全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（8）：1642–1650 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–03–03；修回日期：2014–05–06
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201203071）；中国农业科学院科技创新工程项目（2013-2014）；中国农业科学院院所基
金项目（2060302-2-12）；国家‘863’计划项目（2011AA10020703）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangxiuxin@caas.com）
牡丹 PobZIP1 在种子发育中的表达及其与 ABA
含量的关系
张 萍，王顺利，朱富勇，薛璟祺，刘传娇，任秀霞，张秀新*
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：采用 RT-PCR 方法从‘凤丹’牡丹（Paeonia ostii‘Fengdan’）种子中克隆得到 1 个与 ABA
信号途径相关的转录因子基因 PobZIP1，并利用超高效液相色谱—串联质谱（UPLC–MS/MS）的方法测
定了不同发育时期种子的 ABA 含量。PobZIP1 cDNA 全长 957 bp，编码 318 个氨基酸，其编码的蛋白 C
末端含有 bZIP 转录因子的典型结构域，GenBank 登录号为 KJ009392。PobZIP1 蛋白与拟南芥 bZIP 转录
因子聚类分析显示，PobZIP1 转录因子属于拟南芥 bZIP 转录因子的 A 亚族，与 AtbZIP39/ABI5 聚在一起。
与其他物种 bZIP 蛋白的系统进化分析表明，牡丹 PobZIP1 与蔷薇科的苹果 bZIP 亲缘关系最近。SqRT-PCR
结果表明：PobZIP1 在‘凤丹’牡丹根、茎、叶和花芽中均有表达，其中花芽中的表达量最低，根、茎、
叶中的表达量相近。在种子发育过程中，PobZIP1 的表达呈现出先增加后降低的趋势。ABA 含量测定结
果显示，随着种子的发育 ABA 含量迅速上升，达到最大值后缓慢下降并保持在较高水平。推测种子发育
后期，较高含量的 ABA 和表达相对较高的 PobZIP1 可能是诱导种子休眠形成的原因。
关键词：牡丹；种子；ABA 含量；PobZIP1；半定量 RT-PCR
中图分类号：S 685.11 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）08-1642-09

Expression Analysis of the PobZIP1 Transcription Factor Gene in
Developmental Seeds from Tree Peony and Its Relationship with ABA
Content
ZHANG Ping，WANG Shun-li，ZHU Fu-yong，XUE Jing-qi，LIU Chuan-jiao，REN Xiu-xia，and ZHANG
Xiu-xin*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：One important transcription factor gene PobZIP1 involved in ABA signaling was obtained
by RT-PCR，first time in Paeonia ostii‘Fengdan’. And the abscisic acid（ABA）content in seeds of
‘Fengdan’from different developmental stages was analyzed by ultra-performance liquid chromatography/
tandem mass spectrometric（UPLC-MS/MS）method. The full length of the coding sequence of PobZIP1
was 957 bp，encoding a protein of 318 amino acid residues with a characteristic bZIP domain in the
C-terminal domain. The GenBank accession number is KJ009392. A phylogenetic analysis with other

8 期 张 萍等：牡丹 PobZIP1 在种子发育中的表达及其与 ABA 含量的关系 1643

bZIP proteins from Arabidopsis thaliana revealed that PobZIP1 belongs to the group A of bZIP
transcription factors，and it was closely related to AtbZIP39/ABI5. Then another phylogenetic tree was
constructed with other bZIPs from different species，the results suggested that PobZIP1 be closely related
to bZIP protein in Malus × domestica. Specific tissue and organ expression analysis showed that PobZIP1
could express in leaves，stems，roots and buds，while low expression in buds. The PobZIP1 expression
pattern of different developmental stages of seeds was up-down trend. The results suggested that ABA
content increased rapidly in early developmental stages of seeds，then decreased and kept relatively high
level. It has been hypothesized that the high level of ABA and PobZIP1 in late developmental stages could
induce seeds to dormancy.
Key words：tree peony；seed；ABA content；PobZIP1；semi-quantitative RT-PCR

