全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（5）：960–970 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–11–09；修回日期：2013–04–09
基金项目：国家自然科学基金项目（30600484）；浙江省自然科学基金项目（Y3100406，Y305349）；浙江农林大学研究生科研创新基金
项目（3122013240139）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gaoyanhui408@126.com）
石蒜黄烷酮 3–羟化酶基因 LrF3H 的克隆及表
达分析
黄春红，高燕会*，朱玉球，童再康，姜小凤
（浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江临安 311300）
摘 要：采用 RT-PCR 和 RACE 技术相结合的方法，从石蒜花瓣中克隆到 1 个黄烷酮 3–羟化酶（F3H）
基因的 cDNA 全长序列，全长 1 293 bp，包含 1 098 bp 的完整开放阅读框，编码 365 个氨基酸；氨基酸序
列比对显示该序列编码的氨基酸与水仙的 F3H 具有高达 91%的同源性，将其命名为 LrF3H。二级结构预
测表明，随机卷曲是 LrF3H 蛋白最大量的结构元件，而 α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。保守结构
域预测表明该基因编码的蛋白具有典型的 F3H 蛋白功能结构域，其保守结构域中含有铁离子及 2–O–酮
戊二酸结合位点，属于 2OG-FeⅡ_Oxy 双加氧酶超家族。实时荧光定量 PCR 分析表明，LrF3H 在整个花
发育过程中均表达，而且从初蕾期到盛开期随着花瓣着色加深表达量逐渐增加，盛开期表达量最高，之
后随着花朵萎蔫表达量下降；在不同器官中，LrF3H 的表达量在花瓣和花葶中最高，而在根、鳞茎和叶
片中都很低，推测该基因在石蒜花色形成过程中起着关键作用。
关键词：石蒜；黄烷酮 3–羟化酶；基因克隆；表达
中图分类号：S 682.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）05-0960-11

Cloning and Expression Analysis of Flavanone 3-hydroxylase Gene LrF3H
from Lycoris radiata
HUANG Chun-hong，GAO Yan-hui*，ZHU Yu-qiu，TONG Zai-kang，and JIANG Xiao-feng
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang Agriculture and Forestry
University，Lin’an，Zhejiang 311300，China）
Abstract：Flavanone 3-hydroxylase（F3H）is a crucial enzyme in the early stage of anthocyanins
biosynthesis which is important in regulating the formation of flower color. In the study，a full-length
cDNA sequence of F3H gene was cloned from petals of Lycoris radiata using RT-PCR and RACE
approaches. The cDNA sequence was 1 293 bp and included a whole open reading frame of 1098 bp
encoding 365 amino acids. The amino acid sequence of this gene shared up to 91% homology with F3H
from Narcissus tazetta，and then was named LrF3H. The predicted secondary structure indicated that
random coil was the most important structural element. However，alpha helix and extended strand
distributed in the whole protein. The conserved structural domain analysis revealed that LrF3H had the
typical functional domains of F3H protein，containing 2-oxoglutarate and iron ion combination sites and

5 期 黄春红等：石蒜黄烷酮 3–羟化酶基因 LrF3H 的克隆及表达分析 961

belonging to the 2OG-Fe(Ⅱ)-dependent dioxygenase superfamily. Quantitative RT-PCR analysis showed
that LrF3H was expressed in the whole phases of flower development，and the expression level was
increasing concomitant with the growth of flower bud and pigmentation until the phase of blooming flower.
The transcript level was highest in anthocyanin-pigmented petals，moderate in cape and lower in root，
corm and leaf. Those indicated that LrF3H gene might play a role in flower pigmentation in Lycoris
radiata.
Key words：Lycoris radiata；flavanone 3-hydroxylase（F3H）；gene cloning；expression

