全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（5）：859–868 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–12–31；修回日期：2014–03–06
基金项目：国家‘973’计划项目（2012CB113902）；国家科技支撑计划项目（2012BAD02B01）；重庆市农作物良种创新工程项目
[CSTC2012GG（80005）]；中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2014C179）
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gaoqg2004031@163.com；wxj@swu.edu.cn；Tel：023-68251274）
结球甘蓝叶片卷曲相关 7 个同源异型盒基因的
克隆与表达分析
任雪松，张林成*，蒲全明，高启国**，王小佳**，宋 明
（西南大学园艺园林学院，教育部南方山地园艺学重点实验室，重庆市蔬菜重点实验室，重庆 400715）
摘 要：以结球甘蓝（Brassica oleracea L.）‘519’品系为试材，通过结球期茎尖和叶片以及莲座期
茎尖和叶片的转录组对比分析，筛选出 4 个显著差异表达 HB 类基因，分别为 BoHAT2、BoHB12、BoHB7
和 BoHB27。进一步对上述 4 个基因以及调控拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片卷曲但在结球甘蓝转录
组中未检测到表达差异的基因 BoPHB、BoPHV 和 BoREV 进行了同源克隆。序列分析表明上述 7 个基因
都含有同源异型域（homeodomain，HD），具有同源异型盒（homeobox，HB）蛋白家族的典型结构特征。
BlastP（蛋白序列与蛋白库做比对）表明它们与拟南芥的同源蛋白相似性高，来自结球甘蓝的 BoHAT2、
BoHB12、BoHB7、BoHB27、BoPHB、BoPHV、BoREV 与拟南芥中的 HAT2、ATHB12 、ATHB 7、ATHB27、
PHB、PHV、REV 蛋白同源，同源性分别为 86%、80%、79%、60%、94%、95%和 96%。BlastP 比对和
进化树分析结果表明，BoHAT2 属于 HD-ZipⅡ类，BoHB12 和 BoHB7 属于 HD-ZipⅠ类，BoHB27 属于
ZF-HD，BoPHB、BoPHV 和 BoREV 属于 HD-Zip Ⅲ类。BoHAT2、BoHB12、BoHB7、BoHB27、BoPHB、
BoPHV、BoREV 在结球甘蓝莲座期到结球期的茎尖和叶片中均有表达，BoHB12 和 BoHB7 在结球期叶片
中表达量显著增高，分别是莲座期叶片的 38.1 倍和 6.2 倍，其余基因表达量差异不明显，表明 BoHB12 和
BoHB7 可能是结球甘蓝球叶自然卷曲过程中的主效调控基因。
关键词：结球甘蓝；同源异型盒蛋白；基因克隆；表达分析
中图分类号：S 635.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）05-0859-10

Molecular Clonging and Expression Analysis of Seven Homebox Genes
from Brassica oleracea
REN Xue-song，ZHANG Lin-cheng*，PU Quan-ming，GAO Qi-guo**，WANG Xiao-jia**，and Song Ming
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University；Key Laboratory of Horticulture Science for
Southern Mountainous Regions，Ministry of Education；Chongqing Key Laboratory of Olericulture，Chongqing 400715，
China）
Abstract：Four significantly differentially expressed HB（homeobox）analogs genes，BoHAT2，
BoHB12，BoHB7，BoHB27 were identified through transcriptome comparison of stem tip and leaf at
rosette stage and heading stage of cabbage（Brassica oleracea L.‘519’）. BoHAT2，BoHB12，BoHB7，

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BoHB27 and else three HB analogs genes BoPHB，BoPHV，BoREV，which were no transcription difference
at rosette stage and heading stage of cabbage but had been proved involving in the process of leaf curl in
Arabidopsis thaliana were isolated respectively using homologous cloning method. Amino acid sequence
analysis showed that seven genes share a homeodomain of homeobox family. BlastP analysis indicated all
of proteins are highly homologous with HB protein family from Arabidopsis thaliana. The similarity of
amino acid sequence of BoHAT2，BoHB12，BoHB7，BoHB27，BoPHB，BoPHV，BoREV genes are 86%，
80%，79%，60%，94%，95%，96% compared with HAT2，ATHB12，ATHB-7，ATHB27，PHB，PHV，
REV from Arabidopsis thaliana，respectively. Further BlastP and phylogenetic tree analysis indicated that
BoHAT2 belongs to HD-Zip Ⅱ protein，BoHB12 and BoHB7 belong to HD-Zip protein，BoHB27 belongs
to ZF-HD protein，BoPHB，BoPHV and BoREV belong to HD-Zip Ⅲ protein. The real-time PCR analysis
indicated the BoHAT2，BoHB12，BoHB7，BoHB27，BoPHB，BoPHV and BoREV genes express in stem
tip and leaf from rosette stage to heading stage. The BoHB12 and BoHB7 genes expressed higher in the
leaf of heading stage than the leaf of rosette stage，there were 38.1 times more BoHB12 transcription at
heading stage than rosette stage and 6.2 times more BoHB7 transcription at heading stage than rosette stage
were detected. No obvious expression difference was observed for else five genes between heading stage
and rosette stage. These results demonstrate the BoHB12 and BoHB7 genes may be the major genes that
involved in the process of cabbage leaf curl.
Key words：Brassica oleberacea；homeobox；gene cloning；expression analysis

