全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(12): 2162−2169 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目 (31071802, 31000908), 重庆市自然基金重点项目 (2011BA1002), 中央高校基本科研业务费专项
(XDJK2012B020, XDJK2009C126)和教育部高等学校博士点基金 (20090182120003)和国家重点基础研究发展计划 (973 计划 )项目
(2012CB113900)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王小佳, E-mail: wxj@swu.edu.cn, Tel: 023-68251093
第一作者联系方式: E-mail: swausongm@yahoo.com.cn, xujunqiang101@163.com, Tel: 023-68251093
** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-04-18; Accepted(接受日期): 2012-08-15; Published online(网络出版日期): 2012-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121008.1300.013.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.02162
结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因 BoCML49的克隆及表达分析
宋 明** 许俊强** 孙梓健 汤青林 王志敏 王小佳*
西南大学园艺园林学院 / 南方山地园艺学教育部重点实验室 / 重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 400715
摘 要: 以结球甘蓝 E1 为材料 , 提取花粉萌发前和萌发后的混合花粉总蛋白 , 总蛋白双向电泳后通过 MALDI-
TOF-MS鉴定分析差异点, 根据差异点分析结果, 利用同源克隆得到甘蓝 BoCML49基因 707 bp的 cDNA片段。通过
对 BoCML49基因的 qPCR分析表明其表达量在花粉萌发前约为萌发后的 2.73倍, 表明 BoCML49基因在花粉萌发后
表达下调。通过 5′-Race和 3′-Race分别得到 550 bp和 721 bp大小 cDNA片段, 最终得到结球甘蓝 BoCML49全长 cDNA
序列, 开放阅读框位于 125~1 078 bp处, 加尾信号(AATAAA)位于第 1 222 bp处。通过 cDNA推导得到的氨基酸序列
分析表明, BoCML49编码 317个氨基酸残基, 预测分子量为 33.51 kD, pI为 6.93, 经 Smart-embl预测其含 2个重要的
EF-hand结构, 分别位于序列第 150~178和第 216~244位氨基酸残基处, 预测结果显示其含有 7个 α-螺旋和 10个 β-
折叠结构。系统发育树表明结球甘蓝 BoCML49与拟南芥 AtCML49和 AtCML50的亲缘关系较近。BoCML49基因的
原核表达得到 37.55 kD的融合蛋白。
关键词: 结球甘蓝; 花粉; 类钙调素蛋白 49; 表达分析
Molecular Cloning and Expression Analysis of CaM-Like Protein Genes
(BoCML49) from Cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata)
SONG Ming**, XU Jun-Qiang**, SUN Zi-Jian, TANG Qing-Lin, WANG Zhi-Min, and WANG Xiao-Jia*
Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education / Chongqing Key Laboratory of Olericulture /
College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: Calcium sensor proteins in plants play important roles in pollen germination and pollen tube growth processes.
Calmodnlin-like (CML) protein of cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata) was identified in the process of pollen germina-
tion in cabbage line E1 by two-dimensional electrophosis of the pollen total protein. The sequence of BoCML49 cDNA fragment
was 707 bp. The expression analysis by qPCR showed that the BoCML49 gene was down-regulated when pollen germinated, 550
bp and 721 bp DNA fragments were obtained by 5′-Race and 3′-Race, respectively. We obtained BoCML49 gene with a total
length of 1 343 bp by splicing, its open reading frame was located in the region from 125 to 1 078 bp, and contained a 124 bp 5
untranslated region (5′UTR) and a 265 bp 3′UTR, the polyadenylation signal (AATAAA) was located at 1 222 bp. The deduced
BoCML49 protein contained 317 amino acids, with a MW of 33.51 kD and pI of 6.93. The structural analysis of BoCML49
though Smart-embl showed that it contained two critical functional domain EF-hand modifs, which located at the position of
150–178 and 216–244 amino acid residues, at the same time the ORF might contain seven α-helixes and ten β-sheets. The phy-
logenetic tree indicated that the BoCML49 had close genetic relationship with AtCML49 and AtCML50. Prokaryotic expression
showed that the molecular mass of BoCML49 protein was about 37.55 kD.
Keywords: Cabbage; Pollen; BoCML49; Expression analysis
花粉萌发(pollen germination, PG)及花粉管伸长
(pollen tube growth, PTG)是开花植物有性生殖的重
要阶段。Ca2+信号系统[1-2]与激素[3]在植物的花发育
(成花诱导、花芽分化和开花调控)、有性生殖(研究
第 12期 宋 明等: 结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因 BoCML49的克隆及表达分析 2163


