全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（7）：1418–1426 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–03–12；修回日期：2014–05–06
基金项目：国家自然科学基金项目（31171993）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：Zhaolj5073@sina.com）
狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因 RcCKX5 的克隆
及表达分析
王 玲，高 彬，温 超，郗 琳，刘凤栾，马 男，赵梁军*
（中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193）
摘 要：利用 RACE 技术从狗蔷薇（Rosa canina）类根体中克隆得到 1 个细胞分裂素氧化酶基因 cDNA
全长，命名为 RcCKX5。序列分析表明，RcCKX5 cDNA 全长 1 815 bp，5′ UTR 104 bp，ORF 1 626 bp，3′ UTR
85 bp，编码 541 个氨基酸，具有 CKX 家族典型的 FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合域和 CK（细胞分裂
素）结合域。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示 RcCKX5 与可可 TcCKX5 亲缘关系最近，与拟
南芥 AtCKX5、乌拉尔图小麦 TuCKX5 同源性较高。荧光定量 PCR 分析表明，狗蔷薇 RcCKX5 在其根、
茎、叶、花、果实中均有表达，根中相对表达量最高，花和果实中相对表达量较高。在狗蔷薇类根体形
成发育过程中 RcCKX5 的相对表达量不断升高，21 d 时达到最高，随后稍有下降，表明其可能参与了类
根体的形成。6-BA 处理结果表明 RcCKX5 能够快速响应 6-BA 的诱导，表达量显著上调，2.5 mg · L-1 6-BA
处理 120 h 时，RcCKX5 的相对表达量达到最高峰。
关键词：狗蔷薇；类根体；细胞分裂素氧化酶；表达分析
中图分类号：S 685.12 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1418-09

Isolation and Expression Analysis of Cytokinin Dehydrogenase Gene
RcCKX5 in Rosa canina
WANG Ling，GAO Bin，WEN Chao，XI Lin，LIU Feng-luan，MA Nan，and ZHAO Liang-jun*
（Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，
China）
Abstract：Protocorm-like bodies（PLBs）is a new protocol of efficient regeneration，and the
development of rhizoids is a critical stage of PLB regeneration. Recent researches showed that cytokinin
regulated the formation of rhizoids. Here，we isolated the full length cDNA of a gene encoding cytokinin
dehydrogenase from rhizoids of Rosa canina，named RcCKX5. Sequence analysis indicated that RcCKX5
consisted of 1 815 bp，with ORF of 1 626 bp，5′ UTR of 104 bp，3′ UTR of 85 bp，encoded 541 amino acids.
The deduced amino acids possessed conserved domains of CKX family，FAD-binding domain and
cytokinin-bining domain. Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis showed that RcCKX5
had the highest similarity with TcCKX5 from Theobroma cacao. Real-time PCR analysis indicated that
expression level of RcCKX5 in root was the highest，and expression level in flower and fruit was high.

7 期 王 玲等：狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因 RcCKX5 的克隆及表达分析 1419

Expression level of RcCKX5 keep increasing all along the formation of rhizoids，reached the highest peak
in the twenty-first day，then decreased slightly. This indicated RcCKX5 might be involved in rhizoids
formation. RcCKX5 was significantly and rapidly induced by 6-BA，expression level of RcCKX5 reached
highest with the concentration of 2.5 mg · L-1 and time of 120 h.
Key words：Rosa canina；rhizoid；cytokinin dehydrogenase；expression analysis