结球甘蓝（Brassica oleracea L.）球叶的数量和卷曲程度直接影响叶球质量和叶球紧实度两大商
品性状。叶球的形成受温度、光照、营养、内源激素等因素的影响（吕家龙，2003）。基因的表达与
调控是植物接受外界信号进行发育的关键环节，因此分离结球甘蓝叶片卷曲和叶球形成过程中相关
的调控基因，将有助于了解结球甘蓝叶球形成的分子机制，同时为利用分子手段培育优质高产新品
种提供依据。
同源异型盒（homeobox，HB）蛋白是与发育有关的一类重要转录因子，其最显著特征是具有 1
个由 60 或 61 个氨基酸组成的高度保守的结构域——同源异型域（homeodomain，HD）（Johannesson
et al.，2001）。植物同源异型盒蛋白家族根据其中同源异型域基序的位置和序列差异，及其两侧序
列的同源性和其他保守结构域的不同，分为了 6 类（秦永芳 等，2009）。其中同源异型—亮氨酸拉
链蛋白（HD-Zip）是高等植物特有的一类转录因子，又分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ亚类，在细胞分化过程
中有重要的调控作用（Chan et al.，1998；Ariel et al.，2007）。拟南芥（Arabidopsis thaliana）PHB
（PHABULOSA）显性突变体 phb-1d，PHV（PHAVOLUTA）显性突变体 phv-1d 和 REV（REVOLUTA）
的显性突变体 rev-10d 叶片呈现不同程度的近轴面化（McConnell & Barton，1998；McConnell et al.，
2001；Emery et al.，2003），双重缺失突变体 rev phv 部分叶片和三重缺失突变体 rev phb/ + phv 的
全部叶片纵向向内卷曲（Prigge et al.，2005）。拟南芥 HYL1（HYPONASTIC LEAVES1）是叶极性
调控基因，它通过介导 miRNA 来调节 HD-Zip Ⅲ基因的表达，其缺失突变体 hyl1 叶片向内卷曲，
PHB、PHV、REV 增量表达（Lu & Fedoroff，2000；Yu et al，2003；Liu et al.，2011）。上述说明
HD-Zip 类基因与叶片卷曲有关。本研究中通过自然生长状态下结球甘蓝莲座期（21 片叶期）和结
球期（50 片叶期）的茎尖和叶片转录组对比，筛选出显著差异表达（log2RPKM 比值大于 2）的 4
个 HB 类基因 BoHAT2、BoHB12、BoHB7 和 BoHB27，但未检测出与叶片卷曲相关的拟南芥 PHB、
PHV 和 REV 的同源基因的表达差异，所以对 BoHAT2、BoHB12、BoHB7、BoHB27、BoPHB、BoPHV
和 BoREV 共 7 个基因进行了克隆鉴定和生物信息学分析，以 BoPHB、BoPHV 和 BoREV 基因作为对
5 期 任雪松等：结球甘蓝叶片卷曲相关 7 个同源异型盒基因的克隆与表达分析 861

