全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（2）：317–326 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–06–18；修回日期：2011–01–21
基金项目：国家自然科学基金项目（31071818）；杭州市科学技术局项目（20070232H08；20080432T06）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：pangrenshuiliang@yahoo.com.cn）
春兰 × 大花蕙兰杂种 AGL6 同源基因的克隆及
其功能研究
胡立霞 1，徐 京 1，庞基良 1,*，王利琳 1，王慧中 1，余 红 2
（1 杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州 310036；2 杭州市农业科学研究院生物技术研究所，杭州 310024）
摘 要：以春兰 × 大花蕙兰杂种试管苗形成的花蕾为材料，利用 RACE 技术克隆到 AGL6 基因的全
长 cDNA，命名为 CgAGL6（在 GenBank 中登录号为 GQ265900）。序列分析表明，CgAGL6 包含一个完整
的 ORF，长度为 729 bp，编码 242 个氨基酸；含有 AGL6 基因所共有的 2 个保守结构域 MADS-box 和 K-box。
通过蛋白序列比对，发现 CgAGL6 与玉米的 ZmZAG3、水稻的 OsMADS6 有 70%的相似性，与拟南芥的
AtAGL6 有 61%的相似性。蛋白质同源性分析表明 CgAGL6 属于 AGL6 分支中单子叶植物的分类群。将
CgAGL6 置于 CaMV 35S 启动子控制下在烟草中异位表达，转基因烟草表现出开花时间提前，雄蕊部分花
瓣化，花粉发育不良和花瓣数增多或减少等新表型，表明 CgAGL6 参与了转基因烟草开花时间的调控及
花器官的发育。
关键词：兰属；春兰 × 大花蕙兰；AGL6 同源基因；花发育
中图分类号：S 682.31 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）02-0317-10

Cloning and Functional Research of an AGL6 Homologous Gene in Hybird
of Cymbidium goeringii and Cymbidium hybirdium
HU Li-xia1，XU Jing1，PANG Ji-liang1,*，WANG Li-lin1，WANG Hui-zhong1，and YU Hong2
（1College of Life and Environment Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China；2Institute of
Biotechnology，Hangzhou Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310024，China）
Abstract：Full-length cDNA of CgAGL6（GenBank accession number GQ265900）was cloned from
the floral bud of hybird of Cymbidium goeringii and C. hybirdium by rapid amplification of cDNA ends
（RACE）technology. The cDNA sequence harbored an open reading frame（ORF）encoding 242 amino
acids. Bioinformatics analysis indicated that CgAGL6 has two conserved domains as other AGL6 proteins：
MADS-box and K-box. CgAGL6 are similar to GenBank accession L46397（Zea mays），U78782（Oryza
sativa）and M55554（Arabidopsis thaliana）with homology of 70%，70% and 61% respectively. Transgenic
tobacco plants ectopically expressing CgAGL6 exhibited novel phenotypes with plant size reduced
significantly，flowering early，widely homeotic conversion of stamens into petal-like structures，
hypogenesis of pollen，number addition or reduction of petals. These results indicated that CgAGL6 was
involved in the regulation of flower transition and flower organ development.
Key words：Cymbidium goeringii；C. hybirdium；AGL6 homologous gene；flower development

