全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（3）：443–452 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–11–08；修回日期：2012–02–21
基金项目：国家自然科学基金项目（31011787）；福建省亚热带果树及特种经济作物种质资源共享平台项目（2008N2001）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：laizx01@163.com）
龙眼 TPI 基因的克隆及其在体胚发生过程中的
表达分析
赖呈纯 1,2，赖钟雄 1,*，方智振 1，林玉玲 1，姜顺日1
（1 福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福州 350002；2福建省农业科学院农业工程技术研究所，福州 350003）
摘 要：采用 RT-PCR 结合 RACE 法，通过 T/A 克隆测序，获得龙眼胚性愈伤组织磷酸丙糖异构酶
基因（TPI）两个类型的全长序列TPIⅠ（GenBank登录号：FJ595244）和TPIⅡ（GenBank登录号：GU073294），
序列全长分别为 1 084 bp 和 1 113 bp，其 ORF 都由 765 bp 核苷酸组成，编码 254 个氨基酸，与其它植物
的 TPI 在核苷酸序列和推导的氨基酸序列的相似性较高。qRT-PCR 结果分析表明，在龙眼体胚发生过程
中，TPI 在松散型胚性愈伤组织阶段的转录水平比较低，在胚性愈伤组织Ⅱ阶段转录水平急剧升高，并一
直持续到胚性紧实球形结构阶段，球形胚阶段大幅下调，之后至子叶形胚阶段都维持在较低水平，初步
证明 TPI 及其编码蛋白在龙眼启动体胚发生和早期体胚发育中行使重要的功能。
关键词：龙眼；体胚发生；磷酸丙糖异构酶；基因克隆；实时荧光定量 PCR
中图分类号：S 667.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）03-0433-10

Cloning of TPI Gene from Embryogenic Callus and Its Expression Analysis
During Somatic Embryogenesis in Longan
LAI Cheng-chun1,2，LAI Zhong-xiong1,*，FANG Zhi-zhen1，LIN Yu-ling1，and JIANG Shun-ri1
（1Institute of Horticultural Biotechnology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；2Institute
of Agricultural Engineering and Technology，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350003，China）
Abstract：The complete cDNA sequence of triosephosphate isomerase gene（TPI）of longan
embryogenic callus was obtained by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）with rapid
amplification of cDNA ends（RACE）. And the mRNA transcription level of this gene was surveyed by
real-time reverse transcription PCR（qRT-PCR）during somatic embryogenesis in longan. The results
showed that the full-length cDNA sequences of two type longan embryogenic callus TPI were cloned，
namely TPIⅠ（GenBank accession number FJ595244）and TPIⅡ（GenBank accession number
GU073294）. The complete nucleotide sequences of two TPI were 1 084 bp and 1 113 bp respectively. And
they all contained a 765-nucleotides-long open reading frame（ORF）which encoded a protein of 254 amino
acid residues. The results showed that the mRNA transcription levels of longan TPI were different at the
different stages of longan somatic embryogenesis. In conclusion，it was preliminarily revealed that two
type TPI genes and their encoded functional proteins may play an important role during the early somatic

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embryogenesis in longan.
Key words：longan；somatic embryogenesis；triosephosphate isomerase；gene cloning；real-time PCR