牡丹种子在成熟过程中存在休眠特性，萌发周期较长，需要掌握适当的采收期，过早或过晚采
收都会影响种子萌发率和出苗整齐度。这一现象严重影响了牡丹杂交育种工作的正常开展。‘凤丹’
牡丹（Paeonia ostii‘Fengdan’）属于江南牡丹品种群，具有较高的观赏价值，同时兼具药用和油用
价值，也是栽培牡丹嫁接扩繁的首选砧木（李嘉珏，1999）。‘凤丹’为单瓣花，结实率高，易于扩
繁，且遗传背景相对简单，是研究牡丹种子休眠的优选材料。
脱落酸（Abscisic acid，ABA）是植物生长和发育过程中起重要作用的植物激素（Kermode，2005；
Finkelstein，2013）。ABA 含量的变化，会启动 ABA 诱导基因的转录，引起相应生理反应（Miyakawa
et al.，2013）。其主要过程是 ABA 应答元件结合蛋白（ABA responsive element binding proteins，
AREBs）与 ABA 调控表达所需的 ABA 响应元件（ABA-responsive elements，ABREs）相互作用，
进而激活 ABA 诱导基因的表达，碱性亮氨酸拉链转录因子（Basic region/leucine zipper motif，bZIP）
是一类重要的 ABA 应答元件结合蛋白（Bensmihen et al.，2005）。
bZIP 转录因子是真核生物中分布最广泛、最保守的一类转录因子，由富含碱性氨基酸的 DNA
结合域和一个亮氨酸拉链结构域（N-X7-R/K-X9-L-X6-L-X6-L）组成。bZIP 转录因子通过识别核心序
列为 ACGT 的顺式作用元件调控靶基因转录，在植物生长（Fukazawa et al.，2000）、花发育（Iven et
al.，2010）、种子成熟（Lara et al.，2003）和胁迫应答（Hossain et al.，2010）等生物学过程中发挥
作用。在拟南芥中已发现了 77 个 bZIP 转录因子，根据其结构特点和功能的差异将其分为 10 个（A、
B、C、D、E、F、G、H、I、S）亚族（Corrêa et al.，2008）。其中 A 亚族成员主要参与胁迫应答和
ABA 信号转导途径（Jakoby et al.，2002），如拟南芥的 AtbZIP39/ABI5 基因在发育的种子中参与 ABA
信号转导途径并激活 AtEm1 和 AtEm6 等 LEA 基因的表达（Finkelstein & Lynch，2000；Carles et al.，
2002），进而调控种子成熟与休眠。目前还未有文献报道内源 ABA 和 ABA 信号途径相关基因对牡
丹种子成熟与休眠的影响，因此探讨种子发育过程中 ABA 含量及其信号相关基因的表达模式具有
重要的理论意义。
本研究中以‘凤丹’牡丹为试验材料，采用 RT-PCR 的方法克隆得到了 1 个 bZIP 基因的同源基
因 PobZIP1，通过 SqRT-PCR 初步探讨了该基因在不同组织和种子不同发育时期的表达模式，同时
定量分析了种子发育过程中 ABA 含量变化趋势，这将为研究牡丹种子的发育与休眠特性提供理论
依据。
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1 材料与方法
1.1 试验材料
‘凤丹’牡丹于 2013 年取自中国农业科学院蔬菜花卉研究所牡丹资源圃内。在柱头大量分泌
粘液时（5 月 24 日）进行人工授粉、挂牌并套袋隔离。于授粉后 76、90、104、118 和 132 d 时，收
取无病虫害、成熟度一致的饱满种子，经液氮速冻后保存在–80 ℃以备 RNA 提取和 ABA 含量测定。
于‘凤丹’牡丹花芽膨大期分别收取根、茎、叶和花芽，液氮速冻后保存于–80 ℃以备组织特异性
表达分析。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA的提取和 cDNA的合成
