC-3′
6 GFP-over-lower 5′-GCCCTTGCTCACCATCACAATTTTGTTTG-3′
7 RhTSPO1-mCherry-upper SpeⅠ 5′-ATCACTAGTATGGATTCCCAAAACCTCAAGC-3′
8 RhTSPO1-mCherry-lower KpnⅠ 5′-GGTGGTACCTTACTTACTTGTACAGCTCGTC-3′
9 mCherry-over-upper 5′-CTTGTGTATCTCATGGTGAGCAAGGG-3′
10 mCherry-over-lower 5′-CCCTTGCTCACCATGAGATACACAAG-3′
11 RhTSPO1-RT-upper 5′-CCATGAGACCACATACAATTCG-3′
12 RhTSPO1-RT-lower 5′-TGCTAGCTTCGACATTATGCACACGA-3′
13 Actin5-upper 5′-CCATGAGACCACATACAATTCG-3′
14 Actin5-lower 5′-TGCTAGCTTCGACATTATGCACACGA-3′
15 RhTSPO1-qRT-upper 5′-TCAAGCAGCGTAGGGTTGC-3′
16 RhTSPO1-qRT-lower 5′-TCTCATGTCGCGTTTGCTTG-3′
17 RhUBI2-qRT-upper 5′-CACAAGCACGCAAACCCTAT-3′
18 RhUBI2-RT-lower 5′-GGAGCATGAGCCAAATGGAG-3′
2 结果与分析
2.1 RhETR3 互作蛋白的筛选
采用酵母分裂泛素化双杂交方法，对月季花瓣 cDNA 文库进行互作蛋白的筛选，经 β–半乳糖
苷酶活性检测后选择阳性克隆测序共计 200 个。将测序得到的序列在本实验室已建立的月季转录组
数据库中进行比对，获得了 26 种候选互作蛋白。如表 2 所示，获得的互作蛋白包括泛素化蛋白、钙
调素相关蛋白以及蛋白伴侣等，表明 ETR3 可能受多种形式的转录后调节。
2.2 回转验证证明 RhTSPO1 与 RhETR3 的互作
通过将候选互作蛋白的质粒回转到含诱饵的酵母中，可以排除 His+/Ade+/LacZ+表型的假阳性
互作子的存在。对这筛选到的 26 种候选互作蛋白进行回转互作验证。结果发现 16 种蛋白在 SD-Trp-
Leu-His-Ade 筛选培养基上并不生长，表明这 16 个蛋白为假阳性，剩余 12 个为阳性。其中，一个优
选的候选互作蛋白为膜定位的转运蛋白 RhTSPO1（outer membrane Tryptophan-rich Sensory Protein）。
如图 1 所示，RhTSPO1 在 SD-Trp-Leu-His-Ade 筛选培养基上能够生长，同时将生长出来的克隆划线，
用滤纸显色法能够检测出 β–半乳糖苷酶活性，说明 RhTSPO1 跟 RhETR3 在酵母体内是互作的。
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表 2 筛选到的候选阳性克隆功能注释
Table 2 Annotation of 26 positive clones
EST ID 蛋白注释 Annotation 相同克隆数
Number of redundant clones
RU03597 DIR1（Defective in induced resistance 1）[Arabidopsis thaliana] 10
RU01769 Gip1-like protein（Gibberellin-induced protein 1）[Petunia × hybrida] 2
RU25825 calmodulin-binding transcription activator 5 3
RU12927 BIGYIN1（BIGYIN） 3
RU02240 tetraspanin7（TET7） 2
RU15274 TSPO/benzodiazepine receptor 5
RU23389 Cb5-B（cytochrome b5 isoform B）[Vernicia fordii] 2
RU01532 proton pump interactor 1（PPI1） 2
RU42854 chaperone DnaJ-domain containing protein 2
RU15030 protein transport protein SEC61 gamma subunit，putative [Arabidopsis thaliana] 2
RU05536 squamosa promoter-binding-like protein 1（SPL1） 2
RU17532 syntaxin-132（SYP132） 2
RU04516 vesicle-associated membrane protein 722（SAR1） 2
RU06473 AVA-P2；ATPase/ proton-transporting ATPase 2
RU22433 plasma membrane aquaporin（PIP2；1） 2
RU05405 2-methyl-6-geranylgeranylbenzoquinone methyltranferase 2
RU02929 Bet1-like SNARE 1-2（ATBET12） 1
RU06102 MATE efflux family protein 1
RU03618 disease resistance protein RPP8（RPP8） 2
RU24498 glutathione S-transferase（AT1G65820） 2
RU03618 HR-like lesion-inducing protein-like protein 2
RU23498 L-ascorbate peroxidase（TAPX） 1
RU24904 magnesium transporter MRS2-3（MGT4） 2
RU15878 ATOEP16-1（OUTER PLASTID ENVELOPE PROTEIN 16-1） 1
RU13015 Plasma-membrane choline transporter family protein 1
NAC domain class transcription factor（NAC13） 2