主要集中在花粉萌发和花粉管生长)[4]、逆境生理等
方面都起着非常重要的作用。目前对 Ca2+相关的信
号传递机制的研究中发现有 Ca2+/CaM [包括类 CaM
蛋白(CMLs)]、Ca2+/CDPK 和 Ca2+/CBL 三类钙信号
系统。CaMs 存在于所有真核生物中, 而 CMLs、
CDPKs、CBLs仅存在于植物和一些原生生物中。植
物中含有能够结合 Ca2+的 EF-hands 蛋白, EF-hands
具有高亲和力以结合 Ca2+, 不同的类型 EF-hands结
构个数不尽相同。EF-hand结构域是一种具有钙结合
位点的螺旋 -中央环 -螺旋的结构 , 常见的含有
EF-hand 结构域的蛋白按照功能可以分为调节型蛋
白和结构组成型蛋白两类, 前者在结合钙离子之后
产生构象的变化, 并且有酶活性的改变; 后者结合
钙离子后并没有产生构象上的变化, 它们仅起到维
持胞内钙离子水平的作用, 对胞内钙离子浓度变化
具有一定的缓冲能力[5]。各种钙信号系统类型的蛋
白大小也有很大差异, 相对于 CDPKs而言, CaMs、
CMLs、CBLs等蛋白没有 CDPKs的激酶区[6]。植物
物种中每类钙信号系统均为家族蛋白, 大部分钙结
合蛋白生理作用还未清楚, 因此对钙信号系统家族
成员功能的研究可能成为研究植物生长发育过程的
热点内容。
CaM 是一类重要的 Ca2+传感器蛋白, 可以通过
与其下游的 CaM结合蛋白(CaMBP)作用而调节细胞
的生理功能。植物体中除了保守的 CaMs家族, 还有
CMLs家族, 在钙信号传导中也可能具重要作用, 其
中大多数 CMLs 含有 4 个 EF-hand 结构, 但家族某
些成员有 1~6 个 EF-hand 结构[7-8], CML1 至少有 2
个 EF-hand结构[8], 拟南芥 CML (31/50)和水稻 CML
(20/32)可能有 4个, CML12 (又称 TCH3)有 6个[8-9]。
对拟南芥基因组的研究发现, 其基因组含有7个CaMs
和 50 个 CMLs[8,10], 其中 5 个 CaMs 和 19 个 CMLs
是在 PG 和 PTG 试验中发现的, 这些基因中有 4 个
基因(CML39、CML49、CML3和 CML16)在 PG过程
中上调表达, CML49也在 PTG中转录水平增加, 其
他 CaM/CML (CaM2、CaM3、CML6、CML13、CML25、
CML28 等)在 PG 和 PTG 过程中呈现出高表达的趋
势[11]。一些 CMLs成员在 Ca2+存在的情况下表现出
电泳迁移率的变化 , 这是 Ca2+感受器的一个典型
特征[12-13]。
目前对于植物中 CaMs 的研究较为深入, 但对
CMLs家族基因的克隆与分析报道较少。结球甘蓝作
为十字花科重要的经济作物, 具有较高的研究价值,
但对甘蓝 CMLs 家族成员的研究还处于初始阶段。
本研究从结球甘蓝中克隆得到 CMLs 家族成员
BoCML49, 并通过 RACE 得到全长序列, 编码 317
个氨基酸, 预测其含 2 个重要的 EF-hands 结构, 同
时可能含有 7个 α-螺旋和 10个 β-折叠结构, 表达量
在花粉萌发后下调。这为进一步研究甘蓝花粉萌发
和花粉管伸长具有重要意义, 并为揭示类钙调素蛋
白家族成员在花粉萌发和花粉管伸长过程中的细胞
骨架与钙离子之间相互作用打下基础, 此结果也可
能在植物细胞极性生长机制和甘蓝育种方面具有重
要的实际应用价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料
采用西南大学十字花科蔬菜研究所试验田结球
甘蓝 E1的成熟花粉, 蛋白抽提试剂盒和 IPG胶条购
自 Bio-Rad, DNA连接酶购自东洋纺, 限制性内切酶
购自大连宝生物工程有限公司, 胶回收试剂盒、质
粒抽提试剂盒购自 OMEGA 公司, DNA Marker、
pEASY-Blunt simple vector载体试剂盒、反转录试剂
盒及 Taq DNA 聚合酶均购自 Transgen 公司, Trizol
购自 Invitrogen, 其他常规试剂均为国产分析纯,由
北京六合华大基因公司合成引物及测序。
1.2 花粉萌发及双向电泳分析
将收集的结球甘蓝 E1花粉在相对湿度 100%条
件下静置培养 2 h, 后于花粉液体萌发培养基中[14]
25℃培养 1 h。分别离心收集样本成熟未萌发以及萌
发实验 15、30和 45 min后的混合花粉, 采用 Protein
Extraction Kit (Bio-Rad, 163-2086)抽提总蛋白, 并用
2-D Cleanup Kit (Bio-Rad, 163-2130)将其纯化, 除去
酚类等杂质 , 后用 Bradford 法定量 (Fermentas,
#R1271), 置–80℃保存。
使用 Bio-Rad 17 cm IPG4~7 非线性胶条, 在
PROTEAN II (Bio-Rad)上进行纯化花粉总蛋白的第
一向等电聚焦, 蛋白上样量为 60 ng gel–1, 等电聚焦
条件为 250 V, 1 h; 3000 V 2 h; 8000 V 2 h; 10 000 V
恒压至 100 000 Vh。第二向 SDS-PAGE电泳条件为
10 mA gel–1, 25 min; 15 mA gel–1至电泳结束, 使用
银染法染色。
1.3 花粉 BoCML49的 cDNA克隆及 RACE扩增
依据双向电泳分析结果, 参照拟南芥 CML49基
因保守区域设计 PCR 扩增引物 BoCML-F 和
BoCML-R (表 1)用于 cDNA序列片段的扩增。将萌
发和未萌发花粉样品混合提取总 RNA。使用 Trizol
2164 作 物 学 报 第 38卷