磷酸丙糖异构酶（Triosephosphate isomerase，TPI 或 TIM），催化二羟丙酮磷酸和 D 型甘油醛–
3–磷酸之间的可逆转化（Jknowles，1991），TPI 通过直接或间接的方式参与生物体内糖酵解、糖异
生、磷酸戊糖途径及脂肪酸等的生物合成（Xu et al.，1994）。有关 TPI 的研究在动物中比较多，该
酶的突变会阻止 TPI 形成有活性的高级结构而不能行使正常功能，使糖异生，抑制葡萄糖的分解，
导致细胞所需能量大幅度减少，致使动物胚胎死亡或使寿命缩短（Seigle et al.，2008）。在植物中的
研究表明，TPI 存在质体型（pTPI）和胞质型（cTPI）两种形式，在马铃薯叶片生长过程中，TPI
受到有序调控，在叶片快速生长期间 TPI 活性增强，推测其在马铃薯叶片生长中对碳的利用、生物
合成和能量提供等方面起关键性的作用（Dorion et al.，2005）。同时该酶在环境胁迫下也会有响应
（Salekdeh et al.，2002），Ito 等（2003）认为在氧化胁迫反应条件下，TPI 是减缓糖酵解和三羧酸循
环效率的关键调控酶之一。近年来，许多植物体胚发生的蛋白组学研究表明，氧化胁迫反应被认为
是一种普遍的生理现象（Baba et al.，2008；Pan et al.，2009；赖呈纯，2010）。在龙眼体胚发生早期，
通过蛋白质组学的研究，有两个蛋白点（079 蛋白点和 086 蛋白点）被成功鉴定为 TPI（赖呈纯，2010），
在其他植物体胚发生过程的蛋白质组研究也有成功鉴定 TPI 蛋白的报道（Imin et al.，2004；Nogueira
et al.，2007；Marsoni et al.，2007；Sghaier-Hammami et al.，2009；Bian et al.，2010），这充分说明
在植物体胚发生早期，TPI 对体胚的正常发生和发育起到至关重要的作用，但目前从体胚角度来研
究 TPI 还鲜见报道。为进一步了解 TPI 及其编码蛋白在植物体胚发生过程的功能，本研究中通过对
龙眼 TPI 的克隆、序列分析，并结合实时荧光定量 PCR 技术对龙眼体胚发生不同阶段胚性培养物的
TPI 表达量进行检测，初步明确 TPI 的表达规律，从而为研究植物体胚发生过程中 TPI 的生理生化
功能奠定基础，同时为进一步揭示植物体胚发生的相关机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
于 2006 年 12 月，在福建农林大学园艺植物生物工程研究所，取长期继代保持且遗传稳定的龙
眼（Dimocarpus longan Lour.）胚性愈伤组织（LC2 细胞系）作为试验材料（赖钟雄 等，1997），品
种为‘红核子’。按龙眼体胚发生同步化调控的方法（陈春玲和赖钟雄，2002）获得 8 个不同阶段的
胚性培养物，即松散型胚性愈伤组织、胚性愈伤Ⅱ、不完全胚性紧实结构、胚性紧实球形结构、球
形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚，进行龙眼 TPI 荧光定量分析。
1.2 胚性愈伤组织 TPI 保守区序列克隆
取各阶段胚性培养物 0.2 g，按 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂盒说明书操作，提取总 RNA。根据
已发表的 TPI 序列设计特异上下游引物 TPIU 和 TPID。按 Fermentas 公司 RevertAidTM First-Strand
Synthesis System 的试剂盒说明书操作合成龙眼胚性愈伤组织保守区 cDNA 第一链。使用 Biometra
Tgradient 梯度 PCR 仪进行 PCR，反应程序为：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，
72 ℃延伸 1 min，35 个循环后 72 ℃继续延伸 10 min。
1.3 胚性愈伤组织 TPI 全长序列克隆
采用 RACE 法与巢式 PCR 相结合，克隆龙眼胚性愈伤组织 TPI 基因 3′端和 5′端序列。根据测序
3 期 赖呈纯等：龙眼 TPI 基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析 445

得到的 TPI 保守序列，设计特异 3′端特异引物 TPI3-1 和 TPI3-2，5′端特异引物 TPI5-1、TPI5-2 和
TPI5-3，并与通用引物 AUAP 组合。3′端 cDNA 的第一链合成按 Fermentas 公司 RevertAidTM
First-Strand Synthesis System 的试剂盒说明书进行，PCR 反应程序除第一轮退火温度为 55.3 ℃和第
二轮为 53.8 ℃外，其余参数同保守区。5′端 cDNA 第一链和第二链的合成参照 Invitrogen 公司的
5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0 的试剂盒说明书进行，PCR 反应
程序除第一轮退火温度为 52.8 ℃、第二轮和第三轮退火温度为 50.4 ℃外，其余参数同保守区。
根据拼接得到的 TPI 全长设计 1 对引物 TPIOU 和 TPIOD（表 1），用于完整开放阅读框（ORF）
的扩增。以龙眼胚性愈伤组织保守区的 cDNA 为模板，PCR 反应程序为：94 ℃ 预变性 2 min，94 ℃
变性 1 min，58 ℃退火 1 min 20 s，72 ℃延伸 1 min 20 s，35 个循环后 72 ℃继续延伸 10 min。