比，利用荧光定量 PCR 技术分析了筛选出的 4 个基因在莲座期和结球期表达情况，以期筛选出参与
叶片卷曲调控的主效基因，为进一步验证这些基因在结球甘蓝叶片卷曲中的分子功能提供依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
供试材料‘519’为结球性好的中熟结球甘蓝品系，播种在西南大学十字花科蔬菜研究所实验农
场内，育苗 30 d 后移栽到田间。于莲座期总叶数 21 片时取靠近心叶长度为 1 cm 左右的两片莲座期
叶和茎尖（带 3 ~ 5 片真叶），于结球期总叶数为 50 片时取靠近心叶长度为 1 cm 左右的两片结球期
叶和茎尖（带 3 ~ 5 片真叶），用于总 RNA 的提取和转录组测序。
分别于莲座期（总叶数为 24 片）、中间期（莲座到结球的过渡期，总叶数为 40 片）、结球期（总
叶数为 60 片），取近心叶长度为 1 cm 左右的两片结球期叶和茎尖（带 3 ~ 5 片真叶），每种材料准
备 3 ~ 5 份作为生物学重复，用于基因表达的荧光定量分析。
1.2 总 RNA 的提取
用 Tiangen 公司的 RNA prep Pure 植物总 RNA 试剂盒 DP432 分别提取各材料的总 RNA。将各
材料RNA溶液稀释至相同浓度后参照TaKaRa公司的 PrimescriptTM RT reagent Kit RR047A的操作说
明反转录合成 cDNA。反转录完成后，经 NanoVue plus 超微量分光光度计（GE 公司）测定后将反
转录产物稀释至同一浓度，–20 ℃保存备用。
1.3 转录组数据分析及基因筛选
分别提取莲座期和结球期茎尖与叶片总 RNA 后送北京百迈克公司进行转录组测序，利用 Trinity
软件进行 Unigenes 组装，通过 RPKM 值来反映 Uigenes 表达丰度，用 IDEG6 软件进行差异表达基
因的检测，依据 Blast 比对和数据库检索从差异表达基因中筛选同源异型盒（HB）基因。
1.4 基因克隆验证
利用转录组测序组装获得的 Unigenes 序列结合芸薹属数据库（http：//brassicadb.org/brad/）比
对获得 cDNA 序列，运用 Primer primer 6.0 软件设计基因扩增引物（表 1）。

表 1 基因克隆引物与退火温度
Table 1 Primers used to isolate and annealing temperature
基因
Gene
正向引物序列（5′–3′）
Forward primer sequence
反向引物（5′–3′）
Reverse primer sequence
退火温度/℃
Ta
BoHAT2 CCCTTTTCGTGTTCTGTTTTTC TCACAACAACGGAAAGCAACA 56.6
BoHB12 AAGCAAGAAACTTCCAGGATC ACCAAAAATCCCACCAAGG 53.5
BoHB7 GCCAGCATCTCGAAAACAG CAGAATTACAAAGACTAACTGGGAG 54.4
BoHB27 GAAGCTTTAGCGACTTTGTACTCA ATTGTCATCATCAGTCTCTTTCCTC 56.4
BoPHB ATGATGGTCCACACGATGCACAGAG TCAAACGAACGACCAATTCACGAAC 65.2
BoPHV ATGATGGCTCACTCCATGGACGATA TCACAAGAAGGACCAGTTCACCAGG 64.5
BoREV ATGGAGATGGCGGTGGC TTACACAAACGACCAGTTTACAAAG 56.8

基因克隆 PCR 体系为 25 μL，以结球期茎尖 cDNA 为模板，具体操作按照高保真 DNA 聚合酶
PrimeSTAR 说明书进行。扩增参数为：98 ℃预变性 2 min；98 ℃变性 10 s；退火温度（表 1）30 s；
72 ℃ 延伸 30 s；35 个循环；72 ℃ 延伸 10 min。PCR 扩增产物经 1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测，回收
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纯化目的条带，扩增产物连接 pEASY-Blunt 载体，转化大肠杆菌感受态，蓝白斑筛选阳性克隆，经
菌落 PCR、酶切鉴定后送华大基因测序。
1.5 结球甘蓝 HB 基因生物信息学分析方法
克隆序列经 GenBank 中的 Blast 进行同源序列查找，采用 clustalx1.81 软件进行同源性比对；使
用MEGA5.1软件进行同源序列系统发育树的构建；通过CBS和NPS服务器上的 SOPMA、TMHMM、
SignalP 4.0、NetPhos 2.0 等程序对 7 个 HB 基因进行理化性质和序列结构分析，并通过 NCBI 的 Blast
进行序列比对结构分析。
1.6 HB 基因的定量表达分析
利用转录组测序组装获得的 Unigenes 序列、克隆获得的 cDNA 序列以及芸薹属数据库
（http：//brassicadb.org/brad/）比对结果设计基因特异性定量引物（表 2）。按照 SYBR® Premix Ex
Taq™Ⅱ操作说明，以 Actin 和 TIPS 为内参基因，在 Bio-Rad CFX96 荧光定量 PCR 仪上进行 PCR 扩
增，检测基因的表达变化情况。荧光定量 PCR 反应体系为 25 μL：2× SYBR® Premix Ex Taq™Ⅱ12.5
μL，引物各 1 μL，cDNA 模板 2 μL，超纯水 8.5 μL，混合加样。
PCR 反应程序为 95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，退火温度（表 2）30 s，72 ℃延伸 45 s，39
个循环；进行扩增曲线和溶解曲线分析。每个试验设置 3次生物学重复，3次技术性重复。利用Bio-Rad
CFX96 荧光定量 PCR 仪 CFX ManagerTM Software 软件（2–ΔΔCT 法）和 Excel 软件进行数据分析。