石蒜（Lycoris radiata）为石蒜科石蒜属（Lycoris Herb.）多年生鳞茎类球根花卉。该属植物花
茎挺拔，花形奇特，花色艳丽，被誉为“中国的郁金香”（胡一民和郭兴然，1996）。石蒜花期为夏
末秋初花稀季节，秋季花后抽叶，经冬不凋至初夏枯萎，是优良的观花观叶植物。石蒜已在鲜切花、
地被绿化、园林景观配置中得到广泛应用（朱重胜和谢树禄，2008）。目前国内外对石蒜的研究主要
集中在种间杂交（林巾箴，1986；Park et al.，1988）、染色体核型分析（秦卫华 等，2004）、细胞
学（邓传良和周坚，2005）、系统发育学（陈妍 等，2009）以及遗传多样性（张露 等，2002；袁菊
红，2011）等方面，而关于石蒜花色形成的分子机理的研究未见报道。
黄烷酮 3–羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是花青素苷生物合成早期阶段的关键酶，该
酶的相关基因 F3H 首次从金鱼草中克隆得到（Martin et al.，1991），之后其克隆及表达的研究在芜
菁、苦荞及海棠等植物中被陆续报道（许志如 等，2008；张华玲 等，2010；Shen et al.，2012）。
本研究中以石蒜为材料，采用 RT-PCR 和 RACE 技术从花瓣中分离得到了 F3H 基因的 cDNA 全长序
列，命名为 LrF3H，并分析了其编码蛋白的结构特征及其在花发育不同时期、不同器官中的表达特
性，为进一步研究 LrF3H 基因的功能及调控机制、探讨石蒜花色形成的分子机理提供基础数据，也
为利用基因工程技术创造石蒜新种质奠定分子生物学基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料石蒜来源于浙江农林大学遗传学科石蒜苗圃地。选取 3 个纯系，于 2011 年 8 月采集石
蒜花发育 5 个时期（Ⅰ初蕾期，Ⅱ中蕾期，Ⅲ花苞期，Ⅳ盛开期，Ⅴ凋谢期）的花瓣以及盛花期的
花葶，并于 2011 年 12 月采集叶片、鳞茎和根，所取材料立即放入液氮中速冻，然后于–80 ℃保存
备用。每个试验材料采集 3 份样品。
RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂）试剂盒、cDNA 合成试剂盒、Ex Taq DNA 聚合酶和荧光定
量试剂盒 SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）等均购自 TaKaRa 公司；克隆载体 pGEM-T
Easy Vector 购自 Promega 公司；克隆用大肠杆菌 Escherichia coli 5α 为本实验室保存；DNA 凝胶回
收试剂盒和质粒提取试剂盒购自 Axygen 生物技术（杭州）有限公司；SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit 购自 Clontech 公司；所用引物由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2 石蒜 LrF3H 基因 cDNA 全长的克隆
用改良的 CTAB 法提取花瓣总 RNA，参照周厚君等（2010）的提取方法并稍加改进，用异丙醇
代替 LiCl（10 mol · L-1）沉淀上清液，–20 ℃放置 30 min，12 000 r · min-1，4 ℃离心 10 min，然后
用适量 SSTE 溶解沉淀，后续步骤参照 RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂）说明书进行。根据 GenBank
962 园 艺 学 报 40 卷
中已登录的 F3H 基因编码序列的保守区设计一对引物 F3H-F 和 F3H-R（表 1）。反转录产物 cDNA
的合成及 PCR 扩增均参照试剂盒说明书进行。
PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，凝胶回收与预期大小一致的电泳条带，连接 pGEM-T
Easy 载体并转化大肠杆菌 DH5α 菌株，经蓝白斑筛选、菌落 PCR 及质粒酶切鉴定阳性克隆后送上
海生工生物工程技术服务有限公司测序。
根据所得 F3H 基因 cDNA 中间序列，分别设计特异引物 F3H-3′GSP 和 F3H-5′GSP（表 1），参
照 RACE 试剂盒 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 说明书进行 cDNA 末端快速扩增。凝胶回
收目的片段并测序，方法同上。将中间序列和末端序列进行拼接，根据拼接得到的 cDNA 全长序列
设计全长引物 LrF3H-F 和 LrF3H-R（表 1），经 PCR 扩增、凝胶电泳分析及测序验证所得 F3H 基因
cDNA 全长序列的准确性。

表 1 石蒜 LrF3H 基因的克隆及表达分析所用引物
Table 1 Primers used to isolate and analyze the expression of LrF3H in L. radiata
引物名称 Primer name 引物序列（5′–3′）Primer sequence 备注 Note
F3H-F ATGTCTGGCGGGAAAAAGG
F3H-R GCCTGATGGTCCGCATTCTT
扩增保守片段
For the conserved fragment
F3H-3′GSP TCTCCTACCCAATAAAGGCCCGTGAC 3′ RACE
F3H-5′GSP ATGGCTTCCGAAAGGACCCCCAATAG 5′ RACE
LrF3H-F GAGTTCCAGACCAAAAAACAAAA
LrF3H-R TGCCTCCACCTCGCAACAATA
扩增 cDNA 全长
For the full length cDNA
P1 ACTGGCTGGGATTGACGAC
P2 AACTCTCTTGCCATCCTCG
检测 LrF3H 的表达
For the expression of LrF3H
Actin-F TGAAGCCCAGTCCAAGCGAGGTA 扩增内参
Actin-R TGGGTCATCTTTTCTCTGTTGGC For the internal control

1.3 LrF3H 基因序列及推测蛋白质的生物信息学分析
用 ORF Finder 在线工具（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html）查找 LrF3H 基因的开
放阅读框（ORF）并推导其氨基酸序列；利用 NCBI 的 BLAST 程序检索数据库，对 LrF3H 基因全
长 cDNA 序列及其氨基酸序列进行比对分析；利用在线软件 ProtParam（http：//www. expasy.
org/tools/protparam.html）分析 LrF3H 基因编码蛋白质的氨基酸组成，推测其分子量、等电点（pI）
及稳定性；运用在线工具 ProtScale（http：//ca. expasy. org/tools/protscale.html）、TMHMM（http：//www.
cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2.0）、SignalP（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP）、PSORT
（http：//psort. hgc. jp/form.html）对所编码蛋白质的亲水/疏水性、跨膜结构域、信号肽和亚细胞定
位进行预测分析；通过 ExPASY 中的 HNN 和 SWISS-MODEL 工具分析其蛋白质序列的二级结构并
进行三级结构建模预测；用蛋白质保守结构域推测工具 InterProScan（http：//ebi. ac. uk/tools/InterProscan/）
分析其编码蛋白的结构域；采用 ClustalX 2 软件进行多序列比对，并用 MEGA 4.0 软件构建系统进
化树。
1.4 LrF3H 基因的实时荧光定量 PCR 表达分析
用上述方法分别从石蒜根、鳞茎、叶片、花葶以及 5 个发育时期的花瓣中提取总 RNA，用
PrimeScript® RT reagent Kit Perfect Real Time（TaKaRa）试剂盒反转录合成 cDNA 备用。按照荧光定
量 PCR 引物设计的原则，分别以石蒜肌动蛋白基因 Actin（本实验室克隆获得）和 LrF3H 基因为基
础设计内参引物 Actin-F、Actin-R 及特异引物 P1、P2（表 1）。
5 期 黄春红等：石蒜黄烷酮 3–羟化酶基因 LrF3H 的克隆及表达分析 963