表 1 龙眼胚性愈伤组织 TPI 基因的克隆及实时荧光定量 PCR 所用引物
Table 1 Sequences of primers used in TPI clone and real-time PCR
引物名称 Primer 引物序列（5′–3′）Primer sequence
TPIU CCTCCATTTGTATTTCTTCC
TPID TTGTGCTGCCAACTCTTT
TPI3-1 TGCTCAGGCTCAGGAAGTTCATTT
TPI3-2 GTATGGAGGTTCTGTGAATGGAGC
AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTACT
TPI5-1 CCATTCACAGAACCTCCATAC
TPI5-2 AGTGACCAAGAATAACCCAAG
TPI5-3 AGCACCACCCTTGCGAAC
TPIOU ATGGCCCGAAAATTCATCGTCGGC
TPIOD TTAGGCATTTTTCTTCACCTCAGCAGAC
TPI23-1 ACAAACCAAAGCTATCGCAGACAATA
TPI23-2 GAGGAAATGGCTTAAAGAAAATGTTG
TPI15-1 ACAGCCATAGTTGATCCAGCT
TPI15-2 CCTCAACAGACTCTTCACTAGT
TPI1OU CCGGAATTCATGGCCCGAAAATTCATCGTCGGCGGC
TPI1OD CCGCTCGAGTCAAGCATTCTTCTTCACCGTGGCAGACTTGATG
TPI2OU CGGGATCCATGGCAAGAAAATTCTTCGTCGGCGGT
TPI2OD CCGCTCGAGTTAGGCATTTTTCTTCACCTCAGCAGACTTGATA
TPIYU GTCACTACATTGAACGAGGCTG
TPIYD TGGAAATCAGA CCGCAACAGAC