表 2 实时荧光定量引物与退火温度
Table 2 Primers used to Real-time PCR and annealing temperature
基因
Gene
正向引物序列（5′–3′）
Forward primer sequence
反向引物（5′–3′）
Reverse primer sequence
退火温度/℃
Ta
Actin CAATCTACGAGGGTTACGCTCTTCC GTGGTGAACATGTAACCTCTCTCGG 60.9
TIPS TTTGTATGAAGATGAACTGGCTGAC CCTCATAAGTACACCATCAACTCTAAGC 55.5
BoHAT2 TCAAAGAACACAACACTCTCAATCC TCTACGCATCGTTTCAAGTATTCAC 58.1
BoHB12 CAGAACAAGAGGGCTCGTTGGAAG CACCACAACACTCATCATTCCTTTC 60.3
BoHB7 GAGCCGAGGAAGAAGGTTCAGTTAG AGCCAAGTCGTTGTAGTTTTGTCTG 56.6
BoHB27 AGAGGCCGAAGAGAAGAAGAGGATC TTCCACCCCACCTTCTCAGCGTAAC 58.2
BoPHB TGACTGGGTTCAGATGATTGGTATG ACATCGACAATCACGGAGCCAAG 56.2
BoPHV TCTGGTCGTAAAGCTCTTTGTTCTG CTCCCCATGCTCGACACACATATTC 60.6
BoREV AGGCTTGGAGTGTTCCTGATGTGCT TAGTTGCCTGATATACCTCAATGCG 56.2
2 结果与分析
2.1 转录组数据分析与基因的筛选
通过各样品数据进行组装，共得到 54 209 条 Unigenes，莲座期茎尖与结球期茎尖相比差异表达
的基因达 652 条，莲座期叶片与结球期叶片相比差异表达的基因为 1 786 条。其 Unigenes 中获得了
42 条 HD 类基因，差异表达的 HD 类基因包括了 BoHAT2、BoHB12、BoHB7、BoHB27、BoHB16
和 BoHAT4（表 3）。在差异表达基因中均没有前人报道的包含 HD 区域且参与调控叶片近轴面的
AtPHB、AtPHV 和 AtREV 基因（Yu et al.，2003；Liu et al.，2011）。在差异表达的 6 个基因中 BoHAT2、
BoHB12、BoHB7和BoHB27差异显著，其中BoHAT2基因 log2(T2/T6)为 3.15；BoHB12基因 log2(T1/T5)
为 4.46，BoHB7 基因 log2(T2/T6)为 2.42，BoHB27 基因 log2(T2/T6)为 4.09。虽然 BoHB16 在莲座期
和结球期茎尖和叶片中表达量均有差异，但 log2(T1/T5)和 Log2(T2/T6)仅为–1.44 和–1.06。BoHAT4
基因仅在莲座期和结球期叶片中表达量存在差异且 Log2(T2/T6)值为–1.25。
5 期 任雪松等：结球甘蓝叶片卷曲相关 7 个同源异型盒基因的克隆与表达分析 863

