全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（1）：69–78 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–10–30；修回日期：2012–12–19
基金项目：国家自然科学基金项目（30900986）；重庆市自然科学基金项目（2009BB1298）；西南大学博士基金项目（SWUB2008042）；
中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2010B010，XDJK2009C126）
**共同第一作者；* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gaoqg2004031@163.com；zhuliquan@swu.edu.cn）
自交不亲和甘蓝亲和花粉授粉早期差异蛋白质
分析
陈 松 1，曾 静 1,**，高启国 2,*，朱利泉 1,*，刘豫东 2，任雪松 2，王小佳 2
（1 西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716；2 西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重
庆 400716）
摘 要：为从蛋白质的角度揭示自交不亲和甘蓝亲和授粉早期花粉与柱头相互作用，将蛋白质组学
方法应用于自交不亲和性甘蓝柱头与亲和花粉互作早期差异蛋白质的研究。结果表明，亲和授粉后 3 ~ 5
min 与 1 h 对比，有 116 个差异蛋白质点，而授粉后 1 h 与 2 h 差异不显著。按照特异表达与变化量大的
蛋白质点优先原则，初步选取差异点中 71 个点做质谱分析，鉴定出 31 个可信差异蛋白质。与亲和授粉
后 3 ~ 5 min 组相比，1 h 组中特异表达蛋白质有 19 个，上调表达 9 个，下调表达 3 个。31 种蛋白质的生
物信息学分析表明，有两种蛋白与前人发现的与花粉管在柱头中生长发育相关蛋白相同，其他 29 种参与
包括胁迫与防御应答在内多种生理过程。对早期差异蛋白中这种“既有促进花粉管发育的蛋白，也有与
防御相关蛋白”现象分析表明，花粉管生长性侵入柱头的过程有可能伴随着柱头抗性的提高。
关键词：甘蓝；授粉；花粉—柱头相互作用；蛋白质组学；双向电泳
中图分类号：S 635 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）01-0069-10

Differential Proteomic Analysis of Brassica oleracea Stigma and Pollen
Proteins During the Early Stage of Compatible Pollination
CHEN Song1，ZENG Jing1,**，GAO Qi-guo2,*，ZHU Li-quan1,*，LIU Yu-dong2，REN Xue-Song2，and
WANG Xiao-jia2
（1College of Agronomy and Biotechnology，Southweat University，Chonqging 400716，China；2College of Horticulture and
Landscape Architecture，Southwest University，Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，
Ministry of Education，Chongqing 400716，China）
Abstract：In order to study the early pollen-stigma interaction in Brassica oleracea through proteomics
analysis，inbred line A4 was pollinated with inbred line K101. Total stigma/pollen proteins were extracted by
TCA/acetone at 3–5 min，1 h and 2 h after pollination，respectively. Total proteins were separated by
two-dimensional gel electrophoresis and analyzed through MALDI-TOF-TOF-MS mass spectrometry. 116
proteins were differentially expressed contrasted the total stigma/pollen proteins of 1 h and 3–5 min after
pollination，but only 7 proteins expressed differentially contrasted the total stigma/pollen proteins of 1 h and
2 h after pollination. 71 protein spots were analyzed through MALDI-TOF-TOF-MS mass spectrometry，and

70 园 艺 学 报 40 卷
31 proteins were identified homologous to known proteins by MASCOT analysis. Compared with total stigma/
pollen proteins of 3–5 min after pollination，19 of 31 identified proteins were specifically expressed 1 h
after pollination，9 up-regulated and 3 down-regulated ones. The predicted functions of the 31 protein were
related to pollen tube development，Ca2+ binding，biosynthetic process，ransmembrane transport，defense
response，protein folding，carbohydrate and energy metabolism，regulation of translation and methylation.
This study has documented the dynamics of protein expression during the early pollen-stigma interaction
in Brassica oleracea and provides insights into the fundamental mechanisms involved in these processes.