图 1 酵母中回转验证 RhETR3 和 RhTSPO1 的互作
SD-Trp-Leu 及 SD-Trp-Leu-His-Ade 酵母生长试验；滤纸显色试验检测 β–半乳糖苷酶活性。
Fig. 1 The confirmination of interaction between RhETR3 and RhTSPO1 by retransform in yeast
Yeast gowth assay on SD-Trp-Leu and SD-Trp-Leu-His-Ade；β-galactosidasse activity of the interaction between
RhETR3 and some candidate interacors.
2.3 RhTSPO1 氨基酸序列同源性分析
通过 RACE 从月季花瓣中克隆得到 RhTSPO1 的基因全长，共 777 bp，该基因 ORF 为 579 bp，
编码 192 aa。在 NCBI 中，利用 BLAST-Conserved Domains 程序，进行了 RhTSPO1 基因氨基酸序列
分析。结果（图 2）表明，以月季‘Samantha’花瓣总 RNA 为模板克隆所得到的 TSPO 属于 TspO/MBR
家族成员之一，具有 1 个特征基序 TspO_MBR，故命名为 RhTSPO1。
如图 3 所示，与其他物种中的 TSPO 氨基酸序列的同源性比较发现，家族成员之间的保守性较
高，其中与草莓中的 FvTSPO 最高，达到了 85.94%；同时，和其他同源 TSPO 类似，RhTSPO1 也
具有 6 个跨膜结构域（Transmembrane domains，TM）。
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图 2 RhTSPO1 氨基酸保守序列分析
Fig. 2 Analysis of conserved-domain of RhTSPO1


图 3 月季 RhTSPO1 main ORF 推导的氨基酸序列的多重比对分析
Fig. 3 Alignment of the predicted amino acid sequences of RhTSPO1 main ORF
6 期 杨若韵等：月季切花乙烯受体 RhETR3 互作蛋白 RhTSPO1 的筛选和鉴定 1163

为了进一步了解分析 RhTSPO1 进化关系，选择了 12 个亲缘关系较为密切和具有代表性的其他
物种的 TSPO 氨基酸序列，利用 MEGA 5.0 软件，对这些植物的 TSPO 结构域蛋白进行进化树分析。
如图 4 所示，RhTSPO1 和 FvTSPO 亚组成员同源性最高。

图 4 月季 RhTSPO1 氨基酸序列与不同来源 TSPO 氨基酸序列的系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of TSPO from various species including RhTSPO1

2.4 烟草叶片中共定位验证 RhETR3 与 RhTSPO1 的互作
为了进一步确认 RhETR3 与 RhTSPO1 在植物体内的互作，在烟草叶片中进行了 RhETR3 和
RhTSPO1 的共定位试验。在显微镜视野下找到两种荧光蛋白共表达的烟草表皮细胞，如图 5 所示，
RhETR3-GFP 的绿色荧光和 RhTSPO1-mCherry 的红色荧光都分布在细胞的质膜及内质网上。在两种
激发光下两者的荧光能完全重合，说明 RhETR3 和 RhTSPO1 在烟草表皮细胞内具有相同的定位。
这个结论也进一步验证了 RhETR3 和 RhTSPO1 在植物体内是互作的。

图 5 RhETR3 和 RhTSPO1 在烟草叶片中的荧光共定位
Fig. 5 Fluorescence co-localization of RhETR3 and RhTSPO1 in tobacco leaves


2.5 RhTSPO1 在切花月季不同器官和不同开放级数花瓣中的表达分析
分别采用半定量 RT-PCR（图 6）以及实时定量 RT-PCR（图 7）检测 RhTSPO1 在不同器官以及
不同开放级数的花瓣中的表达，得到了一致的结果。结果表明，RhTSPO1 在雌蕊以及花托中表达量
很低，而在雄蕊、萼片、花瓣中均有较高表达；在未开放至初开的花芽期（0 ~ 1 级）的花瓣中几乎
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检测不到 RhTSPO1 的表达，初开到接近完全开放时（2 ~ 4 级）表达量逐渐增强，完全开放到衰老
（5 ~ 6 级）过程表达量迅速减弱。
图 6 RhTSPO1 在切花月季不同器官和不同开放级数花瓣中的 RT-PCR 表达结果
Fig. 6 RT-PCR analysis of RhTSPO1 in different tissues and in petals during flower opening