种子总 RNA 的提取采用 Trizol 法（Wang et al.，2013）。用 1.2%琼脂糖凝胶检测 RNA 的完整性，
NanoDrop ND-1000 分光光度计检测 RNA 的质量。最后利用 Promega 的 M-MLV Reverse
Transcriptase、OligodT 和随机引物来合成 cDNA 链（Promega，M1701，USA）。
1.2.2 引物设计与 PCR反应体系
根据本实验室转录组测序得到的 PobZIP1 的 5′和 3′的部分序列和已发表的 PobZIP1 类似基因的
序列，利用 Primer 5.0 软件设计 1 对扩增 PobZIP1 完整开放读码框的正、反向引物。FP1：
5′-GTGGATTGAATGGGGACC-3′，RP1：5′-ATTAACGAGGGGGCTGAACTC-3′。以上述反转录的
cDNA 为模板进行 PCR 反应，反应体系为 30 μL。具体程序如下：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 45 s，
57.3 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 70 s，34 个循环；之后 72 ℃延伸 10 min。
扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，回收 PCR 产物，经过 pGEM-T 载体的连接、遗传转化、
菌液 PCR 阳性克隆鉴定，最后随机选取 3 个阳性克隆送至北京华大基因测序。
1.2.3 序列分析与系统进化树的构建
首先利用 NCBI 数据库（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）预测基因的开放读码框、BioEidt 7.0
和 DNAMAN 软件进行核酸和氨基酸比对分析、ExPaSy ProtParam 在线工具（http：//web. expasy. org/
protparam/）进行蛋白质基本理化性质预测与分析。然后利用 ExPaSy PSORT 在线工具（http：//psort.
hgc. jp/）进行亚细胞定位分析，ExPaSy SOPMA（http：//npsa-pbil. ibcp. fr/cgi-bin/）和 SWISS-MODEL
（http：//swissmodel. expasy. org/）在线工具进行蛋白质二、三级结构预测。最后利用 MAGA 5.2 软
件构建系统进化树。
1.2.4 半定量 RT-PCR反应
根据 SqRT-PCR 引物设计原则，利用 Primer 5.0 设计了 1 对 SqRT-PCR 引物。Sq-1F：5′-CAATCA
AACTGCTCTCCATCGTC-3′，Sq-1R：5′-AATCCTCCAAAGTCATCTCACCC-3′，其扩增子的长度为
164 bp。选择表达相对稳定的 Actin 基因（JN105298）作为内参基因。SqRT-PCR 反应体系为 30 μL，
具体步骤如下：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 1 min，59 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 45 s，34 个循环；
72 ℃延伸 10 min。每个 PCR反应至少做 3次重复，利用Bio-Rad Quantity One 软件定量分析PobZIP1
的相对表达量。
1.2.5 ABA含量测定
参考陈华君等（1991）的方法并做了优化，提取纯化‘凤丹’牡丹种子的 ABA。色谱纯甲醇和
乙酸乙酯购自 Fisher Scientific 公司，其余国产分析纯试剂购自北京化工厂，所有试剂和容器放在
–20 ℃预冷 6 h 备用，离心均在 4 ℃下进行。
8 期 张 萍等：牡丹 PobZIP1 在种子发育中的表达及其与 ABA 含量的关系 1645










