全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2002 , 29 (6) : 579～580
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 11 - 01 ; 修回日期 : 2002 - 03 - 15
基金项目 : 国家“863”项目 (2001AA241121202) ; 教育部中青年骨干教师资助项目
结球甘蓝 cDNA 文库的构建和鉴定
曹必好1 ,2 　雷建军1 ,2 　宋洪元1 　宋　明1 　杨朝辉1 　Chengbin Xiang3
David. J . Oliver3 　李淡琼1
(1 西南农业大学园艺系 , 重庆 400716 ;　2 华南农业大学园艺系 , 广州 510642 ;　3 美国依阿华州立大学 , 依阿华州 50011)
摘 　要 : 构建了结球甘蓝 cDNA 文库。文库的宿主菌为 E. coli XL12Blue。对文库的部分特性进行研究 ,
滴度为 2 ×108～4 ×108 pfu/ mL , 插入片段的大小均在 500 bp 以上 , 以 1kb 以上的片段占大多数 , 重组体的
重组率为 95 % , 用抗病基因片段作探针进行噬菌体原位杂交 , 杂交信号明显。对文库进行了扩增、保存。
关键词 : 甘蓝 ; 结球甘蓝 ; cDNA 文库
中图分类号 : S 635 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0620579202
1 　目的、材料与方法
为了分离结球甘蓝的一些有用基因 , 本研究构建了结球甘蓝的 cDNA 文库 , 并对该文库的部分特
性进行了研究。结球甘蓝材料为自交不亲和系 84075 , 高抗 TuMV。2～3 片真叶时提取总 RNA 并检测
RNA 质量。cDNA 文库构建按 SMART cDNA 文库试剂盒的说明进行操作。用 1μg 总 RNA 合成 cDNA 第
一条链及第二条链 , 经蛋白酶 K消化 , Sfi 1 酶切 , 产生 Sfi 1 酶切位点的 cDNA 片段 , 经 SPIN2400 层
析柱纯化后 , 收集酶切 1kb 以上 cDNA 片段 , 加 T4 连接酶 , 把 cDNA 片段连接到λTriplEx2 载体上 , 进
行包装反应 , 把连接产物转化到大肠杆菌 XL12Blue 中。文库扩增和保存参考 Sambrook 等〔1〕的方法进
行。文库滴度测定 : 将包装反应液 1μL 用 1 ×λ稀释液稀释 20 倍后取 1μL , 加到 200μL 过夜培养的
大肠杆菌 XL12Blue 菌液中混匀 , 37 ℃培育 10～15 min , 取 10μL 混合菌液加入 2 mL 熔化LB/ MgSO4 顶
层琼脂糖培养基中 , 快速混匀 , 倒在预热 (37 ℃) 的 90 mm LB 平板上 , 37 ℃下倒置过夜培养 , 统计
噬菌斑 , 计算文库滴度。文库重组克隆的测定 : 按上述步骤培养噬菌体 , 在 LB/ MgSO4 顶层培养基中
加相应浓度的 IPTG和 X2gal , 根据蓝白斑来统计重组率。插入片段的大小检测 : 随机挑取 11 个克隆 ,
按质粒小量提取法提取质粒〔1〕, 经 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ酶切 , 在 1 %琼脂糖凝胶上电泳分离 , EB 染色
后 , 拍照 , 统计插入 cDNA 片段大小。文库筛选试验 : 在 10 mL 熔化 LB/ MgSO4 琼脂糖培养基中加入
500μL 噬菌体与 XL12Blue 按一定比例混合的菌液 , 倒在 150 mmLB/ MgSO4 平板上过夜培养 , 噬菌斑长
到一定大小 (0. 5 ～1 mm) , 把尼龙膜覆盖噬菌平板上 1～2 min , 置于变性液 (NaOH 0. 5 mol/ L , NaCl
l . 5 mol/ L) 5 min , 中和液 (NaCl 1. 5 mol/ L , Tris2HCl 0. 5mol/ L , pH 7. 9 ) 5 min , 2 ×SSC液中 30 min ,
120 ℃烘烤 30 min , 用于杂交 , 杂交步骤按 DIG杂交检测试剂盒进行 (Boehringer mannheim 公司) ; 根
据抗病基因保守区域设计的引物〔4〕, 以 84075 基因组为模板进行 PCR 扩增 , PCR 产物为杂交探针 , 中
强度洗膜 , 照相。
2 　结果与分析
2. 1 　总 RNA纯化和 cDNA文库鉴定
总 RNA 提取后 , 经电泳检测没有出现拖带 , 表明 RNA 质量好 , 且 A260/ A280 和 A260/ A230 比值
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在 1. 9 左右 , 表明无蛋白和多糖污染 , 总 RNA 的纯度良好 (图 1) 。
经文库滴度测定 , 该文库滴度为 2 ×108～4 ×108 pfu/ mL。理论上 , 一个普通 cDNA 文库滴度达到
1 ×106 pfu/ mL 标准即可 , 而该文库大大超过了这一标准 , 具有很高的滴度。该文库的重组克隆的重