1.4 胚性愈伤组织两个类型 TPI 克隆
TPI 全长开放阅读框克隆后，将其与前面克隆拼接的 ORF 序列比对，发现存在较大差异，推测
前面可能分别克隆到两个同源 TPI 类型Ⅱ的 3′和类型Ⅰ的 5′端。因此重新设计引物进行克隆。
TPI 类型Ⅱ的 3′端克隆：根据拼接序列和克隆得到的 ORF 序列，在两个序列上差异比较明显的
区域设计两条顺式上游引物：TPI23-1 和 TPI23-2；下游锚定引物都为 AUAP。PCR 反应程序除第一
轮退火温度为 54 ℃和第二轮为 51.6 ℃，其余条件同上 3′端克隆。
TPI 类型Ⅰ的 5′端克隆：根据拼接序列和克隆得到的 ORF 序列，在两个序列上差异比较明显的
区域设计两条反式特异引物：TPI15-1 和 TPI15-2；上游接头引物 AUAP。PCR 反应程序除第一轮退
火温度为 52.8 ℃、第二轮退火温度均为 50.4 ℃，其余条件同上 5′端克隆。
两个 TPI 的 ORF 克隆：根据拼接得到的 TPI 全长和前期 ORF 克隆的比对结果，设计 1 对特异
的引物用于 TPI 类型Ⅰ完整 ORF 的扩增，并在上游引物 5′端添加保护碱基和 EcoRⅠ限制性酶切位
点，在下游引物 5′端添加保护碱基和 XhoⅠ的限制性酶切位点，即上游引物 TPI1OU 和下游引物
TPI1OD，PCR 反应程序退火温度为 67 ℃，其余条件同上 ORF 克隆。
446 园 艺 学 报 39 卷
根据拼接得到的 TPI 全长和前期 ORF 克隆的比对结果，设计 1 对特异的引物用于 TPI 类型Ⅱ完
整 ORF 的扩增，并在上游引物 5′端添加保护碱基和 BamHⅠ限制性酶切位点，在下游引物 5′端添加
保护碱基和 XhoⅠ的限制性酶切位点，即上游引物 TPI2OU 和下游引物 TPI2OD。PCR 反应程序退
火温度为 64.6 ℃，其余条件同上 ORF 克隆。
1.5 基因片段测序及生物信息学分析
利用 TaKaRa 公司 PCR Fragment Recovery Kit 回收目的片段，连接到 pMD18-T（TaKaRa）载体
上，热激转化大肠杆菌 DH5α。重组质粒经 PCR 鉴定后，送上海英骏生物技术有限公司进行测序。
序列拼接与 ORF 比对后进行蛋白质的保守区域（conserved domain data base，CDD）预测。用 ExPASy
服务系统中的 ProtParam 工具预测分析蛋白质基本理化性质，蛋白质结构分析在 http：//www.
predictprotein.org/等网站上进行。
1.6 TPI 在龙眼体胚发育不同阶段的表达
实时荧光定量 PCR 操作参照 Lin 和 Lai（2010）的方法进行，并以其筛选的 EIF4α、EF-1α 和
FSD 基因为内参基因，检测龙眼体胚发生不同阶段材料的目的基因 TPI 在转录水平上的相对表
达量。
根据龙眼胚性愈伤组织两个类型 TPI 全长开放框，在其序列上相对保守的碱基位置设计 1 对引
物，上游引物 TPIYU 和下游引物 TPIYD，用于实时荧光定量 PCR 扩增。具体操作流程：龙眼体胚
不同阶段胚性培养物的总 RNA 提取后，采用 TaKaRa 的 SYBR ExScriptTM 试剂盒反转录合成 cDNA
第一链。使用罗氏 LightCycler 1.5 PCR 仪进行扩增，扩增程序为预变性 94 ℃ 20 s；94 ℃变性 10 s，
58 ℃退火 20 s，40 个循环。
反应结束后进行扩增曲线、溶解曲线（60 ~ 95 ℃）分析，检测其特异性。每个反应包括 2 个重
复，在样品扩增的同时，以试验中不同处理的 cDNA 模板的混合样进行 5 倍梯度系列稀释制作标准
曲线。根据标准曲线所得的线性计算公式，得到其相对浓度。数据处理和分析采用 excel 数据处理
和 geNorm 程序数据分析。
2 结果与分析
2.1 龙眼胚性愈伤组织 TPI 的两个类型序列
龙眼胚性愈伤组织 TPI 保守区 PCR 扩增后测序，得到约 530 bp 的条带（图 1，A）；第一次的 3′
端克隆，获得约 300 bp 的条带（图 1，B）；5′端克隆得到 300 ~ 400 bp 的条带（图 1，C）；在第一
次开放框扩增反应中，得到约 750 bp 的条带（图 1，D）。
TPI 类型Ⅰ的 5′端克隆得到约 400 bp 的条带（图 1，E）。TPI 类型Ⅱ的 3′端克隆得到约 500 bp
的条带（图 1，F）。TPI 类型Ⅰ和类型Ⅱ的 ORF 克隆，PCR 扩增均获得 750 bp 左右的条带（图 1，
G、H）。
2.2 龙眼胚性愈伤组织 TPI 两个类型测序结果与序列分析
在进行第一次龙眼胚性愈伤组织 TPI 克隆时，对序列测序结果进行拼接，保守区序列加上 3′和
5′两端的序列，获得了 1 029 bp 的 cDNA 序列；通过 ORF 克隆得到了 765 bp 的 cDNA 的序列。拼
接后的 ORF 与 T/A 克隆得到的 ORF 比对（图 2），可以看出，两个序列的差异比较大，据此通过设
计特异引物，进行一系列克隆，最终获得两个类型的 TPI 全长序列（图 3）。
3 期 赖呈纯等：龙眼 TPI 基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析 447


图 1 龙眼胚性愈伤组织两个类型 TPI 序列扩增结果
A：保守区；B：3′端；C：5′端；D：ORF；E：TPIⅠ 5′端；F：TPIⅡ 3′端；G：TPIⅠ ORF；H：TPIⅡ ORF。
Fig. 1 PCR product of TPI from longan EC
A：PCR product of conservative region；B：3′RACE result；C：5′RACE result；D：PCR product of ORF；E：5′RACE result of TPIⅠ；
F：3′RACE result of TPIⅡ；G：PCR product of TPIⅠORF；H：PCR product of TPIⅡ ORF.