318 园 艺 学 报 38 卷
兰科植物具有很高的观赏价值，但营养生长期较长，有些品种长达 13 年才能开花（Arditti，1992），
给杂交育种及花发育研究造成困难。通过调整兰花组织培养基中的营养（Kostenyuk，1999）和激素
水平（王熊 等，1981；王熊，1984；Duan & Yazawa，1995；王光远 等，1997）等可大大缩短营养
生长期，诱导提前开花。春兰 × 大花蕙兰杂种的原球茎在添加 6-BA 和 NAA 的培养基上继代培养 2
个月即可形成花蕾（郑立明和庞基良，2006），这为克隆兰花发育基因提供了较好的试验材料和试验
系统。
目前通过对拟南芥（Arabidopsis thaliana）、金鱼草等的研究发现植物花时调控主要有 4 条途径：
光周期途径、春化途径、自主途径和 GA 途径（Boss et al.，2004），并提出多个花器官发育的模型，
如 ABC 模型（Coen & Meyerowitz，1991）、ABCDE 模型和四重奏模型（Theissen & Saedler，2001）。
AGL6（AGAMOUS like 6）基因既调节开花早晚，又调节花器官发育，目前已从麻竹（田波 等，2005）、
风信子（樊金会 等，2007）、矮牵牛（Rijpkema et al.，2009）、水稻（Ohmori et al.，2009）等植物
中克隆到了 AGL6 基因。通过转基因研究证实，AGL6 类基因的异位表达能够激活 FT、SOC1、LFY、
SEP1 和 AG 等基因的表达（樊金会 等，2007），引起植株矮小、开花提前和花器官的同源转化等。
随着对兰花花发育研究的不断深入，已从兰花的不同组织中鉴定和分离了一些与花发育相关的
基因。Hsu 和 Yang（2002）从文心兰中分离得到了 B 类基因 OMADS3。Hsu 等（2003）从兰花中克
隆到一个 MADS-box 基因 OMADS1，是兰花 AGL6 同源基因。Tsai 等（2004）从蝴蝶兰中分离鉴定
得到 4 个 B 类功能基因（PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4 和 PeMADS5）；郭滨等（2006）从蝴蝶
兰中克隆到拟南芥 PI 的同源基因。Chang 等（2009）从文心兰（Oncidium Gower Ramsey）中分离
了 4 个具有 AP1/AGL9 功能的 MADS-box 基因 OMADS6、OMADS7、OMADS10 和 OMADS11。
目前 AGL6 基因的功能已经引起比较广泛的注意，Melzer 和 Wang（2010）还把 AGL6 基因定为
控制花发育基因调节网络的 4 个中心参与者（SQUA-like，DEF/GLO-like，AG-like，AGL6/SEP1-like）
之一，但是对它的了解仍然很少。本研究中以春兰 × 大花蕙兰杂种试管苗分化形成的花蕾为材料，
取材方便，缩短周期，通过 RACE 基因克隆，从该材料中克隆了一个属于 AGL6 亚家族的 MADS-box
基因 CgAGL6，并将该基因转化烟草，对其功能进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料及其 RNA 的提取和逆转录
春兰 × 大花蕙兰杂种原球茎在添加 1.0 mg · L-1 6-BA 和 0.1 mg · L-1 NAA 的 MS 培养基上继代
培养 3 个月后，分化形成花蕾。采用异硫氰酸胍法（GT）提取花蕾（直径约 5 mm）组织的总 RNA，
取 2 μg RNA，使用 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（ToYoBo，Code：FSK-100）合成 cDNA，
然后进行 RACE、RT-PCR 等。
1.2 CgAGL6 基因克隆
1.2.1 中间片段克隆 比对拟南芥（Arabidopsis thaliana）、百脉根（Lotus corniculatus L.）、大豆
（Glycine max）等 AGL6 类基因 mRNA 序列，根据保守序列设计基因中间段的一对引物（上海生工
公司合成，CgAGL601：5′GAGCTGAAGAGGATAGAGAACAAGA3′；CgAGL602：5′GACACTTCTT
GGTACCAGCTCTG3′）。以花蕾的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，PCR 条件为 94 ℃ 5 min；94 ℃ 45
s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃，10 min。得到中间片段后，利用 DNA 胶回收试剂盒
回收，连接到 pMD18-T 测序载体，送上海生工公司测序。
2 期 胡立霞等：春兰 × 大花蕙兰杂种 AGL6 同源基因的克隆及其功能研究 319