试验参照 SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）（TaKaRa）试剂盒的说明书，在美国
BIO-RAD 的 CFX96TM Real-Time System 实时定量 PCR 仪上完成。
荧光定量 PCR 扩增的反应体系为 10 µL，采用两步法标准程序：95 ℃预变性 2 min，95 ℃变性
5 s，60 ℃复性 30 s，共 40 个循环；每个循环第 3 步进行荧光采集；最后 95 ℃变性 1 min，退火至
60 ℃，保温 1 min 后以 0.2 ℃ · s-1 的速度逐渐升温至 95 ℃，在此过程中连续检测其荧光值绘制溶解
曲线；每个试验设 3 次重复。
2 结果与分析
2.1 石蒜 LrF3H 基因 cDNA 全长的克隆及序列分析
以石蒜盛花期花瓣总 RNA 反转录的 cDNA 为模板，用特异引物 F3H-F 和 F3H-R 扩增出一条
635 bp 的预期片段（图 1，A）。
经 Blastn 分析发现该序列与其它物种 F3H 基因高度同源，其中与水仙的（GenBank 登录号
JQ388493.1）同源性最高，为 92%，初步确认其为石蒜 F3H 基因的核心序列。
根据所得中间核心序列设计末端扩增的特异引物 F3H-3′GSP 和 F3H-5′GSP，经 RACE 扩增、产
物克隆和测序后，分别得到长度为 881 bp 的 3′末端和 632 bp 的 5′末端（图 1，B、C）。
将 RT-PCR 和 RACE 扩增片段进行序列拼接得到 F3H 基因 cDNA 全长序列，并将其与全长引物
LrF3H-F 和 LrF3H-R 扩增所得的序列（图 1，D）进行比较分析，最终获得 1 条长为 1 293 bp 的 cDNA
全长序列，经 Blastn 比对发现，该 cDNA 序列与其它物种的 F3H 基因同源，将其命名为 LrF3H。



图 1 石蒜 LrF3H 基因的 PCR 扩增结果
A：保守区 PCR 扩增产物；B：3′ RACE 扩增产物；C：5′ RACE 扩增产物；D：全长 cDNA
扩增产物；M1、M2、M3：GeneRulerTM100 bp plus DNA ladder；
M4：DNA marker DL 2000。
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of LrF3H gene fragments in L. radiata
A：PCR product of the core fragment of LrF3H；B：PCR product of 3′ RACE；C：PCR product of 5′ RACE；
D：PCR product of full-length of cDNA；M1，M2，M3：GeneRulerTM 100 bp plus DNA ladder；
M4：DNA marker DL 2000.


利用 NCBI 提供的 ORF Finder 进行分析发现，LrF3H 包含 1 个长为 1 098 bp 的最大开放阅读框，
编码 365 个氨基酸，5′非翻译区与 3′非翻译区长度分别为 60 bp 和 135 bp（图 2）。