图 7 RhTSPO1 在切花月季不同器官和不同开放级数花瓣中的 qRT-PCR 表达结果
Fig. 7 qRT-PCR analysis of RhTSPO1 in different tissues and in petals during flower opening
3 讨论
乙烯受体是植物响应乙烯的关键因子，近年来发现，多种形式的转录后调控模式在受体信号输
出中发挥了关键作用。乙烯受体的功能及其调控具有较强的物种和发育过程特异性，因此，针对特
定物种和发育过程，鉴定其中发挥主要作用的乙烯受体蛋白，并分析其调节机制具有不可替代性。
比如，在拟南芥的 5 个受体中，仅 ETR1 能够受银离子的影响，调节植株对乙烯的敏感性，而其余
4 个受体均不具有这一功能（McDaniel et al.，2012）。乙烯受体蛋白研究开展的时间不长，主要集中
在模式植物拟南芥、烟草和番茄上。而月季作为世界范围内最重要的花卉作物之一又被视为花朵发
育研究中具有重要意义的模式植物（Debener & Linder，2009）。
本研究中以 pBT3-STE-RhETR3 为诱饵进行月季分裂泛素酵母双杂 cDNA 文库的筛选，得到 26
个阳性候选互作蛋白。包括泛素化蛋白、钙调素相关蛋白以及蛋白伴侣等。挑选了候选蛋白 RhTSPO1
进行下一步验证，经酵母回转验证和烟草叶片共定位证明 RhETR3 及 RhTSPO1 确实存在互作。
TSPO 是一个胁迫诱导的植物细胞早期分泌途径相关的膜蛋白，属于 TspO/MBR 家族，它能够
结合卟啉（Vanhee et al.，2011）。这个相对保守家族的成员可能与跨膜信号相关，同时被证明能够
结合各种不同结构的内源复合物。这种多样化的蛋白以前被称为外周型苯二氮卓受体，它具有一个
最显著的特点，即是一个哺乳动物 18 kD 的易位体蛋白（Verma et al.，1987；Taketani et al.，1995；
Lacapere et al.，2001；Papadopoulos et al.，2006）。植物的 TSPOs 似乎并不是必需的，同时它们的
生物功能目前也并没有被阐明，尽管已有一些报道表明它们能够被非生物胁迫和 ABA 诱导（Frank et
al.，2007；Kant et al.，2008；Guillaumot et al.，2009）。Guillaumot 等（2009）报道拟南芥中 AtTSPO
是一个定位于 ER 以及高尔基体的膜蛋白，本试验结果与其基本一致，表明植物的 TSPO 相关蛋白
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定位在早期分泌途径的器官。拟南芥的 TSPO 蛋白是一个潜在的多种胁迫的调节子（Brady et al.，
2007；Kleine et al.，2007；Dinneny et al.，2008）。AtTSPO 转录本主要在种子、花粉、衰老叶片等
器官中被检测到（Zimmermann et al.，2004；Brady et al.，2007；Winter et al.，2007）。在营养组织
中，AtTSPO 可以被一些非生物胁迫诱导，包括渗透压、盐胁迫、ABA 处理（Kreps et al.，2002；
Seki，2002；Catala et al.，2007；Dinneny et al.，2008）和镁的缺失、强光（Kleine et al.，2007；Hermans
et al.，2010）等。AtTSPO 被 bZIP 类转录因子 AREB1、AREB2、ABF3 进行转录调控，这个过程涉
及 ABA 响应元件依赖的 ABA 信号（Yoshida et al.，2010）。研究表明 AtTSPO 是一个能够与血红素
发生结合的膜蛋白（Vanhee et al.，2011），而血红素在真核细胞的生物学进程中扮演了一个至关重
要的角色，包括呼吸作用，蛋白质的靶向输送，转录以及翻译调节，离子通道调节和信号，小 RNA
过程，以及蛋白的降解（Severance & Hamza，2009；Mochizuki et al.，2010）。因此，推测 RhETR3
与 RhTSPO1 的互作可能涉及 ABA、乙烯以及盐信号的交叉作用，但三者之间如何协调进而影响月
季对乙烯信号以及可能的其他激素和环境信号应答目前尚不清楚。RhTSPO1 在花朵开放进程中的表
达表现出先增强再减弱的趋势，与花朵开放变化基本协调一致，表明 RhTSPO1 可能参与介导乙烯对
花朵开放调节作用，但具体参与方式还有待进一步研究。