表 3 结球甘蓝 42 个 HB 基因转录组数据分析
Table 3 Transcriptome data analysis of 42 HB genes in cabbage
茎尖 Stem tip 叶片 Leaf 基因编号
Gene
number
结球期(T1)
Head stage
莲座期(T5)
Rosette stage
log2(T1/T5)
结球期(T2)
Head stage
莲座期(T6)
Rosette stage
Log2(T2/T6)
Swissport 蛋白质
数据库注解
Swissprot annotation
备注
Comment
Unigene01 sp|P92953|ATHB4
Unigene02 sp|P46667|ATHB5
Unigene03 sp|P46668|ATHB6
Unigene04 32.00 6.00 2.42 sp|P46897|ATHB7 BoHB7
Unigene05 sp|Q39123|ATHB8
Unigene06 sp|O04292|ATBH9 BoPHV
Unigene07 22.00 1.00 4.46 38.00 4.00 3.25 sp|Q9M276|ATB12 BoHB12
Unigene08 sp|Q8LC03|ATB13
Unigene09 sp|O04291|ATB14 BoPHB
Unigene10 sp|Q9ZU11|ATB15
Unigene11 32.00 87.00 -1.44 24.00 50.00 -1.06 sp|Q940J1|ATB16 BoHB16
Unigene12 sp|Q8S9N6|ATB17
Unigene13 sp|Q9ZU70|ATB21
Unigene14 sp|Q4PSR7|ATB22
Unigene15 sp|Q8LFD3|ATB23
Unigene16 17.00 1.00 4.09 sp|Q9SB61|ATHB27 BoHB27
Unigene17 sp|O23208|ATB40
Unigene18 sp|Q9LZR0|ATB51
Unigene19 sp|Q9LVR0|ATB53
Unigene20 sp|Q8GXM7|ATHBX
Unigene21 sp|Q8RWU4|ATML1
Unigene22 sp|P46600|HAT1
Unigene23 148.00 53.00 1.48 62.00 7.00 3.15 sp|P46601|HAT2 BoHAT2
Unigene24 sp|P46602|HAT3
Unigene25 16.00 38.00 -1.25 sp|Q05466|HAT4 BoHAT4
Unigene26 sp|Q02283|HAT5
Unigene27 sp|Q00466|HAT7
Unigene28 sp|P46603|HAT9
Unigene29 sp|P46665|HAT14
Unigene30 sp|P46604|HAT22
Unigene31 sp|Q9M2E8|HDG1
Unigene32 sp|Q94C37|HDG2
Unigene33 sp|Q9FJS2|HDG5
Unigene34 sp|Q9M9P4|HDG8
Unigene35 sp|Q9S9Z0|HDG10
Unigene36 sp|Q9FX31|HDG11
Unigene37 sp|Q9LMT8|HDG12
Unigene38 sp|P46607|HGL2
Unigene39 sp|Q93V99|PDF2
Unigene40 sp|Q9SE43|REV BoREV
Unigene41 sp|O81788|WOX13
Unigene42 sp|P0CJ66|Y1705
注：没有数值的行表示未检测到表达差异。
Note：The empty cells mean no expression differences were detected.

2.2 基因的 PCR 克隆与序列的生物信息学分析
分别以结球期茎尖和叶片组织总 RNA 反转录的 cDNA 为模板，对表达差异显著（log2RPKM 比
值大于 2）的 4 个基因 BoHAT2、BoHB12、BoHB7 和 BoHB27 以及转录组未检测到表达差异但在拟
南芥的同源基因中与叶片卷曲有关的 3 个基因 BoPHB、BoPHV 和 BoREV 进行了 PCR 扩增，扩增出
7 个基因的 cDNA 序列。序列分析表明这 7 个基因都具有 1 个完整的开放阅读框，各基因编码的氨
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基酸序列经 CBS 服务器上的 SignalP 4.1 和 TMHMM 分析，均无信号肽结构，且未形成跨膜蛋白结
构域，说明 7 个基因编码的蛋白都不属于膜蛋白或分泌蛋白。通过 NPS 服务器上的 SOPMA 程序对
其二级结构进行预测，预测它们的二级结构均有 α 螺旋、β 折叠、β 转角和无规则卷曲，其中主要
由 α 螺旋和无规则卷曲组成。使用 CBS 网站的 NetPhos 2.0 对该序列进行磷酸化位点分析，结果显
示 7 个基因编码的蛋白均具有多个可能的蛋白激酶磷酸化位点，并且以 Ser 位点为主（表 4）。

表 4 基因及其编码的蛋白质特征
Table 4 The feature prediction of Genes and their coded proteins
蛋白质二级结构预测/%
Protein secondary structure prediction
可能的磷酸化位点数预测
Possible phosphorylation site
（PKC）number prediction 基因 Gene
ORF 区域/bp
Open reading
frame region
氨基酸
残基数
Base of amino
acid residues α 螺旋
Alpha helix
β 折叠
Extended strand
β 转角
Beta turn
无规则卷曲
Random coil Ser Thr Tyr
BoHAT2 825 274 23.36 12.41 4.74 59.49 15 6 0
BoHB12 687 228 37.72 9.65 3.07 49.56 5 2 1
BoHB7 765 254 38.58 10.63 4.33 46.46 8 4 4
BoHB27 870 289 24.57 4.15 3.87 67.47 14 10 3
BoPHB 2 550 849 43.7 12.84 3.53 39.93 40 13 5
BoPHV 2 523 840 42.02 14.76 3.57 39.64 40 15 6
BoREV 2 544 847 41.68 11.92 3.66 42.74 27 9 7