图 2 龙眼胚性愈伤组织 TPI 克隆拼接后推测的 ORF 序列（TPI）与 T/A 克隆的 ORF 序列（TPI_T/A）比对结果
Fig. 2 The alignments between TPI gene predicted ORF and TPI gene ORF by T/A clone


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图 3 龙眼两个类型 TPI 克隆拼接后推测的 ORF 序列与 T/A 克隆的 ORF 序列比对结果
Fig. 3 The alignments of two type TPI gene ORF

从图 3 可以看出，TPI 类型Ⅰ拼接后推测的 ORF（TPI_Ⅰ）与 T/A 克隆得到的 ORF（TPI_Ⅰ_T/A）
一致，同时 TPI 类型Ⅱ拼接后推测的 ORF（TPI_Ⅱ）也与 T/A 克隆得到的 ORF（TPI_Ⅱ_T/A）一
致，说明两个类型的 TPI 被成功克隆。从比对图上也可知道，第一次克隆得到的 5′端是 TPI 类型Ⅰ
的 5′端序列，而 3′端是类型Ⅱ的序列。其中 TPI 类型Ⅰ的 cDNA 全长序列为 1 084 bp，其最大开放
3 期 赖呈纯等：龙眼 TPI 基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析 449

框从第 73 个碱基开始，到 837 个碱基终止，共 765 个碱基编码 254 个氨基酸，这与随后该基因 ORF
扩增测序的结果一致。说明龙眼胚性愈伤组织 TPI 类型Ⅰ全序列已经成功克隆。这是报道的第 1 个无
患子科植物的 TPI，命名为 Dimocarpus longan triosphosphate isomerase-like protein typeⅠgene（TPI
Ⅰ），GenBank 登录号为 FJ595244。
TPI 类型Ⅱ的 cDNA 全长序列为 1 113 bp。其最大开放框从第 157 个碱基开始，到 921 个碱基终
止，共 765 个碱基编码 254 个氨基酸。这与随后该基因 ORF 扩增测序的结果一致。龙眼胚性愈伤组
织 TPI 类型Ⅱ全序列已经成功克隆。这是报道的第 2 个无患子科植物的 TPI，命名为 Dimocarpus
longan triosphosphate isomerase-like protein typeⅡ gene（TPIⅡ），GenBank 登录号为 GU073294。
将龙眼胚性愈伤组织 TPI 类型Ⅰ全长及其推导蛋白质与 GenBank 中的序列进行同源性比较，发
现其核苷酸序列与葡萄、毛果杨、马铃薯、亚麻、陆地棉、蓖麻、大豆、菜豆和黄连等植物中的 TPI
具有较高的同源性，同源性都在 80%以上。在氨基酸水平上，与马铃薯、毛果杨、葡萄、蓖麻、大
豆、矮牵牛、陆地棉、黄连等植物的氨基酸序列同源性都大于 85%。其中在核酸和氨基酸水平上与
马铃薯 TPI 同源性最高，分别为 82%和 90%。
将龙眼胚性愈伤组织 TPI 类型Ⅱ全长及其推导蛋白质与 GenBank 中的序列进行同源性比较，发
现其核苷酸序列与毛果杨、蓖麻、葡萄、杨树、马铃薯和陆地棉等植物中的 TPI 具有较高的同源性，
同源性都在 80%以上。在氨基酸水平上，与毛果杨、马铃薯、陆地棉、蓖麻、葡萄、油棕、矮牵牛、
高粱、玉米和拟南芥等植物的氨基酸序列同源性都大于 85%。其中在核酸和氨基酸水平上与毛果杨
TPI 同源性最高，分别为 85%和 91%。
在质谱鉴定中，匹配到的肽段为 FFVGGNWK、RLLLNESNDFVADK、VIACVGETLEQR、
VATPAQAQEVHFELRK、ELAAQPDVDGFLVGGASLKPEFIDIIK，从克隆到的两个类型 TPI 推导的
氨基酸序列可知，质谱鉴定到的是类型Ⅱ的 TPI。
同时通过同源比较发现 TPIⅠ和 TPIⅡ同源性只有 83.7%，这也说明了克隆得到的是两个类型的
TPI。
2.3 龙眼胚性愈伤组织 TPI 编码蛋白理化性质与结构特征分析
2.3.1 TPIⅠ编码蛋白 TPI_Ⅰ
利用 DNAMAN 6.0 软件和 ExPASy 服务系统中的 ProtParam 工具对龙眼胚性愈伤组织 TPI_Ⅰ蛋
白序列的基本理化性质进行综合预测分析，结果表明，该蛋白分子量为 27 242.2 D，理论等电点 pI
6.00；原子组成 C1218H1941N329O362S8，总原子数为 3 858。总平均疏水性为 0.101，为疏水蛋白。该蛋
白由 20 种氨基酸组成，其中以缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘胺酸等含量较为丰富，比例分别为 13.4%、
11.8%、7.9%、7.9%，组氨酸和酪氨酸含量最少，各为 3 个，分别占 1.2%。
通过 PredictProtein 在线软件分析，表明 TPI_Ⅰ蛋白质存在 4 个糖基化位点：NGTT、NLSI、
NESN 和 NISN，5 个蛋白激酶 C 磷酸化位点：SER、TGK、STR、SLK 和 TVK，两个酪蛋白激酶
Ⅱ磷酸化位点：TTEE 和 TLNE，5 个酰基化位点：GNWKCN、GGAFTG、GSTMAV、GAEVAA 和
GGSVNG，1 个磷酸丙糖异构酶活性位点：AYEPVWAIGTG，确认该蛋白为磷酸丙糖异构酶。在线
SignalP 3.0 软件分析表明，该蛋白没有典型的导肽。在亚细胞定位方面，利用网上跨膜结构分析程
序 Tmpered 分析，发现龙眼 TPI_Ⅰ存在跨膜结构域，属跨膜蛋白，可能是质体型的。通过 PHD 在
线蛋白二级结构预测分析，结果表明，龙眼TPI_Ⅰ蛋白由44.09%的α螺旋、19.29%的延伸链和36.61%
的不规则卷曲组成，纵观 TPI_Ⅰ蛋白的整体结构，α 螺旋和不规则卷曲是龙眼 TPI_Ⅰ蛋白最大量的
结构元件，散布于整个蛋白质中。