1.2.2 3′端的克隆 根据中间片段序列，设计两个 5′端巢式引物与 RACE 试剂盒（TaKaRa，5′-Full
RACE Kit，Code D315）所带引物形成嵌套，按照试剂盒方法以第一链 cDNA 为模板进行 3′RACE，
将 PCR 扩增产物回收后，连接到 pMD18-T 测序载体后，送上海生工公司测序。两个 5′端巢式引物
为：CgAGL603（Outer）：5′ATGAGTTCGGCAGTGCTGGTACA3′，CgAGL604（Inner）：5′CGCG
GATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3′，试剂盒所带引物：3RACE（Outer）：5′TACCGTCGTT
CCACTAGGATTT3′，3RACE（Inner）：5′CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3′。
1.2.3 5′端的克隆 根据已知的中间序列，设计两个 3′端巢式引物与 RACE 试剂盒所带引物形成嵌
套。以第一链 cDNA 为模板按照试剂盒方法进行 5′ RACE，将 PCR 扩增产物回收后，连接到 pMD18-T
测序载体后，送上海生工公司测序。两个 3′端巢式引物为：CgAGL605（Outer）：5′CGCGGATCCAC
AGCCTACTGATGATCAGTCGATG3′，CgAGL606（Inner）：5′GGAATTGGTAGCTTGAGAATTGAG3′。
试剂盒所带引物：5RACE（Outer）：5′CATGGCTACATGCTGACAGCCTA3′；5RACE（Inner）：
5′CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG3′。
1.2.4 基因全长的克隆 用 DNAstar 软件拼接所得的 3 段序列（中间序列、3′端序列和 5′端序列），
根据拼接结果，在两端设计基因的特异性引物，进行全长 PCR 扩增，将 PCR 扩增产物回收后，连
接到 pMD18-T 测序载体后，送上海生工公司测序。全长引物为：CgAGL607：5′TCAGTCGATGGAAAG
AGAAA3′，CgAGL608：5′GCAGCTAAGTTCAGCTTTTG3′。
1.3 序列的生物信息学分析
通过 NCBI 网站（http：//www. ncbi. nim. nih. gov/）进行核苷酸序列比对（Blastn）和氨基酸序
列比对（Blastp）；用 DNAman 4.0 进行氨基酸序列比对分析；用 MEGA 3.1 进行进化树分析。
1.4 CgAGL6 器官特异性表达分析
春兰 × 大花蕙兰杂种试管苗培养在组织培养室（25 ℃，12 h 光照），花蕾形成 5 d 时提取试管
苗不同组织的总 RNA，反转录后得到不同组织的 cDNA，然后进行 CgAGL6 器官特异性表达的
RT-PCR 分析。PCR 条件为 94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s， 72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃，10
min，RT-PCR 引物用全长引物；Actin 的引物为 ActinF：5′GGAGAAGATCTGGCATCACA3′，ActinR：
5′CCTCCAATCCAGACACTGTA3′。
1.5 CgAGL6 的载体构建和烟草转化
质粒 pBS-35S 用 EcoRⅠ和 SacⅠ双酶切，得到含 CaMV35S 启动子、终止子及多克隆位点的大
片段，将该大片段与质粒 pBIN19 经过 EcoRⅠ和 SacⅠ双酶切后的载体片段连接，得到 pBIN19-35S。
利用 XbaⅠ和 SalⅠ双酶切将 CgAGL6 从测序载体 pMD18-T 上切下，与 pBIN19-35S 经过 XbaⅠ和
SalⅠ双酶切后的载体片段连接，得到终载体 pBIN19-35S-CgAGL6。构建过程中质粒 DNA 小量提取、
酶切、片段回收均参照试剂盒（上海生工公司产品）说明书进行。
使用冻融法（参考分子克隆实验指南第二版）将 pBIN19-35S-CgAGL6 表达载体导入根癌农杆
菌 GV3101 中，用叶盘法转化烟草（品种为‘黄苗鱼’），在含 80 μg · mL-1 卡那霉素的 MS 培养基
上筛选幼苗，转基因阳性苗经过炼苗后，移栽至花盆中，栽培基质为泥炭︰珍珠岩 = 3︰1，培养在
人工气候室，24 ℃，12 h/18 ℃，12 h。
转基因烟草苗（T0 代）移栽 30 d 后，对 17 株转基因烟草的叶片进行了 CgAGL6 的 RT-PCR 分
析。分别于转基因烟草苗移栽 60、65、70 和 75 d 后，统计花芽分化率，并仔细观察各种花器官的
形态变化。对解剖后的花器官在 ZEISS 体视显微镜（Zeiss Stemi 2000-C）下观察、拍照。转基因烟
320 园 艺 学 报 38 卷
草及野生型烟草的成熟花粉用醋酸洋红染色，在 ZEISS（Axio Imager. A1）显微镜下观察并拍照。
2 结果与分析
2.1 CgAGL6 基因序列
根据 AGL6 保守序列设计引物，以春兰 × 大花蕙兰杂种花蕾 cDNA 为模板，扩增得到一个 263
bp 的中间片段（图 1，A），Blastn 分析表明，该片段与多种植物 AGL6 基因有较高的相似性。用 RACE
法分别获得 3′端 838 bp（图 1，B）和 5′端 294 bp（图 1，C）的目的片段，最后通过序列拼接并设
计全长引物扩增得到全长为 1 112 bp 序列（图 2）。
图 1 CgAGL6 基因中间片段（A）、3′ RACE（B）和 5′ RACE（C）的克隆结果
M. Marker Ⅲ；1. 阴性对照；2. 目的片段。
Fig. 1 The cloning of the middle fragment（A），3′ RACE（B），5′ RACE（C）of CgAGL6 gene
M. Marker Ⅲ；1. Control；2. The purpose fragment.
