通过 NCBI 在线 Blast 比对，在绘制的蛋白结构示意图（图 1）中显示这 7 个基因都具有典型的
同源异型域（HD），说明它们都属于同源异型核蛋白家族（HB）。BoHB27 具有两个同源异型域
（HD）和锌指蛋白二聚体结构（dimerization motif，DM），属于锌指蛋白（ZF-HD）家族； BoHB12、
BoHB7 还具有同源异型域（HD）、亮氨酸拉链域（leucine zipper，LZ），属于 HD-ZipⅠ类；BoHAT2
具有 N 端一致序列（N-terminus consensus，N-Term）、同源异型域（HD）、亮氨酸拉链域（LZ）
和 CPSCE 结构域，属于 HD-Zip Ⅱ类；BoPHB、PoPHV、BoREV 具有同源异型域（HD）、亮氨酸
拉链域（LZ）、脂质/类固醇结合受体（steroidogenic acute regulatory proterin-related lipid transfer
domain，START）和较保守的 MEKHLA 序列，属于 HD-Zip Ⅲ类。


图 1 各蛋白结构示意图
HD：同源异型域；LZ：异亮氨酸拉链域；N-Term：N 端一致序列；DM：二聚体；
START：脂质/类固醇结合受体；MEKHLA：较保守的 MEKHLA 序列。
Fig. 1 Structure diagram of each protein
HD：Homeodomain；LZ：Leucine zipper；N-term：N-terminus consensus；DM：Dimerization motif；
START：Steroidogenic acute regulatory proterin-related lipid transfer domain；
MEKHLA：Named after the highly conserved amino acids Met.

5 期 任雪松等：结球甘蓝叶片卷曲相关 7 个同源异型盒基因的克隆与表达分析 865

2.3 HB 家族的同源序列比对和系统发育树分析
同源序列比对分析表明结球甘蓝同源异型核蛋白与拟南芥同源异型核蛋白有较高的同源性。结
球甘蓝的 BoHAT2、BoHB12、BoHB7、BoHB27、BoPHB、BoPHV 和 BoREV 与拟南芥的 AtHAT2、
AtHB12、AtHB7、AtHB27、AtPHB、AtPHV 和 AtREV 同源性为分别为 86%、80%、79%、60%、
94%、95%和 96%。在线收集 41 个 HB 蛋白序列构建系统进化树（图 2）分析表明，41 个 HB 蛋白
根据其 NCBI 网站 Blastt 比对分析结构，分为 4 个类型，分别为 HD-ZipⅠ类蛋白、Ⅱ类蛋白、Ⅲ

图 2 不同植物 41 个 HB 蛋白序列系统发育树分析
Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of 41 protein sequences of HB from different plants
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类蛋白和 ZF-HD 蛋白。结球甘蓝的 BoHAT2 与拟南芥的 AtHAT2、AtHAT1 亲缘关系较近，处于一
个小分支，都属于 HD-Zip Ⅱ类蛋白；结球甘蓝的 BoHB12、BoHB7 与拟南芥的 AtHB12、AtHB7
亲缘关系较近，共同处于一个小分支，都属于 HD-ZipⅠ类蛋白；结球甘蓝的 BoHB27 与拟南芥的
AtHB27 亲缘关系较近，处于一个小分支，属于 ZF-HD 蛋白；结球甘蓝的 BoREV、BoPHB、BoPHV
和分别与拟南芥的 AtREV、AtPHB、AtPHV 处于一个小分支，都属于 HD-Zip Ⅲ类蛋白。
2.4 HB 家族基因时空表达的 qPCR 检测
利用荧光定量 PCR 技术分析上述 7 个 HB 基因表达情况，结果（图 3）显示，7 个 HB 基因在
结球甘蓝莲座期、中间期与结球期的茎尖和叶片中均有表达，但表达模式各不相同。其中 BoHAT2
在茎尖中表达量变化不太明显，在叶片中的表达量增幅明显，在中间期叶片和结球期叶片中的表达
量分别为莲座期叶片的 4.7 倍和 2.2 倍；BoHB12 在茎尖中表达量变化不大，而在中间期叶片和结球
期叶片中的表达量分别为莲座期叶片的 9.9 倍和 38.1 倍；BoHB7 在中间期茎尖和结球期茎尖的表达

图 3 结球甘蓝 HB 基因的时空表达特性
Fig. 3 Spatiotemporal expression patterns of HB genes in cabbage
5 期 任雪松等：结球甘蓝叶片卷曲相关 7 个同源异型盒基因的克隆与表达分析 867