类原球茎（protocorm-like body，PLB）再生途径是一种高效的、具有一定普遍性的再生体系，
可作为良好的遗传转化体系用于月季等蔷薇属植物的育种开发和研究工作（Tian et al.，2008；Guo &
Zhao，2011）。植物的再生，如器官发生和体胚发生，都受激素水平的影响，多种激素之间平衡互
作共同调节植物的离体再生。已有研究表明生长素和细胞分裂素对 PLB 再生起着重要的作用（张建
甫 等，2011；Gao et al.，2013）。狗蔷薇（Rosa canina）的 PLB 是由叶片经愈伤组织形成类根体，
类根体根尖再膨大萌发而形成的。因此，类根体阶段是 PLB 再生体系的关键阶段，是影响再生效率
的重要因素，对类根体的研究有助于对 PLB 的深入研究和利用。有研究发现，在类根体诱导过程中
添加激动素（Kinetin，KT）会降低类根体的发生率，细胞分裂素能够负调控类根体的形成（Gao et al.，
2013）。但关于细胞分裂素如何调控类根体形成，还有待进一步研究。
细胞分裂素氧化酶（Cytokinin dehydrogenase，CKX）是目前已知的唯一能够催化天然细胞分裂
素发生不可逆降解的酶,是降解内源细胞分裂素（Cytokinin，CK）的关键酶。该酶以分子氧为氧化
剂，催化 CK 的 N6 上不饱和侧链裂解使其彻底丧失活性（Hare & van Staden，1994）。CKX 是下调
内源细胞分裂素水平的关键酶，很多研究发现过表达 CKX 的转基因植株内源细胞分裂素水平与对照
相比明显下降（Galuszka et al.，2001；Kopečný et al.，2006；Werner et al.，2006）。
目前，关于细胞分裂素氧化酶的研究多集中于拟南芥和禾本科植物中，如玉米、水稻等。拟南
芥中已得到 7 个 CKX 基因（Werner et al.，2003）、玉米中已发现 13 个 CKX 基因（Gu et al.，2010）。
不同的 CKX 蛋白之间都具有高度保守的 FAD 结合域和 CK 结合域，在功能方面具有一定的相似性。
CKX 基因广泛存在于植物体内各个部位，但不同成员的表达特性存在一定差异。拟南芥 CKX 基因
均在根和芽中大量表达。CKX 参与调节植物多种生长发育过程。CKX 能够调节拟南芥根和芽的生
长发育（Ferreira & Kieber，2005；Riefler et al.，2006）。细胞分裂素可正调控茎分生组织而对根有
抑制作用（Hewelt et al.，1994；Kuderova et al.，2008），CK 缺乏会抑制茎分生组织且促进根的生长
发育。过表达拟南芥 CKX 基因的烟草和拟南芥表现出植株矮化、茎的生长受抑制，主根增长、侧
根增多、根系扩大等表型（Laplaze et al.，2007）。另外，CKX 能调控生殖器官发育（Igarashi et al.，
2009）、种子形成和作物产量（Ashikari et al.，2005；Bartrina et al.，2011）等。CKX 还与植物衰老
（Mytinova et al.，2010）及逆境反应（Mytinova et al.，2010；Macková et al.，2013）有关。
本试验中利用 RACE 技术分离得到狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因 RcCKX5 的 cDNA 全长，分析
其在不同组织和类根体发育过程中的表达特性，以及响应 6-BA 处理的表达情况，揭示该基因的功
能和特性，探索细胞分裂素如何参与调控类根体形成，为研究激素对 PLB 发生发育的影响及进一步
优化这一再生体系提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试材为狗蔷薇（Rosa canina），来源于中国农业大学科学园。取一年生茎段消毒灭菌，以其单芽
1420 园 艺 学 报 41 卷
表 1 引物名称及对应序列
Table 1 Primer names and corresponding sequences
引物名称
Primer name
相应序列
Corresponding sequence
RcCKX5-F1 CGGCCTGGGCCAGTTYGGNATHAT
RcCKX5-R1 AGCCAGGGGTGGGGNAVNTCCCA
RcCKX5-F2 AACAACTGGAGGTCATCTTTCT
RcCKX5-R2 GGATCAATGGAGGAGATATTGACAGGGT
full-RcCKX5-F CTGCCTCAAGATTTTGCTTCATTCC
full-RcCKX5-R TACATCCCTCCCTAAGTTTGTTGCT
q-RcCKX5-F ACGAGGGAGTGTTCAAGGGCA
q-RcCKX5-R GTTTCGTCCCCGGAATCCAAAG
18Sr-F CGCTACACTGATGTATTCAACGAGC
18Sr-R ACAATAATCCTTCCGCAGGTTCACC
茎段为外殖体接种于 MS 培养基上（含 6-BA 1.0 mg · L-1，NAA 0.004 mg · L-1，GA3 0.1 mg · L-1），
通过腋芽诱导获得组培苗并继代扩繁，置于人工培养室中培养。温度 25 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗，
光照强度 100 ~ 120 μmol · m-2 · s-1。类根体诱导参照 Tian 等（2008）的方法。
将狗蔷薇组培苗叶片接种于添加 2.5 mg · L-1 6-BA 的类根体诱导培养基（即 MS + 1.5 mg · L-1
2,4-D）上，置于人工培养室分别暗培养处理 0、4、8、16、24、72 和 120 h；另外将组培苗叶片分
别接种于添加 6-BA 0、0.025、0.1、0.25、1.0、2.5 和 5.0 mg · L-1 的类根体诱导培养基（即 MS + 1.5
mg · L-1 2,4-D）上，置于人工培养室暗培养处理 24 h。收集材料，液氮冷冻，置于–80 ℃保存待用。
1.2 狗蔷薇 RcCKX5 的克隆
采用多糖多酚植物 RNA 提取试剂盒（华越洋生物科技有限公司，下同）从狗蔷薇类根体中提
取总 RNA，用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整性。反转录使用 SuperscriptⅡ reverse
transcriptase（Invitrogen）进行，合成 cDNA 第 1 链。
根据 GenBank 上发表的拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、乌拉尔图小麦（Triticum
urartu）、可可（Theobroma cacao）的 CKX5 保守氨基酸序列和核苷酸序列，通过 Primer Premier 5
软件设计简并引物 RcCKX5-F1 和 RcCKX5-R1（表 1），以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应
条件为：94 ℃ 5 min；94 30 s℃ ，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物经
1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段并连接到载体 pMD18-T（大连宝生物工程有限公司），
转化大肠杆菌 DH5α（北京全式金生物技术有限公司），进行 Ampicillin 抗性筛选及阳性克隆鉴定，
进行 DNA 测序，（北京中科希林生物科技有限公司，下同），得到 RcCKX5 中间片段。
采用 RACE 试剂盒（大连宝生物工程有限公
司）扩增 RcCKX5 的 3′ 与 5′ 序列。根据所得到
的中间片段序列设计 3′ 特异性引物 RcCKX5-F2
（表 1），扩增得到 3′ 端序列；再设计 5′ 特异
性引物 RcCKX5-R2（表 1），扩增得到 5′ 端序
列。DNAMAN 6.0 软件拼接所获得序列，分别
在 5′ 端和 3′ 端非翻译区设计特异性引物
full-RcCKX5-F 和 full-RcCKX5-R（表 1），进
行校正，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，
60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35 个循环；72 ℃ 10
min。扩增得到含开放阅读框的 cDNA 全长，
测序。
1.3 序列生物信息学分析
利用 NCBI 的 ORF Finder，对 RcCKX5 的 cDNA 序列开放阅读框进行查找；利用 NCBI 网站的
BLAST 程序搜索相似性序列；利用蛋白质理化性质预测软件（http：//web.expasy.org/protparam/）预
测该蛋白质的分子量和等电点；使用 ClustalX 1.81 软件进行多重序列比对；采用 MEGA 4.0 构建系
统进化树，用自展法（Bootstrap）进行 1 000 次重复测试，数字表示不同节间的进化距离。
1.4 基因表达特性分析
根据所得 cDNA 序列设计一对基因特异性引物 q-RcCKX5-F 和 q-RcCKX5-R（表 1），以 18SrRNA
作为内参基因，其特异性引物为 18Sr-F和 18Sr-R（表 1）。将相应材料提取RNA并消化，采用FastQuant
7 期 王 玲等：狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因 RcCKX5 的克隆及表达分析 1421