Key words：Brassica oleracea L.；pollination；pollen-stigma interaction；proteomics；2-DE

甘蓝等芸薹属作物属于典型孢子体型自交不亲和，通常有一个干性柱头，只有亲和花粉落到柱
头后能诱导柱头释放花粉水化、萌发所需水分和其它因子，不亲和花粉落到柱头后则在水化前或者
穿过柱头前就被抑制（Samuel et al.，2008）。甘蓝自交不亲和性（Self-incompatibility，SI）受单一
的 S 位点控制，自花花粉落到柱头后，花粉 SCR 与柱头 SRK 胞外域结合，使其释放原本结合在 SRK
激酶域的类硫氧还蛋白（Thioredoxin-like protein，THL1/THL2），激活 SRK，使其发生自动磷酸化，
随后与 ARC1 作用，进而经过一个目前尚未完全知晓的途径继续传递来自细胞外信号，最终导致水
蛋白关闭，花粉萌发受阻（Tantikanjana et al.，2010）。与上述过程相反，异花花粉却能在柱头上完
成水化并萌发，长出花粉管伸入花柱。Dickinson（1995）发现亲和授粉 60 min 后的甘蓝花粉有些已
伸出花粉管，有些还处于水化状态。Casselman 等（2000）对甘蓝授粉 3 h 后的柱头进行苯胺蓝染色，
在荧光显微镜下观察到了花粉管。目前对亲和授粉分子机理知之甚少。花粉外壁是拟南芥花粉与柱
头结合所必需的，花粉粒外壁畸形的突变体与柱头结合时表现出较弱的粘附（Zinkl & Preuss，2000；
Nishikawa et al.，2005；Dobritsa et al.，2009）。在缺少花粉外壁的拟南芥突变体和去除花粉外壁的
甘蓝中，观察到很弱的花粉粘附（Preuss et al.，1993；Luu et al.，1997），但这种外孢壁特异性的化
学成分尚不清楚（Chapman & Goring，2010）。有报道表明两个柱头特异表达蛋白 SLG 和 SLR1 与
花粉粘附有关，用 SLG、SLR1 各自抗体处理柱头后，花粉粘附变弱（Luu et al.，1999）。SLG、SLR1
可分别与花粉包被蛋白 PCP-A1 和 SLR1-BP 结合，这被认为在花粉粘附和萌发过程中起了重要作用
（Doughty et al.，1998；Takayama et al.，2000）。Samuel 等（2009）研究表明 EXO70A1 是花粉亲
和的必需因子，抑制其在亲和性材料中的表达将使亲和花粉在水化和萌发初期被抑制，而在不亲和
性材料中过量表达该蛋白则使材料呈部分亲和。
上述为数不多几个参与亲和授粉早期识别蛋白质因子都是通过遗传杂交和基因克隆等方法发
现和鉴定的。蛋白质组学研究技术具有全信息化分析某一特定组织特定时期蛋白质表达谱的优势，
目前该技术已成功用于油菜和粳稻花粉萌发和花粉管延伸关键蛋白（Dai et al.，2007；Sheoran et al.，
2009），油菜响应磷、硼胁迫信号关键蛋白（Wang et al.，2010；Yao et al.，2011）等分离与鉴定工
作。本试验中首次采用蛋白质组学方法，对 SI 甘蓝柱头亲和授粉早期差异蛋白质进行研究，以期为
发现更多与花粉—柱头互作相关蛋白质奠定基础，进而为深入研究孢子体型自交不亲和柱头排斥自
花花粉接受异花花粉的分子机制提供新内容。
1 材料与方法
1.1 材料及其亲和性鉴定
自交不亲和甘蓝（Brassica oleracea L.）高代自交系高代自交系 A4 和 K101由西南大学十字花科
1 期 陈 松等：自交不亲和甘蓝亲和授粉早期差异蛋白质分析 71

研究所提供。将甘蓝种植在十字花科研究歇马实验基地。2011 年 3 月底，于开花前 1 ~ 2 d 将高代
自交系 A4 花蕾人工去雄，用 K101 花粉给高代自交系 A4 柱头饱和授粉。参照 Dickinson（1995）和
Casselman 等（2000）对甘蓝亲和授粉后花粉萌发和花粉管生长情况观察。将授粉处理后材料分为 3
组：①授粉后 3 ~ 5 min，简称 3 ~ 5 min 组；②授粉后 1 h，简称 1 h 组；③授粉后 2 h，简称 2 h 组。
处理时间到后取下整个饱和授粉的花柱放入液氮冷冻，–80 ℃保存。
将高代自交系 A4 种植在十字花科歇马实验基地隔离网中，于 2011 年 3 月底分别对其进行花期
的自花/异花授粉。异花花粉来源于 K101，统计种子数并计算亲和指数，计算方法如下：亲和指数 =
种子数/授粉的花朵数。
1.2 蛋白质提取及定量
蛋白质提取采用 TCA/丙酮法（Zou et al.，2009）。从–80 ℃冰箱取出饱和授粉处理的花柱放入
液氮预冷的研钵研磨成粉，用含有 0.1 kg · L-1 TCA 和 0.07% –巯基乙醇的冷冻丙酮，在–20 ℃条