964 园 艺 学 报 40 卷
1 ATCAACGCAGAGTACTTGGGAGTTCCAGACCAAAAAACAAAAAATAAAAATATCGTGACA
61 ATGGCACCAATTACTTTCCTTCCTACGTTATCTGAAGAAAAAACTCTCCGATCGAGTTTC
M A P I T F L P T L S E E K T L R S S F
121 GTTCGCGACGAAGACGAGAGGCCGAAAGTGGCGTATAATGAATTCAGCGATGAGATTCCG
V R D E D E R P K V A Y N E F S D E I P
181 ATCATATCACTGGCTGGGATTGACGACGGTGAGAGAAGGGTGGGCATCTGCGAAAAGATA
I I S L A G I D D G E R R V G I C E K I
241 GTTGAGGCATGCGAAGACTGGGGGATATTTCAGGTCGTGGATCACGGTGTCGATGGTGAG
V E A C E D W G I F Q V V D H G V D G E
301 ATCATAGCGGAGATGACGAGGATGGCAAGAGAGTTTTTTGCGTTGCCGCCAGAGGACAAG
I I A E M T R M A R E F F A L P P E D K
361 TTGAGGTTTGATATGTCTGGCGGGAAAAAGGGTGGATTCATCGTGTCTAGCCACCTTCAG
L R F D M S G G K K G G F I V S S H L Q
421 GGTGAAGCAGTGCAAGACTGGAGGGAGATTGTGACATACTTCTCCTACCCAATAAAGGCC
G E A V Q D W R E I V T Y F S Y P I K A
481 CGTGACTATTCAAGATGGCCCGACAAGCCCGACGGTTGGATATCCGTAGCTGAAAAGTAC
R D Y S R W P D K P D G W I S V A E K Y
541 AGCGAAAAACTAATGGAATTGGCATGCAAGCTATTGGGGGTCCTTTCGGAAGCCATGGGC
S E K L M E L A C K L L G V L S E A M G
601 CTCGACCACGAGGCCTTGACCAAGGCCTGTGTAGACATGGACCAAAAGATGGTTATCAAT
L D H E A L T K A C V D M D Q K M V I N
661 TTCTACCCCAAGTGTCCACAGCCTGATCTCACACTGGGCTTGAAGCGCCATACCGATCCC
F Y P K C P Q P D L T L G L K R H T D P
721 GGCACCATCACTCTACTTCTTCAGGATCAGGTCGGTGGCCTGCAGGCCACCAAGGACGGT
G T I T L L L Q D Q V G G L Q A T K D G
781 GGAAAGACTTGGATTACCATTCAACCAGTGGAGGGGGCTTTCGTTGTTAACCTTGGCGAT
G K T W I T I Q P V E G A F V V N L G D
841 CATGGTCATTATTTGAGCAATGGTCGGTTCAAGAATGCAGACCATCAGGCTGTGGTGAAC
H G H Y L S N G R F K N A D H Q A V V N
901 TCCAACTACAGTCGACTATCGATCGCAACGTTTCAGAATCCAGCACCGGATGCAATTGTA
S N Y S R L S I A T F Q N P A P D A I V
961 TACCCTCTAGCGGTCAGGGAGGGTGAGAAGCCAATACTGGGCGAGCCGATCACTTTTGCG
Y P L A V R E G E K P I L G E P I T F A
1021 GAGATGTATAGGAAGAAGATGAGCCGAGACATCGAGCATGCTAAGCTCAAGAAATTAGCA
E M Y R K K M S R D I E H A K L K K L A
1081 AAGGAGAAGCTGGAGGTAGTGGACAAGAACGTGAACGTGGTAGCCCAGCCCAAAGCCTTA
K E K L E V V D K N V N V V A Q P K A L
1141 AGTGGGATCTTGGCTTGAGTCACGTAGTTAGTTAGCTCGATCTGTTTGAATATTATGGTA
S G I L A *
1201 GTAATATTGTTGCGAGGTGGAGGCAAAATTTAAAAAAAAATAATAATAATAATTTCAAAT
1261 TCCCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

图 2 石蒜 LrF3H 基因 cDNA 全长及推导的氨基酸序列
起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA）加粗显示；2OG-FeⅡ—Oxy 双加氧酶保守结构域用下划线表示；Fe2+结合位点
组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）和 2–O–酮戊二酸结合位点精氨酸（Arg）、丝氨酸（Ser）用方框表示。
Fig. 2 Complete cDNA and deduced amino acid sequences of LrF3H in L. radiata
Fontbold stands for the start codon and stop codon；Underline indicates the conserved structural domain of 2OG-FeⅡ-dependent dioxygenase
superfamily；Boxes stands for His，Asp，Arg and Ser residues of the binding site of Fe2+ and 2-oxoglutarate respectively.
2.2 石蒜 LrF3H 基因编码蛋白质的特征分析
用 ProtParam 软件预测 LrF3H 编码蛋白的分子量为 40.77 kD，理论等电点（pI）为 5.43，氨基
酸组成中亮氨酸（Leu）所占比例最大，为 8.5%，蛋白不稳定系数是 38.64，属于稳定蛋白。ProtScale
工具预测该蛋白为亲水性蛋白，TMHMM 工具对该蛋白的跨膜结构进行预测发现其无跨膜区。预测
蛋白质的信号肽及亚细胞定位有助于了解蛋白质发挥功能的区域，用 SignalP4.0 预测显示，LrF3H
编码的蛋白不具有信号肽，同时运用 PSORT 程序对其进行亚细胞定位预测，结果表明该蛋白定位
于细胞质。
5 期 黄春红等：石蒜黄烷酮 3–羟化酶基因 LrF3H 的克隆及表达分析 965