RT Kit（With gDNase）（天根生化科技有限公司）反转录合成 cDNA 第一链，进行荧光定量 PCR 分
析。荧光定量 PCR 采用 KAPA SYBR FAST Universal 2× qPCR Master Mix（KAPA），按其说明书配
制反应体系，每个处理重复 3 次，在 ABI StepOne Plus 仪器上进行扩增分析。
2 结果与分析
2.1 狗蔷薇 RcCKX5 基因全长的获得
利用 RACE 的方法，从狗蔷薇中分离得到 RcCKX5cDNA 全长（图 1）。该基因 cDNA 全长 1 815
bp，5′ UTR 104 bp，ORF 1 626 bp，3′ UTR 85 bp，编码 541 个氨基酸，GenBank 登录号为 KF964496。
蛋白质结构域分析表明，RcCKX5 编码的氨基酸序列具有 CKX 家族的两个特征结构域：FAD（黄素
腺嘌呤二核苷酸）结合域和 CK 结合域。蛋白质理化性质预测其分子量为 60.0 kD，等电点为 5.41。

图 1 RcCKX5 基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide sequence of RcCKX5 cDNA and deduced amino acid sequence

2.2 RcCKX5 编码的氨基酸序列的生物信息学分析
将 RcCKX5 编码的氨基酸序列与 GenBank 上其他植物的 CKX5 同源蛋白序列——拟南芥
AtCKX5（NP_177678.2）、玉米 ZmCKX5（NP_001185958.1）、乌拉尔图小麦 TuCKX5（EMS58043.1）、
可可 TcCKX5（EOY14870.1）进行多重序列比对，结果（图 2）显示 RcCKX5 与其他 CKX5 氨基酸
序列具有较高的同源性，有多个保守区域。RcCKX5 与可可 TcCKX5 的同源性高达 80.2%，与拟南
芥 AtCKX5、乌拉尔图小麦 TuCKX5 和玉米 ZmCKX5 的同源性也分别达到了 73.4%、63.8%和 49.7%。
1422 园 艺 学 报 41 卷