References
Bleecker A B. 1999. Ethylene perception and signaling：An evolutionary perspective. Trends in Plant Science，4 (7)：269–274.
Brady S M，Orlando D A，Lee J Y，Wang J Y，Koch J，Dinneny J R，Mace D，Ohler U，Benfey P N. 2007. A high-resolution root spatiotemporal
map reveals dominant expression patterns. Science，318：801–806.
Cai Lei，Zhang Xiao-hong，Shen Hong-xiang，Gao Jun-ping. 2002. Effects of ethylene and its inhibitors on flower opening and senescence of cut
roses. Acta Horticulturae Sinica，29 (5)：467–472. (in Chinese)
蔡 蕾，张晓红，沈红香，高俊平. 2002. 乙烯对不同切花月季品种开花和衰老的影响. 园艺学报，29 (5)：467–472.
Catala R，Ouyang J，Abreu I A，Hu Y X，Seo H，Zhang X R，Nam H. 2007. The Arabidopsis E3 SUMO Ligase SIZ1 regulates plant growth and
drought responses. Plant Cell，19：2952–2966.
Debenner T，Linde M. 2009. Exploring complex ornamental genomes:the rose as a model plant. Critical Reviews in Plant Sciences，28：267–280.
Dinneny J R，Long T A，Wang J Y，Jung J W，Mace D，Pointer S，Barron C，Brady S M，Schiefelbein J，Benfey P N. 2008. Cell identity mediates
the response of Arabidopsis roots to abiotic stress. Science，320：942–945.
Dong C H，Jang M，Scharein B，Malach A，Rivarola M，Liesch J，Groth G，Hwang I，Chang C. 2010. Molecular association of the Arabidopsis
ETR1 ethylene receptor and a regulator of ethylene signaling，RTE1. Journal of Biological Chemistry，285 (52)：40706–40713.
Dong C H，Rivarola M，Resnick J S，Maggin B D，Chang C. 2008. Subcellular co-localization of Arabidopsis RTE1 and ETR1 supports a regulatory
role for RTE1 in ETR1 ethylene signalling. Plant Journal，53：275–286.
Frank W，Baar K M，Qudeimat E，Woriedh M，Alawady A，Ratnadewi D，Louis G，Grimm B，Reski R. 2007. A mitochondrial protein homologous
to the mammalian peripheral-type benzodiazepine receptor is essential for stress adaptation in plants. Plant Journal，51：1004–1018.
Gao Jun-ping，Zhang Xiao-hong，Huang Mian-jia，Ye Xin-min，Sun Zi-ran. 1997. A preliminary study on change patterns of ethylene production
during flower opening and senescence in cut roses. Acta Horticulturae Sinica，24 (3)：274–278. (in Chinese)
高俊平，张晓红，黄绵佳，叶新民，孙自然. 1997. 月季切花开花和衰老进程中乙烯变化类型初探. 园艺学报，24 (3)：274–278.
Guillaumot D，Guillon S，Deplanque T，Vanhee C，Gumy C，Masquelier D，Morsomme P，Batoko H. 2009. The Arabidopsis TSPO-related protein
is a stress and abscisic acid-regulated，endoplasmic reticulum-Golgi-localized membrane protein. Plant Journal，60：242–256.
Hermans C，Vuylsteke M，Coppens F，Craciun A，Inze D，verbruggen N. 2010. Early transcriptomic changes induced by magnesium deficiency in
Arabidopsis thaliana reveal the alteration of circadian clock gene expression in roots and the triggering of abscisic acid-responsive genes. New
Phytologist，187：119–131.
Kant P，Gordon M，Kant S. 2008. Functionalgenomics-based identification of genes that regulate Arabidopsis responses to multiple abiotic stresses.
Plant Cell and Environment，31：697–714.
1166 园 艺 学 报 41 卷
Klee H，Tieman D. 2002. The tomato ethylene receptor gene family：Form and function. Plant Physiology，115：336–341.
Kleine T，Kindgren P，Benedict C，Hendricksonand L，Strand A. 2007. Genome-wide gene expression analysis reveals a critical role for
CRYPTOCHROME1 in the response of Arabidopsis to high irradiance. Plant Physiology，144：1391–1406.
Kreps J A，Wu Y，Chang H S，Zhu T，Wang X，Harper J F. 2002. Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt，osmotic，and cold
stress. Plant Physiology，130：2129–2141.
Lacapere J，Delavoie F，Li H，Péranzi G，Maccario J，Papadopoulos V，Vidicet B. 2001. Structural and functional study of reconstituted peripheral
benzodiazepine receptor. Biochemical and Biophysical Research Communications，284：536–541.
Liu Q，Wen C K. 2012. Arabidopsis ETR1 and ERS1 differentially repress the ethylene response in combination with other ethylene receptor genes.
Plant Physiology，58：1193–1207.
Ma Nan，Cai Lei，Lu Wang-jin，Tan Hui，Gao Jun-ping. 2005. Exogenous ethylene influences flower opening of cut roses（Rosa hybrida）by
regulating the genes encoding ethylene biosynthesis enzymes. Science in China：Series C，35 (2)：104–114. (in Chinese)
马 男，蔡 蕾，陆旺金，谭 辉，高俊平. 2005. 外源乙烯对月季（Rosa hybrida）切花花朵开放的影响与乙烯生物合成相关基因表
达的关联. 中国科学：C 辑，35 (2)：104–114.
Ma N，Tan H，Liu X J，Xue J Q，Li Y H，Gao J P. 2006. Transcriptional regulation of ethylene receptor and CTRs genes involved in ethylene induced
flower full opening in cut rose（Rosa hybrida）cv. Samantha. Journal of Experimental Botany，57：2763–2773.
McDaniel B K，Binder B M. 2012. Ethylene receptor 1（etr1）is sufficient and has the predominant role in mediating inhibition of ethylene responses
by silver in Arabidopsis thaliana.