组率达 95 % , 亦满足了普通 cDNA 文库重组率必须达 80 %以上的标准。随机挑取 11 个克隆进行酶切
分析 , 表明该文库插入片段大小均在 500 bp 以上 , 大多数片段在 1 kb 以上 (图 2) 。
2. 2 　文库筛选结果
用扩增出的抗病基因片段作探针进行文库筛选 , 结果表明 , 阳性克隆信号明显 , 该文库能够用噬
菌斑原位杂交的方法进行筛库 (图 3) 。
从以上的分析结果可以看出 , 所建成的结球甘蓝 cDNA 文库具有代表性 , 滴度高 , 插入片段大小
符合要求 , 重组率高 , 质量好 , 能够利用该文库进行结球甘蓝目的基因的分离和克隆。
图 1 　RNA电泳图
Fig. 1 　Electrophoresis analysis of total RNA
图 2 　cDNA文库单克隆的 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切图
M为λDNA (Hind Ⅲ+ EcoR Ⅰ) , 箭头示 TriplEx2 载体 DNA ,
其余为 cDNA 插入片段。
Fig. 2 　Clones of cDNA library digest with BamH Ⅰand EcoR Ⅰ
M: λDNA ( Hind Ⅲ+ EcoR Ⅰ) , arrow shows TriplEx2 DNA ,
the others cDNA inserts.
图 3 　甘蓝抗病基因片段作探针与
cDNA文库菌落原位杂交 (箭头示阳性克隆)
Fig. 3 　Cloning hybridization of the cDNA library with resistance
disease gene analog of cabbage (arrow show positive clones)
参考文献 :
1 　Sambrook J , Frish E F , Maniatis T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual . 2ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989. 360
2 　沈加丽 , 龚祖埙. 小麦丛矮病 (WRSV) 的近全长 cDNA 基因文库构建. 中国病毒学报 , 1997 , 12 (2) : 155～160
3 　陈大明 , 徐昌杰 , 张上隆. 脐橙基因组 DNA 文库的构建. 园艺学报 , 2000 , 27 (6) : 401～405
4 　Vladimir K, Laura F Marek. Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybeen. Proc. Natl . Acad. Sci . USA , 1996 , 93 : 11746～11750
cDNA Library Construction and Identif ication of Cabbage
Cao Bihao1 ,2 , Lei Jianjun1 ,2 , Song Hongyuan1 , Song Ming1 , Yang Zhaohui1 , Chengbin Xiang3 , David. J . Oliver3 ,
and Li Danqiong1
(1 Department of Horticulture , South2west Agricultural University , Chongqing 400716 , China ;　2 Department of Horticueture , South2
China Agricultural University , Guangzhou 510642 , China ;　3 Iowa state university , 50011 America)
Abstract : A cDNA library of cabbage was constructed and an expression plasmid introduced into E. coli
XL12Blue was used as cloning vector. The titer of cDNA library is 2 ×108 - 4 ×108 pfu/ mL ; most of the fragments
are more than 500bp , the recombinant rate of the library is about 95 %. Probed with resistant gene fragment ,
phage in situ hybridization , the hybridization signal is clear , which shows this library is good , and the library had
been amplified and stored.
Key words : Cabbage ; cDNA library
085　　　　　　　　　　　　　　　　　　园 　　艺 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　29 卷