件下处理 1 h；然后 15 000 × g、4 ℃条件下离心 25 min。将获得的沉淀物洗涤 3 次，每次先加入不
含 TCA 的蛋白提取液后在–20 ℃条件下放置 1 h，然后 15 000 × g、4 ℃条件下离心 25 min，弃上
清液，真空干燥。配制含有 7 mol · L-1 尿素，2 mol · L-1 硫脲，0.04 kg · L-1CHAPS，50 mmol · L-1 DTT，
0.2% 两性电解质（pH 3 ~ 10），1%蛋白酶抑制剂（Protease Inhibitor Cocktail）的裂解液。按 20 μL
裂解液每毫克沉淀的比例加入离心管，在室温下溶解 1 h，每 10 min 涡旋一次；然后 15 000 × g，4 ℃
条件下离心 25 min。上清液即为获得的蛋白溶液，将其转移到 1.5 mL 离心管中，–80 ℃保存。用
上海生工 Bradford 法蛋白浓度测定试剂盒（SK3031）测定蛋白浓度，标准蛋白为小牛血清标准蛋白。
1.3 双向电泳与质谱鉴定
第一向等电聚焦（IEF）：上样量约 150 μg，上样体积约 350 μL。使用 BIO-RAD 的非线性 IPG
固相胶条（17 cm，pH 3 ~ 10），按照 BIO-RAD 双向电泳操作手册操作，在水化槽中加入 IEF 上样
缓冲液（7 mol · L-1 尿素，2 mol · L-1 硫脲，4% CHAPS，65 mmol · L-1 DTT，0.002 kg · L-1 Bio-Lyte，
0.001%溴酚蓝），并在 BIO-RAD PROTEAN IEF Cell 中进行等点聚焦。仪器运行条件为 20 ℃，50 V
12 h，100 V 1 h，200 V 1 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，3 000 V 1 h，5 000 V 1 h，8 000 V 1 h，10 000
V 1 h，10 000 V 80 000 VH 和 500 V 1 h。等点聚焦结束后立即进行胶条平衡，将聚焦后的 IPG 胶条
在平衡液Ⅰ（6 mol · L-1 尿素，0.02 kg · L-1 SDS，0.375 mol · L-1，Tris-HCl pH 8.8，20%甘油，0.02 kg · L-1
DTT）及平衡液Ⅱ（6 mol · L-1 尿素，0.021 kg · L-1SDS，0.375 mol · L-1 Tris-HCl pH 8.8，20%甘油，
0.025 kg · L-1碘乙酰胺）先后平衡 15 min，再转移到 12% SDS-PAGE 凝胶（厚度 1 mm）顶端，准
备进行第二向 SDS-PAGE 电泳。第二向 SDS-PAGE 电泳：将胶条与凝胶结合紧密，并用低熔点琼脂
糖封胶。将板胶置于 Bio-Rad PROTEAN II xi Cell 电泳系统，采用稳压模式，电压设定分两步：（1）
75 V，30 min；（2）250 V，4 ~ 5 h 或者 100 V 过夜。电泳结束后，银染显色。
银染的操作步骤如下：1. 在固定液（50%甲醇，12%冰醋酸，0.05%甲醛）中固定 2 h；2. 倒去
固定液，在清洗液（50%甲醇）中 2 h；3. 倒去清洗液，在增敏液（30%乙醇，0.068 kg · L-1 醋酸钠，
0.002 kg · L-1 硫代硫酸钠）中振荡 90 s；4. 倒去增敏液，用 MilliQ 水清洗 3 次，每次 20 s；5. 加入
染色液（0.002 kg · L-1 硝酸银，0.075%甲醛），振荡 30 min；6. 倒去染色液，并于 MilliQ 水清洗 3
次，每次 20 s；7. 倒入显影液（0.06 kg · L-1 碳酸钠，0.05%甲醛，8 × 10-6 kg · L-1 硫代硫酸钠），显
影至合适颜色；8. 倒去显影液，加入终止液（50%甲醇，12%冰醋酸），终止反应。
采用 MICROTEK MRS-9600TFU2  型号扫描仪扫描采集银染后的凝胶，分辨率设为 300 dpi，灰
阶模式。然后用 PDQuest 图像分析软件对扫描获取的图像进行对比分析，筛选 3 组间差异蛋白质点。 
72 园 艺 学 报 40 卷
从凝胶上挖取差异蛋白质点，装入加有少量蒸馏水的 1.5 mL EP 管。对每个胶点进行酶解、洗
脱、得到肽段混合物委托深圳华大基因公司进行 MALDI-TOF-TOF-MS 质谱分析，获得一级、二级
肽谱数据，应用 MASCOT 软件（www. matrixscience. com）进行肽指纹图谱鉴定，使用甘蓝所属的
十字花科相关数据库：NCBI 蛋白库的十字花科物种（Brassicaceae，txid3700），链接分别为 http：//www.