图 2 春兰 × 大花蕙兰 CgAGL6 基因 mRNA 序列和推测的氨基酸序列
ATG 为起始密码子；TAG 为终止密码子；横线表示加尾信号；箭头表示 poly(A)。
Fig. 2 Sequence of Cymbidium goeringii × C. hybirdium’s CgAGL6 and its deduced amino acid sequence
ATG is start codon；TAG is stop codon；The underline indicated signal of adding poly A tail；Arrowhead indicated poly A tail.
2 期 胡立霞等：春兰 × 大花蕙兰杂种 AGL6 同源基因的克隆及其功能研究 321

序列分析发现，该序列包含翻译起始密码子（ATG）和终止密码子（TAG），ORF 长度为 729 bp；
在序列 3′端有一长 217 bp 的非编码区，含有植物中典型的加尾信号 G/AATAA1-3 序列和 poly(A)23
序列。因此该序列具有一个完整的基因序列所具备的特征。进一步分析发现，该序列编码的氨基酸
序列在 N 端第 1 ~ 61 个氨基酸处有一 MADS-box 结构域，在中间区域第 86 ~ 176 个氨基酸处有一
K-box 结构，而 MADS-box 和 K-box 正是 AGL6 基因所共同具有的保守结构域。Blastp 分析发现，
该序列与玉米的 ZmZAG3 和水稻的 OsMADS6 有 70%的相似性；与拟南芥的 AtAGL6 有 61%的相
似性；用 DNAman 软件对氨基酸序列进行比对发现，该序列的 MADS-box 和 K-box 结构与其他物
种如矮牵牛、水稻、金鱼草、豌豆、烟草和拟南芥等的 AGL6 基因相似性较高（图 3）。据此，将该
基因命名为 CgAGL6，GenBank 登录号为 GQ265900。

图 3 CgAGL6 与不同物种 AGL6 亚族蛋白之间的比较
Fig. 3 Multiple secquence alignment of CgAGL6 homologous proteins

322 园 艺 学 报 38 卷
用 MEGA 3.1 软件构建了 AGL6 基因的系统发育树（图 4）。AP1/AGL9 亚家族分成 3 个分支，
SEP，AGL6 和 AP1，而且 AGL6 分支与 SEP 分支为姊妹关系（樊金会 等，2007）。从图 4 中可以
发现，CgAGL6 属于 AGL6 分支中单子叶植物的分类群，与水稻和玉米 AGL6 基因同源性较高。

图 4 CgAGL6 与选择的 AGL6 亚族组蛋白之间的进化树
系统发育树分析及多序列比对所涉及到的有关基因序列如下：拟南芥的 SEP1（M55551）、SEP2（M55552）、SEP3（AY850180）、AGL3（U81369）、
AGL6（M55554）、AGL8（U33473）、AGL13（U20183）、CAL（NM_102395）和 AP1（Z16421）；金鱼草的 AmDEFH49（X95467）、
AmDEFH72（X95468）、AmDEFH200（X95469）和 AmSQUA（X63701）；烟草的 NsMADS3（AF068722）；玉米的 ZmZAG3
（L46397）和 ZmZAG5（L46398）；豌豆的 PsPEAMTF1（AJ223318）；矮牵牛的 PhFBP2（M91666），
水稻的 OsMADS8（U78892）、OsMADS45（U31994）和 OsMADS6（U78782）。
Fig. 4 Phylogenetic analysis of several plant AGL6 proteins and CgAGL6
The gene members of AGL6 group listed in the tree are as follows：SEP1（M55551），SEP2（M55552），SEP3（AY850180），AGL3（U81369），
AGL6（M55554），AGL8（U33473），AGL13（U20183），CAL（NM_102395）and AP1（Z16421）from Arabidopsis thaliana；
AmDEFH49（X95467），AmDEFH72（X95468），AmDEFH200（X95469）and AmSQUA（X63701）from Antirrhinum majus；
NsMADS3（AF068722）from Nicotiana sylvestris；ZmZAG3（L46397）and ZmZAG5（L46398）from Zea mays；
PsPEAMTF1（AJ223318）from Pisum sativum；PhFBP2（M91666）from Petunia hybrida；OsMADS8（U78892），
OsMADS45（U31994）and OsMADS6（U78782）from Oryza sativa.

2.2 CgAGL6 基因的器官特异性表达
如图 5 所示，在根、茎、叶等营养组织中检测不到 CgAGL6 的表达；在花器官中，CgAGL6 主
要在花萼中表达，在花瓣和合蕊柱中有少量表达；在药帽（雄蕊）中未检测到 CgAGL6 的表达。这
种花器官中特异的表达模式明显地预示着 CgAGL6 可能在特定花器官发育中起调控作用。
图 5 春兰 × 大花蕙兰 CgAGL6 基因在各组织表达的 RT-PCR 分析
1. 根；2. 茎；3. 叶；4. 花萼；5. 花瓣；6. 药帽；7. 合蕊柱。
Fig. 5 Tissue-specific expression of the CgAGL6 gene by RT-PCR analysis in Cymbidium goeringii × C. hybirdium
1. Roots；2. Stems；3. Leaves；4. Sepals；5. Petals；6. Anther cap；7. Column.
2 期 胡立霞等：春兰 × 大花蕙兰杂种 AGL6 同源基因的克隆及其功能研究 323