法提取总 RNA 用于基因克隆和实时荧光定量分析,
用 DNase I 去除总 RNA 样品中的 gDNA, 使用
PrimeScript RT-PCR Kit合成 cDNA第 1链。RT-PCR
扩增体系含 ddH2O 32.8 μL, 10×PCR缓冲液 5 μL, 2
mmol L–1 dNTPs 5 μL, 25 mmol L–1 MgSO4 3 μL,
BoCML-F/BoCML-R各 1.5 μL, KOD DNA聚合酶 1
μL, 模板 DNA 1 μL。PCR扩增参数为 94 2 min, ℃
98 10 s, 46 30 s, 68 1 min; 35℃ ℃ ℃ 个循环。将回收
目的片段分别连接到 pEASY-Blunt simple克隆载体,
并转化至大肠杆菌感受态细胞 JM109, 取阳性克隆
进行酶切鉴定并测序。
根据测序得到的序列信息设计 RACE 引物(表
1, BoCML-F-3/BoCML-R-5), RACE试验 PCR扩增体
系含 ddH2O 11 μL, 10×LA Taq PCR缓冲液 2.5 μL,
2.5 mmol L–1 dNTPs 4 μL, UPM引物 2.5 μL, 10 mmol
L–1 BoCML-F-3/BoCML-R-5各 1 μL, LA Taq DNA聚
合酶(TaKaRa) 0.25 μL, 模板 1 μL。PCR扩增参数为
94 3 min, 1℃ 个循环; 94 30 s, 72 3 min, 5℃ ℃ 个循
环; 94 30 s, 70 30 s, 72 ℃ ℃ ℃ 3 min, 5个循环; 94 ℃
30 s, 68 30 s, 72 3 min, 21℃ ℃ 个循环。
1.4 花粉 BoCML49的表达分析
分别收集成熟未萌发和萌发后 15、30和 45 min
后的花粉样本。实时荧光定量 RT-PCR 试验方法采
用 Livak Method (2–ΔΔCT)在 C1000 Thermal Cycler
(Bio-Rad)上进行。试验以 β-Actin 为内参基因(表 1,
BoActin-F/BoActin-R), BoCML49基因表达分析引物
为 BoCML-F-q/BoCML-R-q (表 1)。使用 SsoFast Eva-
Green Supermix (Bio-Rad)配制反应体系, 扩增条件
为 95 2 min; 95 1 s, 69 2 s, 72 2 s, 40℃ ℃ ℃ ℃ 个循
环。每个取样点设 3个技术重复, 3个生物学重复。
1.5 花粉 BoCML49的原核表达分析
以拼接序列为模板设计引物 ( B o C M L - F - q /
BoCML-R-q), 扩增产物经过 EcoR I和 Sal I双酶切
后连接到表达载体 pCold I, 转化表达菌株 E. coli
Rosetta (DE3), PCR用引物 BoCML-F-q/BoCML-R-q
检测, 将检测阳性转化子单克隆按 1∶100扩大培养,
振荡培养至 OD600 达到 0.4, 将菌液于 4℃冷激 30
min后加入 IPTG 至终浓度为 0.1 mmol L–1, 15℃诱
导过夜。收集过夜诱导的菌体, 超声破碎后离心收
集上清液, 用 Ni2+-NTA 柱吸附纯化蛋白, 最终通过
SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。
2 结果与分析
2.1 花粉萌发及花粉总蛋白双向电泳
分别提取成熟花粉与萌发花粉总蛋白 , 经
PDquest 软件分析双向电泳的蛋白差异点(图 1 为双
向电泳的部分结果), 通过对下调蛋白点(图 2-A~B
箭头标记)的质谱(MALDI-TOF-MS)分析, 显示其与
拟南芥 CML49 蛋白具有较高的同源性 , 命名为
BoCML49。
2.2 BoCML49的 cDNA克隆及其 RACE扩增
以甘蓝花粉总 RNA反转录 cDNA为模板, 根据
质谱鉴定结果以及 GenBank 数据库中拟南芥 CML
的核苷酸序列(登录号为 NM-111865)设计引物对(表
1, BoCML-F和 BoCML-R), 在结球甘蓝花粉 cDNA
中扩增得到 707 bp的片段, 设计 RACE引物, 扩增
得到 550 bp (包含 UPM引物片段的长度为 595 bp)
的 5′端片段和 721 bp (包含 UPM引物片段的长度为
766 bp)的 3′端片段, 回收、克隆并目标片段测序。
2.3 BoCML49 分子结构, 钙离子结合区域与进化
分析
利用同源克隆及 RACE 等方法通过拼接得到结
球甘蓝 BoCML49基因序列, 全长 1 343 bp, GC含量
49.52%, 含有完整开放阅读框 (ORF), 位于 125~
1 078 bp, 3′非翻译区为 265 bp, 5′非翻译区为 124 bp,