ncbi. nlm. nih. gov/protein/。数据统计时蛋白得分计算方法为 S =–10 × Log（P），其中 P 比对匹配中
的一个随机事件的可能性大小。肽匹配段数为每个蛋白样品与数据库蛋白匹配的肽段个数，肽段覆
盖率为匹配肽段的氨基酸总数占数据库匹配蛋白氨基酸数的百分比。最终结果中将得分不低于 65，
与已知蛋白的匹配肽段数不低于 4 段，且肽段覆盖率不低于 15%的蛋白认为是可信蛋白。
2 结果与分析
2.1 材料亲和性鉴定
以甘蓝高代自交系 A4 为母本，分别进行花期自交与亲和授粉，亲和花粉来自甘蓝 K101。自交的
果荚长约 6 cm，果荚内几乎没有结实，而亲和授粉的果荚长约 9.5 cm，具有饱满的种子。A4 自交亲
和指数为 0.20，亲和授粉为 8.42，K101自交为 0.30。依据亲和指数在 1 以下的植株一般能较稳定地
遗传高度自交不亲和性的结论（方智远 等，1983），A4、K101应是高度自交不亲和的材料且异交亲和。
2.2 双向电泳图谱的建立与图像分析
对花粉与柱头总蛋白进行双向电泳（图 1），初步分析发现蛋白点主要集中在 pI 4 ~ 8，相对分
子质量约为 20 ~ 90 kD 的区域。在正极端的蛋白点密度明显高于负极端，相对分子质量较大的蛋白
明显多于相对分子质量较小的蛋白。


图 1 优化后的双向电泳图谱
Fig. 1 Optimal 2-DE profile
2.3 授粉后不同时间蛋白质表达谱 PDQuest 分析
从授粉后 1 h、2 h 和 3 ~ 5 min 组中每组选择 3 张分离度和重复性好的清晰图像，载入 PDQuest
1 期 陈 松等：自交不亲和甘蓝亲和授粉早期差异蛋白质分析 73

软件中进行图像分析。在 3 ~ 5 min 与 1 h 对比组中，通过软件分析结合人为筛选，最终得到 116 个
差异点（图 2）。去掉清晰度、分离度不很理想的点，并且以优先选择特异表达，然后从蛋白量变化
大的点到变化量小的点为原则，总共筛选了 71 个点送华大基因公司进行质谱分析。这些点分为 3
组：（1）在 1 h 组或者 3 ~ 5 min 组中特异表达：在 1 h 组中特异表达的蛋白点有 40 个，在 3 ~ 5 min
组中特异表达的有 2 个。（2）在 1 h 组中上调表达：3 倍及以上上调表达蛋白点 7 个，2 ~ 3 倍的 9
个。（3）在 1 h 组中下调表达：下调至 1/3 及以下的蛋白点 7 个，下调至 1/2 ~ 1/3 的 6 个。软件的
定量是根据灰阶图像上点的灰度值，并根据多块重复凝胶求平均值来确定的。图 2 上所标注出来的
点是成功鉴定出功能的蛋白点，这些点散布在图谱的各个区域，但在 pI 大约为 6 ~ 9，分子量约 25 ~
90 kD 的区域相对集中。
在授粉后 1 h 与 2 h 对比中发现有 7 个差异点：1 个在 1 h 组中特异表达，1 个在 2 h 组中特异
表达，5 个在 2 h 中上调表达，其余点表达量几乎没有变化，可能是由于花粉—花柱互作的相关调
控作用在 1 h 内呈现爆发式变化，而在 1 h 后则趋于平缓，是这个生理过程的持续。


图 2 自交不亲和甘蓝亲和授粉 1 h（A）与 3 ~ 5 min（B）花柱蛋白双向电泳图谱
Fig. 2 The 2-D style protein profile of 1 h（A）and 3–5 min（B）after compatible pollination

2.4 差异蛋白点的 MALDI-TOF-TOF-MS 分析与数据库检索
将得分不低于 65，与已知蛋白的匹配肽段数不低于 4 段，且肽段覆盖率不低于 15%的蛋白认为
是可信蛋白，共 31 个蛋白被成功鉴定（表 1）。其中，参与生物合成类 4 个，与钙结合相关蛋白 2
个，参与防御应答 3 个，参与蛋白质折叠 1 个，参与花粉管发育 2 个，参与碳水化合物及能量代谢
7 个，参与翻译调控 4 个，参与超氧自由基的移除 1 个，参与跨膜运输 1 个，甲基化 2 个，未命名
蛋白 2 个，其它蛋白 2 个。在鉴定出来功能的 31 个蛋白点中，有 8502，6703，8407，6807，8405，
6613，6507，7813，7505，8506，8508，7604，5409，5403，9501，8309，8703，6804，6801，共
19 个点在亲和授粉后 1 h 组中特异表达；7306，6003，7003，8503，8204，7708，6303，8303，8206，
共 9 个点在 1 h 组内上调表达；3202，7006，5001 这 3 个点在 1 h 组内下调表达。
根据 PDQuest 软件 Quantity table report 中的数值来绘制蛋白相对量变化图（图 3），纵坐标即是
软件给出同一个时期 3 个重复的平均值，代表了各种蛋白质的量，横坐标是蛋白质点的编号。
74 园 艺 学 报 40 卷
表 1 选取的差异蛋白点质谱鉴定结果