2.3 转 CgAGL6 基因烟草的表型分析
将 CgAGL6 的编码区置于 35s 启动子的调控下转化烟草，对得到的 17 株转基因烟草植株进行了
CgAGL6表达的RT-PCR检测。结果如图 6所示，在 17株转基因植株中，12株在叶片中检测到CgAGL6
的强表达，在野生型烟草植株的叶片中未检测到 CgAGL6 的表达，这说明 CgAGL6 已经整合进烟草
基因组并成功表达。
图 6 转 CgAGL6 烟草的 RT-PCR 检测
1 ~ 12 为转基因植株；13 为野生型植株。
Fig. 6 RT-PCR analysis of CgAGL6 transformed tobacco
1–12. Transformed tobacco；13. Wild type.

由表 1 可见，转基因烟草苗移栽 60 和 65 d 的花芽分化率分别为 58.8%和 70.6%，而此时野生型
的花芽分化率为零；转基因烟草苗移栽 70 和 75d 的花芽分化率分别为 76.5%和 100%，而此时野生
型的花芽分化率均为 12.5%。此外转基因烟草的平均花芽开放数显著多于野生型，转基因烟草的平
均株高低于野生型（图 7，G）；这些结果说明 CgAGL6 转化的烟草显著提早开花。
表 1 移栽后转基因烟草的花时及株形变化
Table 1 Changes of flower time and plant morphology of CgAGL6 transformed tobaccos after transplanting
花芽形成率/%
Frequency of floral bud formation 植株 Plants
60 d 65 d 70 d 75 d
75 d 时开花数
Average number of
blooming flowers
75 d 时株高/cm
Average height
75 d 时叶片数
Average number
of leaves
转基因 Transformed 58.8 70.6 76.5 100 6 64.5 20.4
野生型 Wild type 0 0 12.5 12.5 1.4 86.3 21.1

野生型烟草的花有 5 枚花萼、5 枚花瓣、5 枚雄蕊和 1 枚雌蕊（图 7，A）。如表 2 所示，转 CgAGL6
烟草的花出现了 5 种新的表型：（1）四瓣花，花萼、花瓣、雄蕊均只有 4 枚（图 7，B），出现频率
为 15.4%；（2）六瓣花，花萼、花瓣、雄蕊均有 6 枚（图 7，C），出现频率为 24.6%；（3）花中有
一枚雄蕊花瓣化，5 枚雄蕊中有 1 枚雄蕊的花丝上长出花瓣样结构（图 7，D），出现频率为 32.3%；
（4）花中有 2 枚雄蕊花瓣化，5 枚雄蕊中有 2 枚雄蕊的花丝上长出花瓣样结构（图 7，E），出现频
率为 24.6%；（5）花中有 3 枚雄蕊花瓣化，5 枚雄蕊中有 3 枚雄蕊的花丝上长出花瓣样结构（图 7，
F），出现频率为 24.6%。
雄蕊花瓣化的花瓣均向内卷曲，在体视显微镜下观察，发现雄蕊上形成的花瓣样结构有两种产
生方式，一种是在花药下部的花丝上长出，另一种是在花丝的顶端、贴着花药长出（图 7，I）。
表 2 移栽 70 d 时转基因烟草花型的变化
Table 2 Change of flower types of CgAGL6 transformed tobaccos on 70th day after transplanting
花型
Flower type
统计总花数
Number of flowers
counted
出现表型变化的花数
Number of flowers with
changed phenotypes
表型出现的频率/%
Frequency of novel
四瓣花 With four petals 65 10 15.4
六瓣花 With six petals 65 16 24.6
一枚雄蕊花瓣化花 With one petal-like stamen 65 21 32.3
二枚雄蕊花瓣化花 With two petal-like stamens 65 16 24.6
三枚雄蕊花瓣化花 With three petal-like stamens 65 16 24.6
324 园 艺 学 报 38 卷
将雄蕊花瓣化的花粉及野生型的花粉经醋酸洋红染色后，在显微镜下观察，发现野生型烟草的
花粉是规则饱满的圆球状，萌发孔清晰可见（图 7，J）；而雄蕊花瓣化的花粉形状不规则、雏缩，
有的呈菱形，有的呈三角形（图 7，K、L）。以上结果表明，转化 CgAGL6 基因，不仅影响烟草的
花时，还影响烟草花器官的发育，特别是花瓣和雄蕊的发育。