图 1 牡丹 PobZIP1 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 PCR amplification result on agarose gel of PobZIP1
ABA 的提取：准确称取 1.0 g 种子（3 次重复），加入 0.5 g 铜试剂和少量石英砂，用 20 mL 80%
甲醇低温研磨成匀浆后转入 50 mL 离心管，4 ℃避光浸提过夜。次日加入 0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮，涡
旋振荡 10 min，6 500 r · min-1 离心 10 min。上清液转移到旋蒸瓶中，再用 10 mL 80%甲醇提取 2 次，
合并上清液。加入浓氨水调至 pH 9.0 后，35 ℃减压浓缩至水相。用 2 mol · L-1 HCl 调至 pH 2.5 ~ 3.0，
加入等体积乙酸乙酯萃取 3 次，6 500 r · min-1 离心 5 min，合并上清液。35 ℃减压浓缩至干，用 1 mL
50%甲醇洗脱，0.22 μm 微膜过滤。
采用超高效液相色谱—串联质谱（UPLC–MS/MS）法测定 ABA 含量。液相色谱仪型号为 Agilent
1260 Infinity，质谱仪型号为 AB SCIEX QTRAP 5500，外标购自 Sigma 公司。进样体积 1 µL，流动
相用乙腈和 0.1 %乙酸梯度洗脱。检测限 LOD 0.05 µg · L-1，定量限 LOQ 0.17 µg · L-1。标准曲线
为 y = 704.1x + 256.7，R2 = 0.9968，线性范围 3.0 ~ 110 mg · L-1。
2 结果与分析
2.1 牡丹 PobZIP1 cDNA 全长的克隆与序列分析
经测序分析，克隆得到的 cDNA 序列全长
为 967 bp（图 1），利用 NCBI ORF Finder 软
件预测其开放读码框为 957 bp。ExPaSy
ProtParam 在线工具分析结果表明其编码 318
个氨基酸，分子量为 35.58 kD，理论等电点为
8.81。该蛋白具有亲水性，属于亲水性蛋白。
氨基酸NCBI Blast分析发现，氨基酸序列与苹
果（Malus × domestica，ADL 36606.1）的 bZIP
蛋白相似性最高，达到 75%，故将克隆得到的
基因命名为 PobZIP1。
2.2 牡丹 PobZIP1 编码氨基酸的同源性分析
用 DNAMAN 软件进行氨基酸比对（图 2）发现，PobZIP1 蛋白的 COOH 末端具有典型的的 bZIP
基本结构域，即由碱性结构域（ N-RESAARS-R-ARKQAYTNE ）和 3 个重复的亮氨酸
（L-ENKVST-L-EEENER-L）组成，具有很高的保守性。该蛋白的 4 个保守域 C1 ~ C4 与拟南芥 bZIP
转录因子 A 亚族的结构特征相似，其中 C2 和 C3 含有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（S/T-X-X-D/E），在
此位点发生磷酸化后能调控 ABA 诱导基因的表达。同时 PobZIP1 还具有核定位序列 RRHKR（第
248 ~ 252 位的氨基酸）和 RRKK（289 ~ 292），推测 PobZIP1 蛋白位于细胞核内，这与亚细胞定位
预测结果（在细胞核内的确定性为 0.960）一致，因此 PobZIP1 在细胞核内作为转录因子调节下游
靶基因的表达。
ExPaSy SOPMA 蛋白二级结构分析表明 PobZIP1 包含 33 个 β–转角和 105 个 α–螺旋。拟南芥
bZIP 转录因子基因 A 亚族成员是由 AtbZIP39/ABI5 及相关基因组成的，因此本试验中用
SWISS-MODEL 工具比较了 PobZIP1 和 AtbZIP39/ABI5 蛋白的三级结构。结果（图 3）表明两者三
级结构相似，都是 1 条伸展的 α–螺旋。当两个蛋白质分子平行排列时，亮氨酸之间相互作用形成
两亲性的二聚体，碱性结构域与 DNA 上的顺式作用元件 ARBEs 相互作用以调控 ABA 诱导基因的
表达。因此推测 PobZIP1 与 AtbZIP39/ABI5 具有相似的功能，即被 SnRK2 磷酸化后与 LEA 等 ABA
诱导基因启动子区的 ABREs 结合，调控该基因的表达，从而实现 ABA 对种子发育和休眠的调节。
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图 2 PoZIP1 的推导的氨基酸序列与其他植物 bZIP 蛋白的多序列比对
C1 ~ C4：保守域；*：可能的磷酸化位点。
MdbZIP：苹果（ADL36606）；VvABI5：葡萄（XP_002265747）；AtAREB3：拟南芥（NP_191244）。
Fig. 2 Alignments of the deduced amino acid residues of PoZIP1 with bZIP proteins from other plants
C1–C4：Conserved domains. *：Potential phosphorylation sites.
MdbZIP：Malus × domestica（ADL36606）；VvABI5：Vitis vinifera（XP_002265747）；AtAREB3：Arabidopsis thaliana（NP_191244）.