Table 1 Selected differential expressed proteins identified by MALDI-TOF-TOF-MS mass spectrometry
蛋白点
序号
Protein
spot No.
蛋白名称
Protein name
物种
Species
得分
Mowse
score
覆盖率/
%
Squence
coverage
理论分子
量/等电点
MW(kD)/
pI
匹配肽
段数
Matched
peptides
分子量/
等电点
MW(kD)/
pI
登录号
Accession No.
生物合成 Biosynthetic process
8502 磷酸–2–脱氢–3–脱氧庚糖酸醛缩酶
2
Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate
aldolase 2
拟南芥
A. thaliana
140 35.11 60.32/8.03 13 56.40/9.07 gi|332660837
6703 尿苷二磷酸 4，6–脱水酶
UDP-glucose 4,6-dehydratase
拟南芥
A. thaliana
274 44.99 79.41/7.08 26 75.84/7.30 gi|332198001
6807 钴胺素依赖的甲硫氨酸合成酶
Cobalamin-independent methionine
synthase
拟南芥
A. thaliana
331 45.88 84.64/6.47 25 84.65/6.47 gi|297807807
3202 1–氨基环丙烷–1–羧酸氧化酶
1-aminocyclopropane-1-carboxylate
oxidase
拟南芥
A. thaliana
104 28.48 41.86/5.10 6 36.94/5.01 gi|332189658
防御应答 Defense response
6003 谷胱甘肽 s–转移酶
Glutathione S-transferase
拟南芥
A. thaliana
99.2 42.33 22.94/6.74 7 24.13/6.64 gi|330253354
7003 谷胱甘肽 s–转移酶
glutathione S-transferase
拟南芥
A. thaliana
107 39.07 23.01/7.22 8 24.13/6.64 gi|330253354
7813 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶
phosphoenolpyruvate carboxykinase
[ATP]
拟南芥
A. thaliana
79 16.41 81.42/7.91 7 73.93/7.08 gi|332661447
蛋白质折叠 Protein folding
7006 肽酰–脯氨酰–顺反式异构酶 CYP19-3
Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
CYP19-3
拟南芥
A. thaliana
138 35.23 15.98/7.84 4 19.14/7.97 gi|332645953
花粉管发育 Pollen tube development
8503 延胡索酸水合酶 II 类
Fumarate hydratase, class II
拟南芥
A. thaliana
104 35.16 56.55/7.40 12 53.48/7.98 gi|330255759
8506 延胡索酸水合酶 II 类
Fumarate hydratase, class II
拟南芥
A. thaliana
89.9 32.52 56.38/8.37 13 53.48/7.98 gi|330255759
碳水化合物与能量代谢过程 Carbohydrate and energy metabolism
6507 6–磷酸葡萄糖脱氢酶
6-phosphogluconate dehydrogenase
拟南芥
A. thaliana
376 47.74 58.41/7.07 21 53.83/7.49 gi|332640276
6613 二氢硫辛酸脱氢酶 1
Dihydrolipoyl dehydrogenase 1
拟南芥
A. thaliana
182 57.40 66.52/7.13 25 54.24/7.45 gi|332194119
6303 甘油醛–3–磷酸脱氢酶
Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase
拟南芥
A. thaliana
220 37.28 45.17/6.71 9 37.00/7.22 gi|332190895
7505 二氢硫辛酸脱氢酶
Dihydrolipoyl dehydrogenase
拟南芥
A. thaliana