图 7 异位表达 CgAGL6 烟草转化植株的表型
A. 野生型烟草开放的花，具有 5 枚花萼、5 枚花瓣、5 枚雄蕊，1 枚雌蕊。B ~ F. 转化 CgAGL6 烟草开放花的各种表型。
B. 四瓣花，花萼、花瓣、雄蕊均只有 4 枚；C. 六瓣花，花萼、花瓣、雄蕊均有 6 枚；D. 1 枚雄蕊花瓣化；E. 2 枚雄蕊花瓣化；
F. 3 枚雄蕊花瓣化，雄蕊花瓣化的花瓣均向内卷曲；G. 转化 CgAGL6 与野生型烟草，a、b 为已开花的转化 CgAGL6 植株，
c 为未开花的野生型植株；H. 野生型烟草雄蕊，花药着生在花丝的顶端，无花瓣样结构；I. 转化 CgAGL6 烟草雄蕊，
a 在花药下部的花丝上长出了花瓣样的结构，b 和 c 在花丝的顶端、贴着花药长出了花瓣样的结构；
J. 野生型烟草花粉，规则饱满的圆球状，萌发孔清晰可见，200 ×；K、L. 转 CgAGL6 烟草
的花粉，皱缩、形态多变，有的呈菱形，有的呈三角形。J ~ L. 200 ×。
Fig. 7 Phenotypes analysis of tobacco of CgAGL6 ectopic expression
Flower of wild tobacco with five sepals，five petals，five stamens and one pistil；B–F. Phenotypes of transgenic tobacco plants ectopically expressing
CgAGL6. B. Flowers with four petals，the numbers of sepal，petal and stamen are all four；C. Flowers with six petals，
the numbers of sepal，petal and stamen are all six；D. Flowers with one petal-like stamen；E. Flowers with two petal-like stamens；
F. Flowers with three petal-like stamens，both of the petal-like stamens are involution；G. Comparison of transgenic and wild
type tobacco，a，b is CgAGL6 ectopic expression of tobacco flowering，c is wild tobacco；H. Stamens of wild tobacco，
anther on the top of filament，no petal-like stamen structure；I. Stamens of transgenic tobacco，a shows petal-like
stamen structure on lower part of filaments，b and c shows petal-like stamen structure on the top of filaments；
J. Pollens of wild type tobacco，ball-type and fulfilled，germination aperture is clearly visible，200 ×；
K and L are pollens of transgenic tobacco，shrinkage，some are diamond
and some are triangle. J–L. 200 ×.
2 期 胡立霞等：春兰 × 大花蕙兰杂种 AGL6 同源基因的克隆及其功能研究 325