图 3 PobZIP1 和 AtbZIP39/ABI5 蛋白三级结构预测
Fig. 3 The predicted tertiary structure of PobZIP1 and AtbZIP39/ABI5

2.3 牡丹 PobZIP1 系统进化分析
为了探讨牡丹 PobZIP1 与拟南芥 bZIP 转录因子基因家族的聚类关系，利用 PobZIP1 氨基酸序
列和拟南芥 bZIP 转录因子各亚族的两个成员构建了系统进化树。结果表明 PobZIP1 与
AtbZIP35/ABF1 和 AtbZIP39/ABI5 聚为一支，属于拟南芥 bZIP 转录因子 A 亚族（图 4），这与 PobZIP1
氨基酸保守域 C1 ~ C4 的分析结果一致。为了进一步探讨牡丹与其他物种 bZIP 转录因子的系统进化
关系，将PobZIP1氨基酸序列与其他13个物种的bZIP转录因子进行进化分析，结果表明牡丹PobZIP1
与蔷薇科的苹果、葡萄和梧桐科的可可编码的 bZIP 蛋白亲缘关系最近，而与单子叶植物二穗短柄草
和玉米编码的 bZIP 蛋白亲缘关系最远（图 5）。

8 期 张 萍等：牡丹 PobZIP1 在种子发育中的表达及其与 ABA 含量的关系 1647

图 4 牡丹 PobZIP1 与拟南芥 bZIP 蛋白的系统进化分析
节点上的数值表示自展值验证中基于 1 000 次重复该节点可信度的百分比（%）。
Fig. 4 Phylogenetic relationship among PobZIP1 and its orthologues in Arabidopsis thaliana
The number at the nodes represents the reliability percent（%）of bootstraps values based on 1 000 replication.



图 5 牡丹 PobZIP1 与其他物种 bZIP 蛋白的系统进化分析
节点上的数值表示自展值验证中基于 1 000 次重复该节点可信度的百分比（%）。
Fig. 5 Phylogenetic tree constructed by bZIP1 and bZIP-like protein from tree peony and other plants
The number at the nodes represents the reliability percent（%）of bootstraps values based on 1 000 replication.

2.4 PobZIP1 的 SqRT-PCR 表达分析
SqRT-PCR 结果表明，PobZIP1 在‘凤丹’牡丹的根、茎、叶和花芽中均表达，在根、茎和叶
中的表达量基本相似，而在花芽中的表达量最低，推测 PobZIP1 可能参与牡丹的营养生长（图 6，
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图 7）。‘凤丹’牡丹种子不同发育时期的表达结果显示，PobZIP1 在种子发育整个过程中都表达，
整体的表达趋势是先升高后降低。其中在授粉后 90 d 时表达水平最高（图 6，图 7），推测 PobZIP1
可能参与种子的发育。

图 6 PobZIP1 在‘凤丹’牡丹不同组织和发育种子中表达的电泳检测
Fig. 6 Expression of PobZIP1 in different tissues and developmental seeds from P. ostii‘Fengdan’was identified by agarose gels



图 7 PobZIP1 在‘凤丹’牡丹不同组织（A）和发育种子（B）中的表达分析
Fig. 7 Expression analysis of PobZIP1 in different tissues（A）and developmental seeds（B）from P. ostii‘Fengdan’

2.5 ‘凤丹’牡丹种子中 ABA 的含量
一般认为牡丹种子外果皮变成蟹黄色后，种子就已达到生理成熟并具备发芽能力，此时是适宜
的采收期。采收过早，由于种胚发育不完全、含水量高而降低萌发率，采收过晚种子进入休眠状态
而延迟萌发。为了更好地研究种子成熟过程中 ABA 含量的变化，测定了 5 个发育时期种子（图 8）
的 ABA 含量。