图 2 RcCKX5 氨基酸序列同其他物种 CKX5 氨基酸序列比对
Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequence of RcCKX5 with CKX5 from other species

为了分析 RcCKX5 与其他 CKX 同源蛋白的系统进化关系，将其与其他 13 种植物 CKX 同源蛋
白进行多重序列比对，并用 MEGA 4.0 构建了系统发育树。结果（图 3）显示 RcCKX5 与可可 TcCKX5
的亲缘关系最近，其次与拟南芥 AtCKX5、乌拉尔图小麦 TuCKX5 亲缘关系较近，而与单子叶的玉
米 ZmCKX5 和石斛兰 DsCKX1 的进化关系相对较远。



图 3 RcCKX5 推测蛋白同其他物种 CKX 同源蛋白的系统进化树分析
图中数字代表进化距离。
Fig. 3 The phylogenetic tree of RcCKX5 and CKX proteins from other species
Number in the figure represent evolutionary distance.
7 期 王 玲等：狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因 RcCKX5 的克隆及表达分析 1423

图 5 类根体诱导过程中不同时期 RcCKX5 基因的表达
Fig. 5 Expression analysis of RcCKX5 during the
formation of rhizoids
图 4 RcCKX5 基因在狗蔷薇不同组织中的表达
Fig. 4 Exression pattern of RcCKX5 in different tissues
of Rosa canina
2.3 狗蔷薇 RcCKX5 组织表达特性分析
如图 4 所示，狗蔷薇 RcCKX5 在根、茎、叶、
花、果实中均有表达，在根中的表达量最高，在
花、果实中表达量次之，在叶和茎中表达量最低，
其中在根中的表达量是在茎中的 8.7 倍。
2.4 狗蔷薇 RcCKX5 在类根体诱导过程中的
表达情况
从图 5 和图 6 中可以看出，接种叶片后类
根体的诱导过程开始之后，RcCKX5 的表达量
逐渐增高，21 d 时表达量最高，为 0 d 的 20.2
倍，随后有所下降，28 d 时表达量为 0 d 的 16.7
倍。
分析类根体诱导过程中 RcCKX5 的表达
情况可以发现，14 ~ 21 d 之间叶片形成的愈伤
组织开始分化形成类根体，RcCKX5 的表达量
迅速增高达到最高峰，类根体成熟后表达量下
降，这说明 RcCKX5 的表达与类根体的发生呈
现正相关关系，RcCKX5 可能参与了类根体的
发生。


图 6 类根体诱导过程中不同时期的生长状态
Fig. 6 Growth state in different time during the formation of rhizoid

2.5 细胞分裂素 6-BA 处理对狗蔷薇 RcCKX5 表达的影响
通过不同浓度细胞分裂素 6-BA 处理类根体诱导过程中的叶片，结果如图 7 所示，随着 6-BA 处
理浓度的升高，RcCKX5 的表达呈逐步上升的趋势。其中浓度为 2.5 mg · L-1 时表达量达到最高，在
处理浓度为 0.25 ~ 2.5 mg · L-1 时，表达量均明显高于对照，说明 6-BA 能够诱导狗蔷薇 RcCKX5 的
表达。
如图 8 所示，细胞分裂素 6-BA 处理类根体诱导过程中的叶片不同时间，RcCKX5 的相对表达量
存在较大差异。处理后 4 h RcCKX5 表达量迅速增高，达到对照的 9.1 倍，随后逐渐降低，24 h 表达
1424 园 艺 学 报 41 卷
量最低，之后又不断升高，72 h 和 120 h 时的表达量分别达到对照的 10.6 倍和 15.3 倍。这些结果表
明细胞分裂素 6-BA 能够快速而显著地上调 RcCKX5 的表达。