表 1 基因克隆和实时荧光定量 PCR引物表
Table 1 Primers used in gene cloning and qPCR
引物名称 Primer 引物序列 Primer sequence
UPM CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
BoCML-F CATAATAAGCCGCACAAAG
BoCML-R CATAATAAGCCGCACAAAG
BoCML-F-3 GAACATCGTGACTTGCTTCCAGGCG
BoCML-R-5 ATCCGCCGCCTGGAAGCAAGTCAC
BoCML-F-q GCGCGAATTCATGTCTGGTTACCCTCCTTC
BoCML-R-q GCGCGTCGACTTAAGCGACGAGGAACGGTAG
BoActin-F TATCAACTACCAGCCACC
BoActin-R GAACACCTCAGCTACACTC

第 12期 宋 明等: 结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因 BoCML49的克隆及表达分析 2165




图 1 结球甘蓝成熟花粉(A)和萌发花粉(A)双向电泳图
Fig. 1 2-D electrophoretograms of mature pollen (A) and
germinating pollen (B) of cabbage
箭头: 成熟花粉(A)和萌发花粉(B)中 BoCML49蛋白点。
Arrows: BoCML49 protein spot in mature pollen (A) and
germinating pollen (B).

加尾信号(AATAAA)位于第 1 222 bp 处。根据其
cDNA序列推导得到 BoCML蛋白共 317个氨基酸残
基序列, 预测分子量为 33.51 kD, 等电点为 6.93; 通过
SignalP 分析 (http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP-
2.0/)该蛋白不含信号肽, 说明其不是一种膜蛋白或
分泌蛋白 ; TargetP 亚细胞定位 (http://genome.cbs.
dtu.dk/services/TargetP/)预测表明此蛋白在叶绿体和
线粒体中存在的可能性极低。在线预测分析(http://
smart.embl-heidelberg.de/)表明, BoCML49 蛋白具有
2 个 EF-hands 家族结构域, 钙离子结合区域位于第
150~178 和 216~244 位氨基酸残基。跨膜域分析表
明 (http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), 该
蛋白不含跨膜区。
对 BoCML49 蛋白进行在线模型分析(http://
swissmodel.expasy.org/)氨基酸同源建模(图 2-A~B),
结果表明, 此蛋白有 7 个α-螺旋结构, 分别位于 166~
172、185~189、206~226、234~243、258~262、289~290
和 304~309 位氨基酸残基; 含有 10 个 β-折叠结构,
分别位于氨基酸序列的 9~13、53~56、91~94、100~103、
107~110、136~138、151~154、190~192、251~257
和 278~280 位氨基酸残基。位点修饰分析(http://
h i t s . i sb-s ib .ch /cg i -b in /mot i f_scan#GRAPHIC)
表明, 该蛋白含有一个糖基化位点, 位于 179~182
位氨基酸; 可能含有 7 个磷光体位点, 分别位于 209~
222、258~261、183~185、216~218、229~231和 286~
288 位氨基酸残基处, 前两者存在的可能性远大于
后者。
从 GenBank 数据库检索到部分与 BoCML49 氨
基酸序列同源性较高的高等动植物蛋白家族氨基酸
序列, 经 ClustalX2比对(图 3)。BoCML49与拟南芥
AtCML49 (NP_187641.2)、AtCML50 (NP_196037.2)、