量分别为莲座期的 2.1 倍和 3.6 倍，中间期叶片和结球期叶片中表达量为莲座期叶片的 5.6 倍和 6.2
倍；BoHB27 在 3 个时期的茎尖和叶片中的表达量差异不明显；BoPHB 在 3 个时期的茎尖中表达量
变化不大，而在结球期叶片中表达量降低，为莲座期叶片的 0.49 倍；BoPHV 在 3 个时期的叶片中
的表达量变化不大，而在中间期茎尖与结球期茎尖分别为莲座期的 2.3 倍和 2.2 倍；BoREV 在中间
期与结球期茎尖中表达量约为莲座期茎尖的 0.56 倍和 0.58 倍，中间期与结球期叶片中表达量约为
莲座期茎尖的 0.48 倍和 0.22 倍。
上述 7 个基因表达变化对比表明：从莲座期到结球期，叶片中 BoHB12 表达量增幅最大，结球
期叶片中表达量达到莲座期叶片的 38.1 倍；BoHB7 表达量增幅其次，结球期叶片中表达量达到莲座
期叶片的 6.2 倍；包括之前报道的与拟南芥叶片卷曲相关的 PHB、PHV 和 REV 在内的其他 5 个基因
的表达量变化不显著。这与转录组分析的结果基本一致。
3 讨论
叶片卷曲对多数植物来说会破坏叶片平展性，影响其光合作用、蒸腾作用、呼吸作用等生理功
能，但对结球甘蓝等以叶球为食用器官的作物来说则是一种极其有用的农艺性状。叶片向内卷曲是
结球甘蓝叶球发生的重要特征，同时也为研究叶片卷曲提供了理想的材料。探讨分析结球甘蓝叶片
卷曲相关基因的表达，对研究结球甘蓝叶球发育机制具有非常重要的意义。目前结球甘蓝叶片卷曲
相关基因的研究不多，本研究中基因克隆与序列分析表明，BoHB12 只有 687 bp，BoPHB 有 2 550 bp，
获得的 7 个基因虽然长短差异极大，但进化树分析表明它们的氨基酸序列与拟南芥中的同源基因编
码的氨基酸序列有较高的同源性，除具有同源异型域（HD）以外，BoHB12、BoHB7、BoHAT2、 BoPHB、
BoPHV、BoREV 都还具有亮氨酸拉链结构（LZ），同属于亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）家族，BoHB27
还具有锌指蛋白二聚体结构，属于锌指蛋白（ZF-HD）家族。7 个结球甘蓝 HB 基因与拟南芥同源
基因在进化上高度保守，因此推测结球甘蓝中上述基因可能与其拟南芥中的同源基因具有类似的生
物学功能。
本研究中用结球甘蓝自然生长状态下莲座期、中间期、结球期的茎尖和叶片为材料，研究了 7
个HB基因在不同时期材料中的表达量变化。研究表明拟南芥 35S︰︰HAT2转基因植株表现长下胚轴，
子叶向下反卷，长叶柄，小叶子，侧根长度缩短，对生长素敏感性降低（Sawa et al.，2002）。本研
究中转录组分析和定量分析均表明其对应的 BoHAT2 同源基因在结球甘蓝结球期的茎尖和叶片中均
上调表达，但变化不太显著。拟南芥中 BoHB12 和 BoHB7 同源基因 ATHB7、ATHB12 受病毒感染诱
导表达，拟南芥植株表现发育不良、叶片向内卷曲、异常花序及根结构异常等变化（Park et al.，2011），
另外 35S︰︰ATHB7、35S︰︰ATHB12 转基因拟南芥植株叶片比野生型变短（Hjellström et al.，2003；
Valdés et al.，2012）。本研究中转录组分析和定量分析均表明从结球甘蓝莲座期到结球期，叶片中
BoHB12 和 BoHB7 表达量出现大幅度增加。野生的拟南芥具有平展的叶片，但拟南芥 hyl1 突变体的
叶片向上向内卷曲，研究表明 HYL1 通过介导 miRNA165/166 来调节 HD-Zip Ⅲ基因的表达，其 hyl1
突变体叶中 PHB、PHV 和 REV 的表达量出现明显上调显示 PHB、PHV、REV 参与拟南芥叶片卷曲
的调控（Liu et al.，2011）。但是在结球甘蓝自然生长状态下莲座期、中间期、结球期的茎尖和叶
片，通过转录组分析没有检测到 BoPHB、BoPHV 和 BoREV 基因在莲座期茎尖和叶片与莲座期茎尖
和叶片中表达的变化。进一步荧光定量分析结果显示在卷曲的结球期叶片较平展的莲座期叶片中
BoPHB、BoPHV、BoREV 表达出现下调，但变化幅度不明显。拟南芥 hyl1 是单一基因突变下引起
的野生型平展叶片的卷曲，与此不同的是，结球甘蓝球叶是自然生长状态下的向内向上卷曲，形成
叶球，其形成受温度、光照、营养、内源激素等因素的影响，是在环境因素诱导下的一个复杂的生
868 园 艺 学 报 41 卷
物学过程。本研究中通过转录组结合荧光定量分析了 7 个 HB 类基因的表达情况，结果表明 BoHB12
和 BoHB7 两个基因表达变化最显著，由此推测 BoHB12 和 BoHB7 可能在结球甘蓝球叶的自然卷曲
过程中起了主效调控作用。下一步计划进行 BoHB12 和 BoHB7 的遗传转化研究，进一步进行基因功
能验证分析。