运用 HNN 软件预测 LrF3H 蛋白的二级结构，结果显示该蛋白的二级结构由 50.96%的随机卷曲
（random coil）、25.75%的 α–螺旋（α-helices）和 23.29%的延伸链（extended strand）组成（图 3，
A），而且 α–螺旋和延伸链散布于整个蛋白中。蛋白质的功能很大程度上由其空间结构决定，其中
α–螺旋对蛋白质的骨架起稳定作用，而随机卷曲决定了蛋白质的功能。通过预测蛋白质的三级结
构，有助于分析其结构与功能之间的关系，图 3，B 表明，用 SWISS-MODEL 预测的 LrF3H 编码蛋
白的三级结构与其二级结构预测结果相符。
用在线软件 InterProScan 进行保守结构域分析表明，LrF3H 编码的蛋白具有典型的保守结构域，
即 2OG-FeⅡ_Oxy 加氧酶结构域（从 Gln195 到 Pro294），该结构域由 2–O–酮戊二酸和 Fe2+–依赖的
加氧酶超家族组成（2OG-FeⅡ_Oxy superfamily），这个家族还包括赖氨酸水解酶、异青霉素合成酶、
脯氨酰 4–羟化酶和 AlkB（李晓艳 等，2012）。分析还发现 LrF3H 蛋白含有 4 个 Fe2+结合位点（His75，
His217，Asp219，His275）和 2–O–酮戊二酸结合位点（Arg285-X-Ser287），这些位点在已报道的海棠
（Crabapple）及蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）等植物的 F3H 蛋白中都存在（Shen et al.，2010；
Shen et al.，2012），而且都在相同或相近的位置，从而进一步推断 LrF3H 编码蛋白属于 2OG-FeⅡ_Oxy
双加氧酶家族中的 F3H。

图 3 石蒜 LrF3H 编码蛋白的二级结构（A）和三级结构（B）预测
Fig. 3 The predicted secondary structure（A）and tertiary structure（B）of LrF3H protein in L. radiate

2.3 石蒜 LrF3H 编码蛋白质的同源性及进化分析
利用 Blastp 对 LrF3H 编码的氨基酸序列进行同源检索（图 4）表明，LrF3H 与水仙（AFI08246.1）
F3H 的同源性最高，为 91%；与洋葱（AAO63022.1）、百合（BAE79203.1）和金花茶（ADZ28514.1）
等的同源性也较高，分别为 84%、80%和 80%。利用 ClustalX 及 GeneDoc 软件，对包括 LrF3H 在
内的 17 个物种的 F3H 基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析，从比对结果（图 4）可以看出，
结合亚铁离子的组氨酸（His）和天冬氨酸（Asp）以及参与结合 2–O–酮戊二酸的精氨酸（Arg）
和丝氨酸（Ser）在所有比对的植物中完全相同，这些高度保守的功能位点的存在表明 LrF3H 编码
的蛋白质可能与其它物种的 F3H 具有相同的功能。
966 园 艺 学 报 40 卷

图 4 石蒜 LrF3H 编码的氨基酸与其它物种 F3H 的氨基酸序列多重比对的部分结果
方框处表示 2OG-FeⅡ_Oxy 氧化酶的保守结构域；黑色三角表示与 Fe2+结合的保守组氨酸（His）和天冬氨酸（Asp）及与 2–O–酮戊二酸
结合的精氨酸（Arg）和丝氨酸（Ser）。NtcF3H：水仙，AFI08246.1；AcF3H：洋葱，AAO63022.1；LsF3H：鹿子百合，BAE79203.1；
DcF3H：胡萝卜，AAD56577.1；CnF3H：金花茶，ADZ28514.1；IpF3H：圆叶牵牛，ABW69678.1；AtF3H：拟南芥，AAC49176.1；
NtF3H：烟草，BAF96938.1；LcF3H：荔枝，ADO95201.1；DlF3H：龙眼，ABO48521.1；GhF3H：陆地棉，ABM64799.1；
MdF3H：苹果，BAB92997.1；PsF3H：牡丹，AEN71544.1；GtF3H：三花龙胆，BAD91806.1；
IhF3H：鸢尾，BAD86791.1；ZmF3H：玉米，NP_001105695.1。
Fig. 4 Alignment of the predicted amino acid sequences of LrF3H in L. radiata and those of several other plants
Boxes indicate the conserved structural domain of 2OG-FeⅡ-dependent dioxygenase. The black triangle indicates His，Asp，Arg and Ser residues of
the binding site of Fe2+ and 2-oxoglutarate respectively. NtcF3H：Narcissus tazetta var. chinensis，AFI08246.1；AcF3H：Allium cepa，AAO63022.1；
LsF3H：Lilium speciosum，BAE79203.1；DcF3H：Daucus carota，AAD56577.1；CnF3H：Camellia nitidissima，ADZ28514.1；IpF3H：Ipomoea
purpurea，ABW69678.1；AtF3H：Arabidopsis thaliana，AAC49176.1；NtF3H：Nicotiana tabacum，BAF96938.1；
LcF3H：Litchi chinensis，ADO95201.1；DlF3H：Dimocarpus longan，ABO48521.1；GhF3H：Gossypium hirsutum，ABM64799.1；
MdF3H：Malus × domestica，BAB92997.1；PsF3H：Paeonia suffruticosa，AEN71544.1；
GtF3H：Gentiana triflora，BAD91806.1；IhF3H：Iris × hollandica，BAD86791.1；
ZmF3H：Zea mays，NP_001105695.1.
5 期 黄春红等：石蒜黄烷酮 3–羟化酶基因 LrF3H 的克隆及表达分析 967