葡萄 CML49 (XP_002284505.1)、筷子芥 CML49
(XP_002882659)的同源性分别为 83%、69%、64%
和 83%。结果表明, 在前 200 个左右氨基酸中各物
种的蛋白同源性较低, 从第 220 个氨基酸以后氨基
酸同源性很高, 可能是由于在该蛋白 C 端有相同的
能够结合 Ca2+的 EF-hands结构, 而不保守的 N端结
构可能决定了各自特定的功能, 由此说明 CML49可
能在各物种的 Ca2+信号系统中发挥着重要作用。
为进一步研究十字花科 CMLs蛋白的进化关系,
从 NCBI 数据库中搜索 CMLs 的氨基酸序列, 经
ClustalX2比对, 以MEGA4软件构建系统发生树(图
4)。表明, 结球甘蓝 BoCML49 与拟南芥 AtCML49
(NP_187641)位于相同的进化枝上, 拟南芥AtCML49和
AtCML50 的同源性最高为 73.3%, 与拟南芥 AtCML50
(NP_196037)和 AtCML48 (AEC08001)关系较近。
2.4 BoCML49在花粉萌发中的表达量分析
采用实时荧光定量 PCR 技术分析表达量表明,
BoCML49 基因在花粉萌发过程中有不同程度的表
达(图 5), 在花粉萌发前 5 min内表达量约为花粉萌
发后 15、30和 45 min时间点表达量的 2倍左右, 15
min 后表达量基本保持在同一水平。说明 BoCML49



图 2 BoCML49蛋白二级结构分析(A)和预测三维结构(B)
Fig. 2 Analysis of secondary structure (A) and predicted three-dimensional structure (B) for BoCML49 protein

2166 作 物 学 报 第 38卷


图 3 结球甘蓝 CML49氨基酸序列与其他物种氨基酸序列比对
Fig. 3 Comparison of deduced amino acid sequence of BoCML49 with sequences of related proteins
参与比对的物种有结球甘蓝 Bo、拟南芥 At (NP_187641、NP_196037)、筷子芥 Al (XP_002882659)、葡萄 Vv (XP_002284505、
XP_002275521)、短药野生稻 Ob (CBX25361)、非洲野生稻 Og (CBX24414)、粳稻 Os (ABG21877)、蓖麻 Rc (XP_002534120、
XP_002523812)、高粱 Sb (XP_002450240)、菜豌豆 Ps (CAB63845)、短柄草 Bd (XP_003578961)、大豆 Gm (XP_003535891)、蒺藜苜
蓿 Mt (XP_003596828)和野马 Ec (XP_001503937)。图中每行有 100个氨基酸残基。
Amino acid sequence of BoCML49 is aligned with orthologues Arabidopsis thaliana (NP_187641、NP_196037), Arabidopsis lyrata subsp
(XP_002882659), Vits vinifera CML49 (XP_002284505), Vitis vinifera (XP_002275521), Oryza brachyantha (CBX25361), Oryza glaber-
rima (CBX24414), Oryza sativa japonica Group (ABG21877), Ricinus communis (XP_002534120, XP_002523812), Sorghum bicolor
(XP_002450240), Pisum sativum (CAB63845), Brachypodium distachyon (XP_003578961), Glycine max (XP_003535891), Medicago trun-
catula (XP_003596828), and Equus caballus (XP001503937). Each line has 100 amino acid residues in this Figure.