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2.3.2 TPIⅡ编码蛋白 TPI_Ⅱ
同 TPI_Ⅰ相同的分析方法。结果表明，龙眼眼胚性愈伤组织 TPI_Ⅱ蛋白分子量为 27 312.4 D，
理论等电点 pI 6.13；原子组成 C1231H1951N329O358S7，总原子数为 3 876。总平均疏水性为 0.122，为
疏水蛋白。
该蛋白由 19 种氨基酸组成，其中以缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘胺酸等含量较为丰富，比例分
别为 13.8%、11.0%、8.3%、8.3%，蛋氨酸和酪氨酸含量最少，均分别占 1.2%。
TPI_Ⅱ蛋白质存在 3 个糖基化位点：NGTT、NESN 和 NWSN；4 个蛋白激酶 C 磷酸化位点：
SER、TGK、STR 和 SLK；两个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点：TTEE 和 TSPE；5 个酰基化位点：GNWKCN、
GQVPSS、GGAFTG、GSTMAV 和 GGSVNG；1 个磷酸丙糖异构酶活性位点：AYEPVWAIGTG。
确认该蛋白为磷酸丙糖异构酶。
TPI_Ⅱ蛋白也没有典型的导肽，也存在跨膜结构域，属跨膜蛋白，可能是质体型的。TPI_Ⅱ蛋
白由 45.28%的 α 螺旋、20.08%的延伸链和 34.65%的不规则卷曲组成，纵观 TPI_Ⅱ蛋白的整体结
构，α 螺旋和不规则卷曲是龙眼 TPI_Ⅱ蛋白最大量的结构元件，散布于整个蛋白质中。
2.4 龙眼体胚不同发育阶段胚性培养物中 TPI 的转录水平分析
从图 4 可以看出，TPI 在松散型胚性愈伤组织阶段的转录水平比较低，但到了胚性愈伤组织Ⅱ
阶段转录水平急剧升高，并持续到胚性紧实球形结构阶段，到球形胚阶段转录水平大幅下调，之后
到子叶形胚阶段都维持在较低水平；DPS 数据分析表明，胚性愈伤组织Ⅱ阶段到胚性紧实球形结构
阶段 TPI 的转录水平与其他阶段存在极显著差异（P < 0.01）。基于 TPI 在胚性愈伤组织Ⅱ到胚性紧
实球形结构阶段维持高转录水平的事实，推测其在龙眼体胚发生早期（球形胚之前）在调控体胚正
常发育中有特殊的功能。
图 4 龙眼体胚发生不同阶段 TPI 基因的转录水平
1. 松散型胚性愈伤组织；2. 胚性愈伤组织Ⅱ；3. 不完全胚性紧实结构；4. 胚性紧实球形结构；5. 球形胚；
6. 心形胚；7. 鱼雷形胚；8. 子叶形胚。
Fig. 4 Transcription levels of TPI gene in different stages of longan somatic embryogenesis
1. The friable-embryogenic callus；2. Embryogenic callus Ⅱ；3. Incomplete compact pro-embryogenic cultures；
4. Compact pro-embryogenic cultures globular embryos；5. Globular embryos；6. Heart embryos；
7. Topedo embryos；8. Cotyledonary embryos.