72.5 24.60 62.67/7.40 12 67.56/7.84 gi|332658304
7604 丙酮酸激酶
Pyruvate kinase
拟南芥
A. thaliana
123 44.21 66.33/7.84 23 57.92/7.12 gi|332645501
7306 甘油醛–3–磷酸脱氢酶
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
拟南芥
A. thaliana
199 25.44 44.39/7.59 8 37.01/7.15 gi|332640518
8303 甘油醛–3–磷酸脱氢酶 2
Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase 2
油菜
B. napus
83.2 19.17 37.03/8.20 5 37.56/8.15 gi|241740186
翻译调控 Regulation of translation
8206 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 β 亚基类蛋白
Guanine nucleotide-binding protein
subunit beta-like protein
拟南芥
A. thaliana
467 62.69 37.31/8.37 18 36.12/7.81 gi|332191552
5409 延伸因子 Tu
Elongation factor Tu
拟南芥
A. thaliana
108 22.03 49.45/6.34 9 49.61/6.68 gi|332656852

1 期 陈 松等：自交不亲和甘蓝亲和授粉早期差异蛋白质分析 75

续表 1
蛋白点
序号
Protein
spot No.
蛋白名称
Protein name
物种
Species
得分
Mowse
score
覆盖率
/%
Squence
coverage
理论分子
量/等电点
MW(kD)/
pI
匹配肽
段数
Matched
peptides
分子量/
等电点
MW(kD)/
pI
登录号
Accession No.
5403 延伸因子
Elongation factor Tu
拟南芥
A. thaliana
166 17.62 48.80/6.08 7 49.61/6.68 gi|332656852
9501 延长因子 1α
Elongation factor 1-alpha
拟南芥
A. thaliana
66 16.13 57.85/9.78 5 41.69/9.77 gi|332190093
超氧化物自由基的移除 Removal of superoxide radicals
5001 超氧化岐化酶
Superoxide dismutase [Fe]
拟南芥
A. thaliana
77.4 22.58 21.22/6.04 5 21.08/6.64 gi|332659610
钙离子结合 Ca2+ binding
8309 EPS15 同源结构域 2
EPS15 homology domain 2 protein
拟南芥
A. thaliana
68 32.23 47.36/8.54 16 61.63/7.27 gi|332657129
8508 钙结合 EF 家族蛋白
Calcium-binding EF hand family
protein
玉山筷子芥
A. lyrata ssp.
lyrata
68.9 53.21 61.89/8.31 19 61.46/7.01 gi|297813815
跨膜运输 Transmembrane transport
8703 位于叶绿体外膜的易位子 75-3
Protein TOC75-3
拟南芥
A. thaliana
223 25.55 79.14/8.46 19 89.59/9.10 gi|332644678
甲基化作用 Methylation
6804 5–甲基四氢三谷氨酸–同型半胱氨酸
甲基转移酶
5-methyltetrahy dropteroyltriglutamate-
homocysteine methyltransferase
拟南芥
A. thaliana
101 19.48 86.21/6.72 12 84.65/6.47 gi|332005104
6801 5–甲基四氢三谷氨酸–同型半胱氨酸
甲基转移酶
5-methyltetrahy dropteroyltriglutamate-
homocysteine methyltransferase
拟南芥
A. thaliana
136 28.10 86.37/6.58 16 84.65/6.47 gi|332005104
其它蛋白 Other proteins
8204 琥珀酰辅酶A 连接酶（GDP 形成）亚基 α-1
Succinyl-CoA ligase [GDP-forming]