第 12期 宋 明等: 结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因 BoCML49的克隆及表达分析 2167




图 4 CMLs系统发生树
Fig. 4 Phylogenetic tree of CMLs
Bo: 结球甘蓝; At: 拟南芥。Bo: Brassica oleracea; At: Arabidopsis thaliana.

在花粉萌发中后期表达下调, 这与双向电泳结果相
同。也与拟南芥 AtCML49的研究结果一致[10]。
2.5 BoCML49原核的表达分析
如图 6 所示, BoCML49 原核表达的融合蛋白
pCold I-BoCML49 大小约为 37.55 kD, 预测 pI 为
7.168; 经过 Ni2+-NTA柱纯化, SDS-PAGE电泳检测,
得到 pCold I-BoCML49的单一条带。
3 讨论
CML是重要的 Ca2+结合蛋白, 是细胞 Ca2+信号
传导途径中的主要信号组分。与 CaMs类似的 CMLs
家族氨基酸序列与 AtCaM2 氨基酸序列相似度为
16%~74.5%[10], 它们是生物体中潜在的 Ca2+感受蛋
白。为研究结球甘蓝 PG 及 PTG 相关基因, 本研究
对萌发的花粉提取总蛋白, 质谱分析并通过 RACE,
分离得到钙蛋白相关基因, 命名为 BoCML49, 编码
317 个氨基酸, 该编码蛋白质有 2 个完整的功能性
EF-hand结构域, 均定位在 BoCML49的 C端, 均有


图 5 结球甘蓝花粉 BoCML49表达分析
Fig. 5 Expression analysis of BoCML49 in pollens of
Brassica oleracea
MP-0: 成熟花粉; GP-15 min: 萌发 15 min花粉; GP-30: 萌发 30
min花粉; GP-45: 萌发 45 min花粉。
MP-0: mature pollen; GP-15: pollen at 15 min after germinating;
GP-30: pollen at 30 min after germinating; GP-45: pollen at 45 min
after germinating.

Ca2+结合位点。拟南芥[7]和水稻[8]分别含有 50 个和
32 个 CMLs 家族成员, 通过预测表明这些 CMLs 蛋
白均含有 1~6个 EF-hand结构域, 大多为 4个, 家族
成员蛋白均没有其他已知功能基序, 氨基酸残基数
2168 作 物 学 报 第 38卷



图 6 pCold I-BoCML49原核表达蛋白及纯化的融合蛋白
SDS-PAGE电泳图谱
Fig. 6 Electrophoretogram of prokaryotic expression protein
and purified on fusion protein pCold I-BoCML49
1: pCold I-BoCML49未诱导对照; 2: pCold I-BoCML49诱导蛋白;
3: pCold I-BoCML49诱导蛋白 Ni2+纯化; M: ProteinRuler II分子
量标准。
1: non-induction control; 2: induction of pCold I-BoCML49; 3:
purification of pCold I-BoCML49 with Ni2+; M: ProteinRuler
II marker.