3 讨论
3.1 龙眼两个 TPI 类型的确定
在对克隆获得的两个 TPI 基因编码的蛋白进行亚细胞定位时，两个 TPI 蛋白可能存在的跨膜螺
3 期 赖呈纯等：龙眼 TPI 基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析 451

旋都超过了阈值 500 分，说明龙眼两个 TPI 蛋白都存在跨膜结构域，属跨膜蛋白，因此，推测其可
能是质体型的 TPI。值得一提的是，在两个 TPI 基因的克隆过程中，虽然在 ORF 起始和终止的附近
设计较为特异的引物，但通过 T/A 克隆随机挑选出的 12 个克隆子进行测序时，只有两个克隆子为
TPIⅠ，这可以推测出在龙眼胚性愈伤组织中两个类型的 TPI 拷贝数不同，TPIⅡ占优势；可能在龙
眼体胚发生过程中这两个 TPI 的功能除了行使一般功能外，还有其各自特殊的功能，但这种推测有
待进一步研究。
3.2 TPI 与龙眼体胚发生的关系
在龙眼体胚发生早期蛋白差异表达的研究中发现，有两个蛋白点（079 和 086）鉴定为磷酸丙糖
异构酶，其中 079 蛋白点在龙眼体胚发生早期表达量始终比较恒定，而 086 蛋白点的表达量变化比
较大（赖呈纯，2010），并与 TPI 转录水平的变化趋势有相同之处。推测在龙眼体胚发生早期，体
胚发生的启动和体胚发生早期，TPI 有个大量合成的过程，并且可能是某一类 TPI 大量转录指导合
成龙眼体胚发生早期所需的 TPI，如 086 的磷酸丙糖异构酶类型，这类在龙眼体胚发生早期大量转
录并指导合成的 TPI 蛋白可能是龙眼体胚早期阶段所特有的，其在龙眼体胚早期的发生发育中起重
要的作用；而部分维持基础代谢的 TPI 在龙眼体胚发生的整个过程表达都比较恒定，如 079 的磷酸
丙糖异构酶类型。
研究中还发现，转录水平与蛋白质的表达变化有较大差异，原因可能是转录水平与翻译水平本
身受多种因素的影响，尽管基因表达测定可能表明蛋白质水平的改变，但 mRNA 与表达蛋白质的相
关性不高（低于 0.5），很难从基因表达水平推断蛋白质的水平（Gygi et al.，1999；钱小红和贺福
初，2003；辛普森，2006）。因此，在龙眼体胚发生过程中，从蛋白水平上的研究是很有必要的。
3.3 龙眼 TPI 编码蛋白在生物进化上的利用价值
磷酸丙糖异构酶在生物新陈代谢中扮演重要的角色，通过研究表明，真核生物的 TPI 起源于 α
原细菌，具有较高的保守性，被广泛应用于物种间基因的起源与进化研究（Keeling & Doolitize，1997；
Hasson et al.，1998）。通过对已克隆并登入到 GenBank 的植物或藻类 TPI 推导的氨基酸序列比对发
现，植物 TPI 蛋白的保守性较强，对植物和藻类来源的 18 条 TPI 氨基酸序列建立的系统发生树进行
分析（赖呈纯，2010），从分子水平上了解龙眼在植物中的系统位置，其结果与植物真实的进化基
本吻合。这也说明了以 TPI 氨基酸残基序列构建的系统发生树，可以较真实的反映生物的进化关系，
为研究生物的进化提供又一分子水平上的证据。

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