图 8 不同发育时期的‘凤丹’牡丹种子
Fig. 8 The morphology of seeds in different developmental stages
8 期 张 萍等：牡丹 PobZIP1 在种子发育中的表达及其与 ABA 含量的关系 1649













图 9 种子不同发育时期内源 ABA 的含量
Fig. 9 The endogenous ABA content in different
developmental seeds
结果（图 9）表明，随着种子的发育 ABA
含量呈现出快速升高后缓慢降低的趋势，这与
小麦（King，1976）、拟南芥（Karssen et al.，
1983）、大豆（Ackerson，1984）和板栗（郑郁
善，1998）等植物的 ABA 变化趋势一致。‘凤
丹’牡丹种子中的 ABA 含量从授粉后 90 d 开
始迅速上升并在 104 d 时达到最大值，为 64.47
ng · g-1 FW，约为 90 d 时的 2.4 倍。随着种子的
继续成熟，ABA 含量开始缓慢下降，这可能是
由种子脱水或 ABA 生理状态发生改变引起的，
而在 132 d时种子中ABA含量仍保持在较高水
平，为 53.53 ng · g-1 FW。
3 讨论
本研究中从‘凤丹’牡丹种子中克隆了 PobZIP1 全长 cDNA 序列，PobZIP1 含有与 AtABI5 结
构相似的亮氨酸保守域和 4 个保守域 C1 ~ C4，与其它物种 bZIP 氨基酸序列同源性达 50%以上，表
明该基因在进化过程中具有较高的保守性。PobZIP1 在‘凤丹’牡丹各组织中均表达，并且花芽中
的表达水平低于营养组织。在拟南芥中，AtABI5 在花和种子中的表达量远高于营养组织。Zhou 等
（2013）对甘蓝的根、茎、叶、花、种子和幼苗中 BolABI5 的表达水平进行研究，结果只从花中检
测到了 BolABI5。水稻的可变剪接产物 OsABI5-1 在叶中的表达量高于根和花序，而 OsABI5-2 在根、
叶和花序的表达量差别不大（Zou et al.，2007）。因此推测 ABI5 在不同物种中的组织表达模式不同。
很多研究发现，在种子发育过程中 ABA 含量在物质积累时期增加，在成熟脱水阶段开始下降，
并且大豆（Schussler et al.，1991）、苦瓜（秦国臣，2013）、挪威枫和美国梧桐（Pukacka & Gawrońska，
2002）种子中较高的 ABA 水平往往伴随着贮藏物质的快速积累。本试验中也得出类似结论，ABA
含量在‘凤丹’牡丹种子发育中后期保持在较高水平，种子干样质量在此时也快速增加。‘凤丹’
牡丹种子 ABA 含量在发育后期并没有快速下降至很低水平，推测此时高水平的 ABA 使种子进入休
眠状态而不能萌发，这与牡丹种子采收后短时间无法萌发的生理现象相似。
在拟南芥种子成熟的后期，AtABI5 的表达量达到最大值（Finkelstein & Lynch，2000；Lopez-
Molina & Chua，2000；Bensmihen et al.，2005），而‘凤丹’牡丹中 PobZIP1 的最大表达量发生在
发育前期，这可能是由于休眠特性的差异引起的。ABA 含量升高后能促进 ABI5 转录因子基因的表
达，从而调节 LEA 等种子相关基因的表达。本研究中发现 ABA 含量的最高时期晚于 PobZIP1 表达
量的最大时期，推测 PobZIP1 转录因子是与其他 AREBs 一起参与‘凤丹’牡丹中 ABA 诱导基因的
调控。总之，‘凤丹’种子中 ABA 信号转导相关基因 PobZIP1 的克隆及 ABA 含量的测定，为以后
深入研究牡丹种子的成熟和休眠机制奠定了理论基础。

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