为进一步分析 LrF3H 与其它植物 F3H 之间的进化关系，在多重比对的基础上，利用 MEGA 4.0
软件，对上述植物以及长筒石蒜（何秋伶，2009）、甘薯（Ipomoea batatas，BAA75309.1）和鳄梨
（Persea americana，AAC97525.1）的 F3H 蛋白进行系统进化分析。结果（图 5）表明，LrF3H 的
进化基本符合植物分类学地位，并具有明显的种属特性，其中单子叶植物与双子叶植物分别聚为不
同的类，同科植物在进化树上处于同一分支。同为无患子科的荔枝和龙眼聚为一组，同是旋花科的
圆叶牵牛和甘薯聚为一组；而石蒜的 LrF3H 与同属的长筒石蒜的 F3H 亲缘关系最近，聚为一类，其
次与同为石蒜科的水仙的 F3H 亲缘关系较近。



图 5 石蒜 LrF3H 与其它物种 F3H 蛋白的系统进化树分析
Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of the LrF3H in L. radiata and those of other plants

2.4 石蒜 LrF3H 基因的表达分析
利用 RT-PCR、定量 PCR 产物的溶解曲线分析以及克隆测序等方法，对设计的 LrF3H 基因的定
量 PCR 引物的特异性和正确性进行了验证，结果发现扩增特异且产物大小、序列正确，可用于后续
实时荧光定量 PCR 分析。
石蒜不同发育时期的花瓣着色程度不同，从初蕾期到盛开期花瓣着色逐渐加深，而花瓣开始萎
蔫后红色变浅（图 6）。采用实时荧光定量 PCR 的方法，在花发育的各个阶段都能检测到 LrF3H 在
花瓣中表达，而且随着花蕾的增大及花瓣着色的加深，其表达量也增加，到花朵盛开期表达量最高；
之后随着花瓣逐渐萎蔫，表达量也开始下降；从相对表达量来看，LrF3H 在盛开期花瓣中的表达量
为初蕾期的 5 ~ 7 倍（图 7，A）。
LrF3H 基因在根、鳞茎、叶片、花葶、花瓣中均有表达，但表达水平差异明显，在花色素大量
积累的花瓣中和花葶中的表达量最高；而在根、鳞茎和叶片中表达量都较低，其中花瓣中 LrF3H 基
因的表达量是根和鳞茎中的 500 ~ 600 倍（图 7，B）。

968 园 艺 学 报 40 卷


图 6 石蒜花发育的不同阶段
Ⅰ. 初蕾期；Ⅱ. 中蕾期；Ⅲ. 花苞期；Ⅳ. 盛开期；Ⅴ. 凋谢期。
Fig. 6 Phenotype of different developing stages in L.radiata
. Ⅰ Early bud period； . Ⅱ Mid-bud period； . Ⅲ Bud period； . Ⅵ Blooming period； . Ⅴ Wither period.


图 7 LrF3H 基因的相对表达量
Fig. 7 Relative expression levels of LrF3H gene
3 讨论
植物花青素苷属于类黄酮次生代谢产物，其生物合成由一系列酶催化完成，黄烷酮 3–羟化酶
（F3H）是花青素苷合成早期的关键酶，它催化 4,5,7–三羟基黄烷酮 C3 位的羟化，生成二氢山奈
素（DHK），而 DHK 是花色素苷合成的必要前体物质，因而 F3H 基因在植物色泽形成中起重要作
用。F3H 属于 2–O–酮戊二酸和铁离子依赖的双加氧酶家族，其保守结构域中含有的 2–O–酮戊
二酸和铁离子结合位点是细胞色素 P450 家族基因普遍存在的活性中心结构（Owens et al.，2008）。
花色素苷合成途径中的花色素合成酶（ANS）也属于双加氧酶超家族，这两种酶在一些保守性基序
上有一定同源性（Rupert et al.，2002）。
本研究中利用同源克隆和 RACE 技术相结合的方法，从石蒜花瓣中克隆获得 F3H 的同源基因
LrF3H，并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。二级结构预测发现，该蛋白的二级结构以随
机卷曲为主，其次为 α–螺旋，再次是延伸链，无其它的二级结构元件，这一预测结果与已报道的
芜菁的 F3H 蛋白二级结构一致（许志如 等，2008）；而已报道的草莓、葡萄和海棠的 F3H 蛋白的
二级结构除了含有以上元件外，还存在 β–转角（β-turn）结构（Shen et al.，2012），这可以解释为
由于它们来自于不同的物种，可能存在一定的进化差异。保守结构域分析表明，该基因编码的蛋白
5 期 黄春红等：石蒜黄烷酮 3–羟化酶基因 LrF3H 的克隆及表达分析 969