References
Lü Jia-long. 2003. Selective olericulture（southern local）. Beijing：China Agriculture Press：166–168. (in Chinese)
吕家龙. 2003. 蔬菜栽培学各论（南方本）. 北京：中国农业出版社：166–168.
Johannesson H，Wang Y，Engström P. 2001. DNA-binding and dimerization preferences of Arabidopsis homeodomain-leucine zipper transcription
factors in vitro. Plant Molecular Biology，45：63–73.
Qin Yong-fang，Li Deng-di，Li Xue-bao. 2009. Progress in HD-Zip transcription factors of plant. Chinese Journal of Cell Biology，31 (4)：514–
520. (in Chinese)
秦永芳，李登弟，李学宝. 2009. 植物 HD-Zip 转录因子研究进展. 细胞生物学杂志，31 (4)：514–520.
Ariel F D，Manavella P A，Dezar C A，Chan R L. 2007. The true story of the HD-Zip family. Trends in Plant Science，12 (9)：419–426.
Chan R L，Gago G M，Palena C M，Gonzalez D H. 1998. Homeoboxes in plant development. Biochimica et Biophysica Acta，1442：1–19.
McConnell J R，Barton M K. 1998. Leaf polarity and meristem formation in Arabidopsis. Development，125：2935–2942.
McConnell J R，Emery J，Eshed Y，Bao N，Bowman J，Barton M K. 2001. Role of PHABULOSA and PHAVOLUTA in determining radial
patterning in shoots. Nature，411：709–713.
Emery J F，Floyd S K，Alvarez J，Eshed Y，Hawker N P，Izhaki A，Baum S F，Bowman J L. 2003. Radial patterning of Arabidopsis shoots by
class Ⅲ HD-ZIP and KANADI genes. Current Biology，13：1768–1774.
Prigge M J，Otsuga D，Alonso J M，Ecker J R，Drews G N，Clark S E. 2005. Class Ⅲ homeodomain-leucine zipper gene family members have
overlapping，antagonistic，and distinct roles in Arabidopsis development. Plant Cell，17：61–76.
Lu C，Fedoroff N. 2000. A mutation in the Arabidopsis HYL1 gene encoding a dsRNA binding protein affects responses to abscisic acid，auxin，and
cytokinin. Plant Cell，12：2351–2366.
Yu L，Yu X H，Shen R J，He Y K. 2005. HYL1 gene maintains venation and polarity of leaves. Planta，221：231–422.
Liu Z Y，Jia L G，Wang H，He Y K. 2011. HYL1 regulates the balance between adaxial and abaxial identity for leaf flattening via miRNA-mediated
pathways. Journal of Experimental Botany，62 (12)：4367–4381.
Sawa S，Maki O，Goda H，Higuchi K，Shimada Y，Yoshida S，Koshiba T. 2002. The HAT2 gene，a member of the HD-Zip gene family，isolated
as an auxin inducible gene by DNA microarray screening，affects auxin response in Arabidopsis. The Plant Journal，32：1011–1022.
Park Jungan，Lee Hyun-ju，Cheon Choong-III，Kim Sung-han，Hur Yoon-sun，Auh Chung-Kyun，Im Kyung-Hwan，Yun Dae-Jin，Lee Sukchan，
Davis K R. 2011. The Arabidopsis thaliana homeobox gene ATHB12 is involved in symptom development caused by geminivirus infection.
PloS One，6 (5)：1–7.
Hjellström M，Olsson A S B，Engström P，Söderman E. 2003. Constitutive expression of the water deficit-inducible homeobox gene ATHB7 in
transgenic Arabidopsis causes a suppression of stem elongation growth. Plant，Cell and Environment，26：1127–1136.
Valdés A E，Övernäs E，Johansson H，Rada-Iglesias A，Engström P. 2012. The homeodomain-leucine zipper（HD-Zip)classⅠtranscription factors
ATHB7 and ATHB12 modulate abscisic acid signalling by regulating protein phosphatase 2C and abscisic acid receptorgene activities. Plant
Molecular Biology，80 (4–5)：405–418.