Journal of Biological Chemistry，287：26094–26103.
Mochizuki N，Tanaka R，Grimm B，Masuda T，Moulin M，Smith A G，Tanaka A，Terry M J. 2010. The cell biology of tetrapyrroles：A life and
death struggle. Trends Plant Science，15：488–498.
Papadopoulos V，Baraldi M，Guilarte T R，Knudsen T B，Lacapère J J，Lindemann P，Norenberg M D，Nutt D，Weizman A，Zhang M R，
Gavish M. 2006. Translocator protein（18 kDa）：New nomenclature for the peripheral-type benzodiazepine receptor based on its structure and
molecular function. Trends in Pharmacological Sciences，27：402–409.
Seki M. 2002. Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought，cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA
microarray. Plant Journal，31：279–292.
Severance S，Hamza I. 2009. Trafficking of heme and porphyrins in metazoa. Chemical Reviews，109：4596–4616.
Taketani S，Kohno H，Furukawa T，Tokunaga R. 1995. Involvement of peripheral-type benzodiazepine receptors in the intracellular transport of heme
and porphyrins. Journal of Biochemistry，117：875–880.
Tan H，Liu X H，Ma N，Xue J Q，Lu W J，Bai J H，Gao J P. 2006. Ethylene-influenced flower opening and expression of genes encoding ETRs，
CTRs，and EIN3s in two cut rose cultivars. Postharvest Biology Technology，40：97–105.
Vanhee C，Zapotoczny G，Masquelier D，Ghislainand M，Batoko H. 2011. The Arabidopsis multistress regulator TSPO is a heme binding membrane
protein and a potential scavenger of porphyrins via an autophagy-dependent degradation mechanism. Plant Cell，23：785–805.
Verma A，Nye J S，Snyder S H. 1987. Porphyrins are endogenous ligands for the mitochondrial（peripheral-type）benzodiazepine receptor.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，84：2256–2260.
Winter D，Vinegar B，Nahal H，Ammar R，Wilson G V，Provart N J. 2007. An“electronic fluorescent pictograph”browser for exploring and analyzing
large-scale biological data sets. PLoS One，2：e718.
Xue J Q，Li Y H，Tan H，Yang F，Ma N，Gao J P. 2008. Expression of ethylene biosynthetic and receptor genes in rose floral tissues during
ethylene-enhanced flower opening. Journal of Experimental Botany，59：2161–2169.
Yoshida T，Fujita Y，Sayama H，Kidokoro S，Maruyama K，Mizoi J，Shinozaki K，Yamaguchi Shinozaki K. 2010. AREB1，AREB2，and ABF3
are master transcription factors that cooperatively regulate ABRE-dependent ABA signaling involved in drought stress tolerance and require
ABA for full activation. Plant Journal，61：672–685.
Zhou X，Liu Q，Xie F，Chi K W. 2007. RTE1 is a Golgi-associated and ETR1-dependent negative regulator of ethylene responses. Plant Physiology，
145：75–86.
Zimmermann P，Hirsch H M，Hennig L，Gruissem W. 2004. Genevestigator. Arabidopsis microarray database and analysis toolbox. Plant
Physiology，136：2621–2632.