目在 83~330之间[7-8]。其中 AtCML49编码 330个氨
基酸, 比 BoCML49多 13个氨基酸残基, 同样含有 2
个 EF-hand 结构。BoCML49 基因序列与 CaM 的同
源性较低, 但保守的 EF-hand 结构的高同源性表明
BoCML49 是一个 EF-hand 家族成员。CML49 氨基
酸序列中仅含有 2%的甲硫氨酸, 甲硫氨酸的数量低
反映出其与 CaM的低相关性。此外, McCormack等[7]
对拟南芥染色体定位表明 AtCaMs/CMLs 基因分布
在第 6、第 8、第 9、第 13 和第 20 染色体上, 其中
AtCML49基因定位在拟南芥第 20染色体上。本试验
克隆得到的 BoCML49 基因染色体定位还需要在今
后的研究中进一步确定。
细胞质基质中的自由 Ca2+在 PG和 PTG过程是
一个重要的信使[14-16]。不同功能类别的 CMLs、CHX
(Cycloheximide)和 Hsp (Heat shock protein)成员可能
参与了 PG 和 PTG 过程。CML49 和 CML50 在 PG
和 PTG 过程中起重要作用[10], 对 CML49 基因的功
能研究可能进一步增加我们对 PG和 PTG中 Ca2+信
号的理解。CHX (Cycloheximide)和 Hsp (Heat shock
protein)也在 PG 和 PTG 过程中起调控作用[17-18]。
AtCHXs 参与到花粉成熟干燥和水合过程中的渗透
压调节 K+平衡[18]。Hsps 基因在玉米[19], 拟南芥[20]
和烟草[21]小孢子和成熟花粉中表达, 当细胞或器官
处于超温或其他胁迫时 Hsps被诱导。除了上述基因
外 , ROP1 (Rop1At)[22]、ACA9 (Autoinhibited Ca2+
ATPases)[23]及 VGD1 (VANGUARD1)[24]在调控 PG和
PTG中也起到重要作用。这说明 PG和 PTG过程是
一个复杂的调控过程 , 不是由某个单基因调控的 ,
但 Ca2+在此过程中是必需的。
BoCML49 氨基酸序列比对表明甘蓝与拟南芥
及筷子芥等十字花科物种的亲缘关系较近, 同源性
达到 80%以上。与其他科的物种亲缘关系较远, 但
都含有能够结合 Ca2+的 EF-hand 结构 , 这说明
EF-hand 结构广泛存在于动植物中。Kuo 等[25]研究
表明含有 EF-hand 结构域的蛋白几乎都定位在胞质
和细胞膜中。
植物 CMLs 家族基因的表达具有组织和发育时
期的表达特异性。甘蓝 BoCML49在花发育前期表达
量最高, 发育后期的表达量下降, BoCML49 可能在
PG及 PTG中起调节Ca2+梯度的作用, 从而引起花粉
管的伸长。本研究中 BoCML49表达量在花粉萌发后
迅速下降, 并维持在一定水平。而拟南芥中 CML49
在蕾期的表达量最高, 后逐渐降低, 可能是由于甘
蓝花粉在蕾期并不成熟, 而在花粉萌发后 BoCML49
的表达量降低, 这与对拟南芥的研究一致[10]。此外,
CML49 不仅仅在花粉萌发和花粉管伸长中表达 ,
McCormack 等[10]研究表明 CML49 在拟南芥生长发
育的各个阶段都表达 , 但表达量都是较低水平。
CMLs 家族成员表达的差异性、靶蛋白的特异性、
激活或抑制专一性的靶酶能力的不同以及对敏感性
的差异, 使得 CMLs 在调节细胞 Ca2+信号转导途径
中发挥关键性作用。
CMLs 家族很可能是起源于 CaMs, 但与 CaMs
不同 , 部分 CMLs 似乎发生了亚功能化 [10]。一些
CMLs 仅局限在器官的某一部分中表达并且在面对
各种刺激时表达量会发生急剧变化。目前 CMLs 家
族基因的研究主要停留在基因结构和表达谱分析上,
其功能的鉴定还处于初级阶段。许多 CMLs 成员仅
在特定的器官中表达, 且对各种生物和非生物刺激
反应有显著的表达变化 , 使关系密切的旁系同源
CMLs 显示出不同的表达特性。因此, 不同的 CMLs
家族成员很可能以能够使植物基因组持续存在的方
式进化, 这家族潜在的 Ca2+感受器的生理和生化功
能仍是研究的重点。
4 结论
得到了类钙调素蛋白 (BoCML49)基因的完整
cDNA序列, BoCML49基因表达量在萌发后期下调,
BoCML49 蛋白含有 2 个 EF-hands 结构, 结球甘蓝
BoCML49 与拟南芥 AtCML49 及 AtCML50 的亲缘
第 12期 宋 明等: 结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因 BoCML49的克隆及表达分析 2169


关系近, 原核表达获得大小为 37.55 kD的体外表达
融合蛋白。
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