3 讨论
狗蔷薇 PLB 再生体系具有一定普适性和高效性，可以作为一种良好的遗传转化体系用于月季的
研究和育种开发工作。类根体是狗蔷薇 PLB 再生的关键阶段，对类根体形成机制的研究有利于 PLB
再生体系的深入研究和利用。已有研究证明，生长素和细胞分裂素对于类根体的形成起着重要的作
用，但细胞分裂素调控类根体形成的机制还不太清楚。
本试验中从狗蔷薇中克隆得到 1 个细胞分裂素氧化酶基因 RcCKX5 cDNA 的全长。氨基酸序列
多重比对及系统发育树结果显示与 TcCKX5 亲缘关系最近，与 AtCKX5、TuCKX5 等均具有较高的
同源性，且具有保守的 FAD 结合域和 CK 结合域。这些结果表明，RcCKX5 为 CKX 家族同源基因，
可能与其他 CKX 具有相似的结构和功能。
组织表达分析表明，狗蔷薇 RcCKX5 在根、茎、叶、花、果实中均有表达，相对表达量依次为
根 > 花 > 果实 > 叶 > 茎。这与其他植物 CKX 的研究结果相似。拟南芥 AtCKX5 在根分生组织、
雄蕊和花药、腋生分生组织以及叶中的表达量都较高（Werner et al.，2006）。CKX 广泛存在植物体
内各个部位，玉米 CKX 主要在谷粒、根、老叶、成熟和未成熟的雄穗、未成熟的雌穗中大量表达（Bilyeu
et al.，2003；Massonneau et al.，2004）。大多数 CKX 基因都在根中大量表达（Werner et al.，2006；
Liu et al.，2013）。RcCKX5 在根中的大量表达说明其对根器官的生长发育起着重要的作用。相关研
究表明 CKX 能够促进根的发育，过表达 CKX 的转基因植株均表现出主根变长，侧根不定根增长，
根分生组织增大的表型（Schmülling et al.，2003；Lohar et al.，2004；Laplaze et al.，2007）。
类根体诱导发生过程中，RcCKX5 的表达量逐渐升高，在 21 d 时达到最高，是 0 d 的 20.2 倍，
此时是类根体发生的旺盛时期，28 d 时即类根体成熟后表达量稍有下降。RcCKX5 表达量的变化与
类根体发生过程相一致。CKX 能够负调控内源 CK 的水平（Kowalskaa et al.，2010；Dung et al.，2012），
因此分析认为 RcCKX5 的表达量的变化可能造成内源 CK 水平的变化，改变了激素平衡从而调节类
根体的形成。另外，有研究证明细胞分裂素在根中能够抑制根原基，并能调节根部细胞脱离根分生
组织促进维管组织的分化，过表达 CKX 能够逆转这种作用（Werner et al.，2006；Dello et al.，2007）。
图 7 不同浓度 6-BA 处理（24 h）对 RcCKX5 表达的影响
Fig. 7 Effect of 6-BA treated with different concentration
（24 h）on expression of RcCKX5
图 8 6-BA（2.5 mg · L-1）处理时间对 RcCKX5 表达的影响
Fig. 8 Effect of 6-BA（2.5 mg · L-1）treated for
different time on expression of RcCKX5
7 期 王 玲等：狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因 RcCKX5 的克隆及表达分析 1425

RcCKX5 在类根体发育过程中的表达特性以及在狗蔷薇根中的大量表达均说明该基因的表达与类根
体的发生呈现出正相关关系，具体是否参与了类根体发生还不能明确判断。
目前，关于 CKX 表达的可诱导性的报道有很多，大量的研究显示细胞分裂素能够迅速地上调
CKX 的表达。Brugière 等（2003）研究发现 6-BA 处理玉米叶片 24 h，ZmCKX1 的表达显著上调，
响应过程很迅速。小麦已发芽的胚经 10 μmol · L-1 的 6-BA 处理 12 h，TaCKX3 即受到强烈诱导（Ma
et al.，2011）。本研究中对类根体诱导过程中的狗蔷薇叶片施加不同浓度的 6-BA 处理，RcCKX5 的
表达量随 6-BA 浓度的升高不断上升，2.5 mg · L-1 时表达量最高，随后稍有下降，在一定浓度范围
（0.25 ~ 2.5 mg · L-1）内表达量明显上调，表明细胞分裂素能够诱导 RcCKX5 的表达。进一步分析
RcCKX5 响应 6-BA 表达调控的特性，发现叶片经 6-BA 处理 4 h 时后，RcCKX5 表达量迅速升高，
120 h 时表达量最高，达到对照的 15.3 倍，这说 RcCKX5 能够迅速的响应细胞分裂素的表达调控。
这与其他相关研究结果相一致。4 ~ 24 h 表达量短时间内的下降可能与培养过程中存在 2,4-D 有关，
2,4-D 可能动态地参与调节了 RcCKX5 表达。王瑛（2009）用 2,4-D 处理霍山石斛试管苗 15 d，DhCKX
的酶活性仅达到对照的 58.1%。
综上所述，RcCKX5 可能一定程度参与了类根体的形成过程，今后可通过测定类根体形成不同
时期的细胞分裂素含量进一步明确细胞分裂素与类根体形成的关系，为研究激素调控 PLB 再生的机
理提供一定的依据。

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