3 讨论
目前已经从一些物种中克隆到了 AGL6 亚家族基因，但是由于 AGL6 单基因的失活不能引起明
显的表型变化（Rijpkema et al.，2009），AGL6 的具体功能至今仍不清楚。不同植物 AGL6 亚家族基
因主要在花芽和花器官中表达，但是其在花器官中的表达模式显示出在同一分类群中具相似性，而
不同类群之间却存在着不少差异，如：拟南芥 AtAGL6 在拟南芥的四轮花器官中均有表达（Mouradov
et al.，1998），而玉米 ZmZAG3 在雌雄花序及心皮中表达（Mena et al.，1995）；水稻 OsMADS6 早期
在花分生组织表达，后在内稃、浆片、心皮、珠被、花托中表达（Li et al.，2009）；文心兰 OMADS1
在花序分生组织、花梗及心皮中表达（Hsu et al.，2003）。看来，AGL6 基因并不仅仅表达于与花有
关的部位，也有表达于营养器官，但表达于生殖器官、组织还是主要的。罗云汝（2009）对蝴蝶兰
AGL6 基因在花发育作用的研究报告中认为，AGL6 基因可能调控原始细胞定向分化。Carlsbecker
等（2004）在研究 LFY 和 DAL1（AGL6 亚族基因）活性在白云杉茎的纵向分布时指出 LFY 活性是
均匀分布的，DAL1 活性则与茎从下向上的生理、形态梯度相平行，认为 DAL1 在植株由幼年向成
年转变中起作用。吴东等（2009）对棉花成花的研究中指出，GhMADS-13（AGL6 亚组基因）在花
诱导和花器官发育中起重要作用。这种 AGL6 基因在花的专一表达模式及其多样性，既说明 AGL6
类基因的基本功能与控制开花时间和花器官发生、发育有关，又说明在不同植物中，AGL6 类基因
在 4 轮花器官的命运决定中起不同作用。本试验中 CgAGL6 主要在花器官中表达，这与其他植物
AGL6 基因是相似的，但是在四轮花器官中，CgAGL6 只在花萼、花瓣和合蕊柱表达，在药帽中却没
有表达，说明 CgAGL6 在调控春兰 × 大花蕙兰的花器官发育中有其独特的表现。
转基因是研究基因功能的一种重要手段。近年来从兰科植物中克隆到两个 AGL6 亚族基因
OMADS1（Hsu et al.，2003）和 OMADS7（Chang et al.，2009），并对其功能进行了研究。35S：：OMADS1
和 35S：：OMADS7 转基因植株表现出株型矮小，开花时间提前，雄蕊部分花瓣化等表型；本试验中，
35S：：CgAGL6 转基因烟草也出现了相似的表型，这表明这些表型是大多数 AGL6 亚族基因异位表
达所共有的。Hsu 等（2003）对 OMADS1 的研究发现，在转 35S：：OMADS1 拟南芥中，花时基因
FT，SOC1 和花分生组织特性基因 LFY，AP1 的表达明显上调，表明在拟南芥中 OMADS1 作为 FT
和 SOC1 的促进因子影响了花的起始和开花转变。樊金会等（2007）将风信子 HoAGL6 转入拟南芥
中，发现转基因拟南芥中的 SOC1、LFY、AG、SEP1 等基因被激活，认为这可能是转基因植株提前
开花的原因。因此，本试验中转 CgAGL6 阳性苗可能由于 CgAGL6 的超表达激活了转基因烟草中的
一些开花决定的基因（如 SOC1、LFY），导致转基因烟草开花提前，说明 CgAGL6 基因在转基因烟
草中参与了开花时间和花器官决定等过程的调控。AGL6 与 AP1 和 SEPs 具有相似的功能（Alvarez-
Buylla et al.，2000），樊金会等（2007）提出花器官决定的动态聚合模型，认为 AP1，AP3/PI，SEP
和 AGL6 共同作用可以充分地决定花瓣；HoAGL6 在矮牵牛中超表达，在离体条件下使所有的叶片
变成花瓣结构（Rijpkema et al.，2009）。本研究中转化 CgAGL6 的烟草出现较高频率的雄蕊部分花
瓣化现象，一方面可能由于 CgAGL6 在第三轮起 AP1 类似的作用，抑制了 C 类基因的功能；另一方
面，CgAGL6 直接参与花瓣的决定，从而促进雄蕊向花瓣转化，同时又影响了花粉的发育。