subunit alpha-1
拟南芥
A. thaliana
122 31.41 40.04/8.29 8 36.58/8.39 gi|332003896
7708 β–糖甙酶 1
βeta glucosidase 1
玉山筷子芥
A. lyrata ssp.
lyrata
211 23.67 73.63/7.93 12 60.92/6.95 gi|297847632
未命名蛋白 Unnamed protein
8405 未命名蛋白 Unnamed protein product 甘蓝B. oleracea 116 27.59 52.63/8.47 10 47.77/8.15 gi|300649116
8407 未命名蛋白
Unnamed protein product
甘蓝B. oleracea 289 47.64 50.33/8.66 15 47.77/8.16 gi|300649116




图 3 蛋白质相对量变化图
Fig. 3 Relative quantitation of proteins
76 园 艺 学 报 40 卷
在鉴定结果中，有几个蛋白点表现比较特别。如图 4，a ~ d 中标注的 4 对蛋白点。每对中的两
个点分离清晰，但是相距不远，这表示不同蛋白，但是具有相近的分子量和等电点；而质谱结果显
示，每张图上的两点被识别为同一蛋白，比如，8503 和 8506 两个蛋白点均被鉴定为编号为 gi
330255759 的蛋白质（图 4，d）。其它 3 对也是如此。表明这两蛋白具有相似的一级结构，但它们
的匹配率不同。所以推测是具有相似结构，相同功能的两种蛋白，甚至是同分异构体，也有可能是
同一种蛋白质被不同地修饰，比如甲基化，糖基化等。



图 4 推测结构相似的蛋白点放大图
Fig. 4 Enlargements of protein spots with putative similar structure
3 讨论
本试验中总共选择了 71 个点进行质谱鉴定，最终确定为可信蛋白质 31 个，鉴定成功率较低，
主要由于尚无甘蓝基因组序列可参考，所以大部分质谱结果与模式植物拟南芥进行匹配。因蛋白质
种类繁多，数据库也还不完善，一些质谱峰图不错的蛋白质也无法与数据库信息对应，导致一些蛋
白无法被成功鉴定；另外对鉴定蛋白质信息进行筛选，将得分不低于 65，与已知蛋白质的匹配肽段
数不低于 4 段，且肽段覆盖率不低于 15%的蛋白质认定为可信蛋白质，才用于后续分析。
在成功鉴定的蛋白质中有两个蛋白质被认为与 Ca2+结合有关，其中 8309 被鉴定为 EPS15
homology domain 2 protein；8508 被鉴定为 calcium-binding EF hand family protein，两种蛋白均在亲
和授粉后 1 h 特异表达，且都有 EH，EHD，Dynamin_N 这 3 个保守结构域，推测两者可能具有相
同功能。Brewbaker 和 Kwack（1963）发现 Ca2+是花粉萌发以及花粉管生长所必需的，Rathore 等（1991）
检测了百合花粉管中钙离子分布情况，发现胞质中自由钙离子浓度在尖端比较高，且在尖端区域呈
现浓度梯度分布的特点。当向花粉管注入 BAPTA 型缓冲液或者用高浓度蔗糖溶液处理时，花粉管
表现出可逆性生长停滞，与此同时胞内 Ca2+浓度梯度消失（Pierson et al.，1994），表明 Ca2+在花粉
管延伸中起着重要的作用。花粉管不断延伸，最终要到达胚珠才能释放精子完成受精，这个过程涉
及花粉管的导向问题。Malho 和 Trewavas（1996）发现 Ca2+还调控着花粉管生长方向。因此 Ca2+在
花粉萌发，花粉管延伸以及花粉管导向等多方面起着重要作用。由于胞内与胞外 Ca2+浓度相差很大，
且花粉管在其尖端区又呈现浓度梯度分布，可能需要相关蛋白实现 Ca2+的胞间运输，以维持浓度梯
度确保花粉管的正常延伸。EPS15 homology domain 2 protein（8309）和 calcium-binding EF hand