具有典型的 2–O–酮戊二酸和 Fe2+–依赖的双加氧酶家族（2OG-FeⅡ_Oxy）的保守结构域，而且
在该结构域中含有与铁离子结合所需的组氨酸、天冬氨酸以及与 2–O–酮戊二酸结合的精氨酸、丝
氨酸保守位点，这些都是植物双加氧酶超家族基因的典型特征。系统进化分析显示，LrF3H 与同属
的长筒石蒜的 F3H 亲缘关系最近，其次与同为石蒜科的水仙亲缘关系较近，而与双子叶植物的金花
茶、陆地棉等的亲缘关系较远，表明 LrF3H 的进化具有明显的种属特性。
本研究中利用实时荧光定量 PCR 对 LrF3H 在石蒜花发育不同时期的花瓣及不同器官中的表达
量进行了检测，结果表明，在整个花发育过程中均能检测到 LrF3H 基因的表达，而且从初蕾期到盛
开期表达量逐渐增加，盛开期表达量最高，之后随着花朵萎蔫 LrF3H 表达量下降。说明在花发育过
程中，随着花的开放，花蕾增大，花瓣的红色着色加深，F3H 基因的表达量增大，其催化合成 DHK
的量也会增加，为花瓣中花青素苷和其他辅助色素的合成提供大量前体物质；而当花色稳定后 F3H
基因的表达量不再增加，随着花的枯萎，花瓣红色变浅，F3H 的表达量也降低。Shen 等（2012）用
实时荧光定量 PCR 方法检测了 F3H 基因在海棠（Crabapple）3 个不同品种叶片中的表达量，表明
了叶片中花青素的积累与 F3H 基因的表达量紧密相关。F3H 基因在石蒜花瓣中的表达量较高可能与
花青素的合成有关，推测 LrF3H 可能参与了石蒜花色形成的分子调控。该基因在其它器官中的表达
差异也较明显，在花葶中也有优势表达现象，原因可能是积累类黄酮化合物的器官有所不同，推测
花葶中可能存在类黄酮途径或原花色素途径，所以 LrF3H 基因表达活跃。这与长筒石蒜中 F3H 基
因的组织表达特性基本一致（何秋伶，2009）。
F3H 是花色素苷合成早期阶段的一个关键酶，可以通过导入外源目的基因、共抑制、反义抑制
或 RNAi 等方法上调或抑制 F3H 基因的表达，从而改变花色素苷的含量或成分，引起植物花色的变
化。Liu 等（2007）从烟草中分离出 F3H 基因，并构建其反义表达载体导入烟草，结果检测到烟草
中染料木素（5,7,4–三羟基异黄酮）的浓度上升，说明反义作用能够抑制 F3H 基因的表达，使代谢
流向异黄酮和黄酮方向。Zuker 等（2002）通过反义 RNA 技术抑制了香石竹（Dianthus caryophyllus）
‘Eilat’品种 F3H 基因的表达，结果导致其花瓣部分或完全失去了原来的橙红色，而且经过长期观
察，这个性状能遗传给后代。因此，本实验室今后拟通过转基因技术对 LrF3H 基因进行功能验证，
并进一步阐明 LrF3H 基因在石蒜花色形成中的作用机制，最终为分子水平上改良石蒜花色奠定基
础。