References
Alvarez-Buylla E R，Pelaz S，Liljegren S J. 2000. An ancestral MADS-box gene duplication occurred before the divergence of plants and animals.
Proc Natl Acad Sci USA，97：5328–5333.
Arditti J. 1992. Fundamentals of orchid biology. New York：John Wiley & Sons：323–325.
Boss P K，Bastow R M，Mylne J S. 2004. Multiple pathways in the decision to flower：Enabling，promoting，and resetting. Plant Cell，16：18–31.
326 园 艺 学 报 38 卷
Carlsbecker A，Tandre K，Johanson V. 2004. The MADS-box gene DAL1 is a potential mediator of the juvenile-to-adult transiotion in Norway spruce
（Picea abies）. Plant J，40：546–557.
Chang Y Y，Chiu Y F，Wu J W. 2009. Four orchid（Oncidium Gower Ramsey）AP1/AGL9-like MADS box genes show novel expression patterns and
cause different effects on floral transition and formation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol，50 (8)：1425–1438.
Coen E S，Meyerowitz E M. 1991. The war of the whorls：Genetic interactions controlling flower development. Nature，353：31–37.
Duan J X，Yazawa S. 1995. Floral induction and development in Phalaenopsis in vitro. Plant Cell Tiss Org Cult，43：71–74.
Fan Jin-hui，Li Wen-qing，Dong Xiu-chun. 2007. Ectopic expression of a hyacinth AGL6 homolog caused earlier flowering and homeotic conversion
in Arabidopsis. Sci Chin：Ser C，37：466–478. (in Chinese)
樊金会，李文卿，董秀春. 2007. 风信子 AGL6 同源基因在拟南芥中异位表达引起提早开花和器官同源转化.中国科学：C 辑，37：466–478.
Guo Bin，Chen Dong-hong，Dai Wei. 2006. Cloning and expression analysis of a Phalaenopsis flowering-related gene pPI9. Journal of Fudan
University：Natural Science，45：277–282. (in Chinese)
郭 滨，陈东红，戴 薇. 2006. 蝴蝶兰花发育相关基因 pPI9 的克隆与表达分析. 复旦学报：自然科学版，45：277–282.
Hsu H F，Yang C H. 2002. An orchid（Oncidium Gower Ramsey）AP3-like MADS gene regulates floral formation and initiation. Plant Cell Physiol，
43 (10)：1189–1209.
Hsu H F，Huang C H，Chou L T. 2003. Ectopic expression of an orchid（Oncidium Gower Ramsey）AGL6-like gene promotes flowering by activating
flowering time genes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol，44：783–794.
Kostenyuk I. 1999. Induction of early flowering in Cymbidium niveo-marginatum Mak in vitro. Plant Cell Reports，19：1–5.
Li H，Liang W，Jia R. 2009. The AGL6-like gene OsMADS6 regulates floral organ and meristem identities in rice. Cell Res，20：299–313.
Luo Yun-ru. 2009. Characterization of AGL6-like genes involved in perianth development of Phalaenopsis spp.[M. D. Dissertation]. Taiwan：
National Cheng Kung University.
罗云汝. 2009. AGL6-like 基因参与蝴蝶兰花发育之探讨[硕士论文]. 中国台湾：国立成功大学.
Melzer R，Wang Y Q. 2010. The naked and the dead：The ABCs of gymnosperm reproduction and the origin of the angiosperm flower. Seminar Cell
Dev Biol，21：118–128.
Mouradov A，Glassick T V，Hamdorf B A. 1998. Family of MADS-box genes expressed in early male and female reproductive structures of
Monterey Pine. Plant Physiol，117：55–61.
Mena M，Mandel M A，Lerner D R. 1995. A characterization of the MADS-box gene family in maize. Plant J，8：845–854.
Rijpkema A S，Zethof J，Gerats T. 2009. The petunia AGL6 gene has a SEPALLATA-like function in floral patterning. The Plant Journal，60：1–9.
Ohmori S，Kimizu M，Sugita M，Miyao A，Hirochika H，Uchida E，Nagato Y，Yoshida H. 2009. MOSAIC FLORAL ORGANS1，an AGL6-like
MADS box gene，regulates floral organ identity and meristem fate in rice. Plant Cell，21(10)：3008–3025.
Theissen G，Saedler H. 2001. Floral quartets. Nature，409：469–471.
Tsai W C，Kuoh C S，Chuang M H. 2004. Four DEF-like MADS box genes displayed distinct floral morphogenetic roles in Phalaenopsis orchid.
Plant Cell Physiol，45 (7)：83l–844.
Tian Bo，Chen Yong-yan，Yan Yuan-xin. 2005. Isolation and ectopic expression of a bamboo MADS-box gene. Chinese Science Bulletin，50 (2)：
145–151. (in Chinese)
田 波，陈永燕，严远鑫. 2005. 一个竹类植物 MADS 盒基因的克隆及其在拟南芥中的表达. 科学通报，50 (2)：145–151.
Wang Xiong，Chen Ji-chu，Liu Gui-yun. 1981. Clonal propagation of orchids by means of tissue culture. Acta Phytophysiol Sin，7 (2)：203–206. (in Chinese)
王 熊，陈季楚，刘桂云. 1981. 建兰和秋兰圆球茎的发生及其无性系的建立. 植物生理学报，7 (2)：203–206.
Wang Xiong. 1984. Studies on the orchid clonal propagation and floral bud diferentiation by means of tissue culture. Acta Phytophysiol Sin，10 (4)：
391–396. (in Chinese)
王 熊. 1984. 兰花快速无性繁殖系的建立及花芽分化的探讨. 植物生理学报，10 (4)：391–396.
Wang Guang-yuan，Xu Zhi-hong，Cai De-fa.1997. In vitro flowering of Dendrobium candidum. Sci Chin：Ser C，27 (3)：229–234. (in Chinese)
王光远，许智宏，蔡德发. 1997. 铁皮石斛的离体开花. 中国科学：C 辑，27 (3)：229–234.
Wu Dong，Yu Shu-xun，Fan Shu-li. 2009. Cloning and expression analysis of a MADS-box protein gene（GhMADS-13）from upland cotton.
Genomics Appl Biol，28：223–228.
吴 东，喻树迅，范术丽. 2009. 棉花 MADS-box 蛋白基因（GhMADS-13）的克隆和表达分析. 基因组学和应用生物学，28：223–228.
Zheng Li-ming，Pang Ji-liang. 2006. In vitro flowering of cultures from a hybird of Cymbidium goeringii and C. hybirdium. Journal of Plant
Physiology and Molecular Biology，32 (3)：320–324. (in Chinese)
郑立明，庞基良. 2006 .春兰 × 大花蕙兰杂种试管苗开花现象. 植物生理与分子生物学学报，32 (3)：320–324.