family protein （8508）在 1 h 组中特异表达，且这两种蛋白具有 Ca2+结合、内吞、小泡运输等作用，
可能参与从胞外将 Ca2+运输到花粉管细胞内部以及其它与 Ca2+相关的生理过程，但他们发挥作用的
具体机制以及这两者之间作用的差别与联系，需要进一步研究。在 1 h 组中，8503 上调表达 2 ~ 3 倍，
8506 特异表达，这两个蛋白点被鉴定为同一种蛋白——延胡索酸酶。Boavida 等（2009）通过构建拟
南芥 Ds 插入突变体的方法，在延胡索酸酶突变株中其花粉管比野生型的短。虽然突变体花粉管的
生长受到抑制，但最终还是能够让部分胚珠受精。这表明延胡索酸酶是花粉管发育所需蛋白因子。
1 期 陈 松等：自交不亲和甘蓝亲和授粉早期差异蛋白质分析 77

在成功鉴定的差异蛋白质中既有花粉管发育必需因子，也有防御蛋白。研究表明 PCP-A1 与花
粉的粘附于萌发有关，PCP-A1 也是一种防御素类蛋白（Doughty et al.，1998）。Okuda 等（2009）
发现了两种防御素类蛋白，命名为 LUREs，在助细胞中大量表达，并表现出对花粉管的诱导作用。
一个与白粉菌抗性有关 NORTIA（NTA）在助细胞接受花粉管的过程中起作用，这表明这种蛋白参
与了花粉管的接受与白粉菌感染这两个过程（Kessler et al.，2010）。另外，在玉米雌配子体中特异
表达的一个防御素类——半胱氨酸富集蛋白 ZmES1-4，在调控花粉管停止生长，破裂并释放出精子
的过程中起作用（Amien et al.，2010）。上述说明，参与防御的蛋白可能在花粉萌发以及花粉管延伸
到生长停止、破裂等一系列过程中发挥作用。花粉与柱头互作也可能是多条信号通路共同完成，即
一种蛋白可能参与多条信号通路，多条信号通路可以共同发挥作用以完成此项生命活动
（Tantikanjana et al.，2010）。另外，花粉管穿入柱头乳突细胞的过程或许会被当作一种外物的入侵
而激发植物体内的防御系统，进而合成或者上调表达防御类的蛋白质。在鉴定的蛋白质中 glutathione
S-transferase（6003，7003）对细菌的防御应答，phosphoenolpyruvate carboxykinase （7813）参与对
真菌的防御应答。在 1 h 组中 6003，7003 上调表达 2 ~ 3 倍，7813 特异表达。这些蛋白质是否参与
了柱头与花粉的互作，并在花粉粘附和生长等过程中起作用还有待于进一步通过基因沉默、转基因
技术等方法来鉴定。
甘蓝有一个干性柱头，只有亲和花粉才能促使其分泌水或者小分子物质，使花粉粘附，进而萌
发和伸出花粉管进入花柱，这个过程涉及物质跨膜运输。在 1 h 组中特异表达的 8703 功能是参与跨
膜运输，可能参与柱头乳突细胞与花粉、以及柱头乳突细胞间的水分与小分子物质的运输过程。花
粉在柱头上萌发，然后伸出花粉管并穿过乳突细胞，伸长进入输导组织并递交雄配子给子房，输导
束在花粉管延伸或移动至子房的过程中起重要作用，花柱成分在花粉管伸长过程中将起着引导、营
养、完整结构等作用（Cheung et al.，1995；Wu et al.，1995；Jauh & Lord，1996）。这一系列现象
伴随着很多新的生理过程，可能需要相关蛋白的生物合成。在鉴定出的蛋白点中，有 4 个与生物合
成相关，且多数在 1 h 组特异表达，这些蛋白可能参与合成与授粉过程有直接或者间接作用的蛋白。
基因的转录翻译调控着蛋白质的合成，此次鉴定出了 5 个与翻译调控有关的蛋白。在 1 h 组中，5403，
5409 和 9501 特异表达；2009 和 8206 上调表达。这些蛋白特异表达或上调表达，可能在新蛋白以及
相关蛋白大量合成中起重要作用。上述的一系列过程都涉及到能量的消耗，糖类物质的代谢是能量
的主要来源，特异表达的点 7604，上调表达的 6303，8303 可能参与糖酵解过程，一共 8 个蛋白涉
及糖代谢，这可能与完成授粉及后续过程需要能量有关，也可能是提供一些中间代谢产物。上述蛋
白的具体功能尚需要进一步的研究。
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