References
Chen Yan，Gao Yan-hui，Liao Wang-yi，Tong Zai-kang. 2009. Analysis on rDNA-ITS sequence and research of intra-specific phylogeny of Lycoris
albiflora. Journal of Plant Resources and Environment，18 (3)：25–31. (in Chinese)
陈 妍，高燕会，廖望仪，童再康. 2009. 乳白石蒜 rDNA-ITS 序列及种内系统发育研究. 植物资源与环境学报，18 (3)：25–31.
Deng Chuan-liang，Zhou Jian. 2005. Study on leaf micro-morphological characteristics of Lycoris（Amaryllidaceae）. Acta Bot Boreal-Occident Sin，
25 (2)：355–362. (in Chinese)
邓传良，周 坚. 2005. 石蒜属植物叶微形态特征研究. 西北植物学报，25 (2)：355–362.
He Qiu-ling. 2009. The basic relative study on molecular of color variation in Lycoris longituba[Ph. D. Dissertation]. Nanjing：Nanjing Forestry
University. (in Chinese)
何秋伶. 2009. 长筒石蒜花色变异的分子基础[博士论文]. 南京：南京林业大学.
Hu Yi-min，Guo Xing-ran. 1996. Exploitation and utilization of wild Lycoris radiata resources in Anhui. China Flower and Penjing，11：34–35. (in
Chinese)
胡一民，郭兴然. 1996. 安徽野生石蒜资源以及开发利用. 中国花卉盆景，11：34–35.
Li Xiao-yan，Pei Jia-bo，Zhang Zhi-dong，Wu Lin，Liu Hai-guang，Li Hai-yan，Li Ya-dong. 2012. Molecular cloning and expression analysis of
VcANS gene in blueberry. Journal of Northwest A & F University：Nat Sci Ed，40 (6)：201–209. (in Chinese)
970 园 艺 学 报 40 卷
李晓艳，裴嘉博，张志东，吴 林，刘海广，李海燕，李亚东. 2012. 越橘 VcANS 基因的克隆及表达分析. 西北农林科技大学学报：自
然科学版，40 (6)：201–209.
Lin Jin-zhen. 1986. The cross breeding test of Genus Lycoris and the measurement of its pollen viability. Hangzhou Botanical Garden，50 (2)：23–
25. (in Chinese)
林巾箴. 1986. 石蒜属植物杂交育种试验及花粉生活力之测定. 杭州植物园通讯，50 (2)：23–25.
Liu R，Hu Y，Li J，Lin Z. 2007. Production of soybean isoflavone genistein in non-legume plants via genetically modified secondary metabolism
pathway. Metabolic Engineering，9 (1)：1–7.
Martin C，Prescott A，Mackay S. 1991. Control of anthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinum majus. Plant J，1：37–49.
Owens D K，Crosby K C，Runac J，Howard B A，Winkel B S. 2008. Biochemical and genetic characterization of Arabidopsis flavanone-3
β-hydroxylase. Plant Physiology and Biochemistry，46 (10)：833–843.
Park E H，Kim C S，Yoo S O. 1988. Study on wild Lycoris radiata Herb. Ⅲ. Artificial propagation. Journal of the Korea Society for Horticultural
Science，29 (3)：232–246.
Qin Wei-hua，Zhou Shou-biao，Wang Heng-ying. 2004. A new chromosome number and karyotype in Lycoris radiata in Anhui Province. Guihaia，
24 (1)：29–32. (in Chinese)
秦卫华，周守标，汪恒英. 2004. 石蒜新核型及染色体数目在安徽的发现. 广西植物，24 (1)：29–32.
Rupert C W，Jonathan J T，Richard W D，Lan J C，Andrea G P，Christopher J S. 2002. Structure and mechanism of anthocyanidin synthase from
Arabidopsis thaliana. Structure，10：93–103.
Shen H X，Zhang J，Yao Y C，Tian J，Song T T，Geng J，Gao J P. 2012. Isolation and expression of McF3H gene in the leaves of crabapple. Acta
Physiol Plant，34：1353–1361.
Shen X Y，Martens S F，Chen M L，Li D F，Dong J L，Wang T. 2010. Cloning and characterization of a functional flavanone-3 β-hydroxylase gene
from Medicago truncatula. Mol Biol Rep，37：3283–3289.
Xu Zhi-ru，Cui Guo-xin，Li Chun-lei，Sun Yan，Li Yu-hua. 2008. Cloning，sequence analysis and expression of flavanone 3-hydroxylase gene in
turnip. Molecular Plant Breeding，6 (4)：787–792. (in Chinese)
许志如，崔国新，李春雷，孙 燕，李玉花. 2008. 芜菁黄烷酮 3–羟化酶基因的克隆、序列分析及表达. 分子植物育种，6 (4)：787–
792.
Yuan Ju-hong. 2011. Analysis of genetic diversity and inter-specific relationships of Lycoris（Amaryllidaceae）from China by SSR-PCR. Subtropical
Plant Science，40 (4)：1–7. (in Chinese)
袁菊红. 2011. 中国石蒜属遗传多样性与亲缘关系的 SSR 分析. 亚热带植物科学，40 (4)：1–7.
Zhang Hua-ling，Huang Yuan-she，Yang Chun-xian，Wu Jin-yu，Lu Jun，Zhang Qi-tang. 2010. Molecular cloning and sequences analysis of flavanone
3-hydroxylase gene from Fagopy rumtataricum. Acta Bot Boreal Occident Sin，30 (3)：447–452. (in Chinese)
张华玲，黄元射，杨春贤，吴觐宇，陆 俊，张启堂. 2010. 苦荞黄烷酮 3–羟化酶基因 F3H 的克隆及序列分析. 西北植物学报，30 (3)：
447–452.
Zhang Lu，Cai You-ming，Zhuge Qiang，Lou Lu-huan，Zou Hui-yu，Huang Min-ren，Wang Ming-xiu. 2002. Analysis of the inter-species relationship
on Lycoris（Amaryllidaceae）by use of RAPD. Acta Genetica Sinica，29 (10)：915–922. (in Chinese)
张 露，蔡友铭，诸葛强，楼炉焕，邹惠渝，黄敏仁，王明庥. 2002. 石蒜属种间亲缘关系的 RAPD 分析. 遗传学报，29 (10)：915–922.
Zhou Hou-jun，Huang Hua-hong，Lin Er-pei，Cheng Long-jun，Peng Sha-sha，Tong Zai-kang. 2010. Cloning and expression analysis of ACC oxidase
gene BlACO in Betula luminifera H. Winkl. Plant Physiology Communications，46 (9)：909–916. (in Chinese)
周厚君，黄华宏，林二培，程龙军，彭沙沙，童再康. 2010. 光皮桦 ACC 氧化酶基因 BlACO 的克隆和表达分析. 植物生理学通讯，46 (9)：
909–916.
Zhu Chong-sheng，Xie Shu-lu. 2008. Germplasm resources，medicinal exploitation of genus Lycoris and itsrapid propagation. Jiangxi Forestry
Science and Technology，(5)：41–42. (in Chinese)
朱重胜，谢树禄. 2008. 石蒜植物的种植资源、药用开发及其快速繁育. 江西林业科技，(5)：41–42.
Zuker A，Tzfira T，Hagit B M，Ovadis M，Shklarman E，Itzhaki H，Forkmann G，Martens S，Inbol N S，Weiss D，Vainstein A. 2002. Modification
of flower color and fragrance by antisense suppression of the flavanone 3-hydroxylase gene. Molecular Breeding，(9)：33–41.