全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（7）：1335–1343 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–03–28；修回日期：2014–06–05
基金项目：广西自然科学基金重点项目（2013GXNSFDA019011）；广西自然科学基金项目（2011GXNSFA018115）
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：honest66222@163.com）
杧果 Rab 蛋白基因 MiRab11 的克隆及表达分析
刘召亮 1,*，罗 聪 1,*，董 龙 1，何新华 1,2,**，艮文全 1，李丽淑 1，韦鹏霄 1
（1 广西大学农学院，南宁 530004；2 广西农业科学院，广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁 530007）
摘 要：根据前期对杧果（Mangifera indica L.）胁迫差异分析中获得的 Rab11 片段，采用 RT-PCR
结合 RACE 技术，从‘四季杧’混合组织材料（叶、茎、花和果实）中克隆了一个 Rab11 完整编码区序
列，命名为 MiRab11。其 cDNA 全长 902 bp，包含完整开放阅读框 657 bp，编码 218 个氨基酸。同源性
分析表明 MiRab11 与葡萄和柑橘的同源性最高（相似度均为 97%）。实时荧光定量检测结果表明：MiRab11
在杧果叶、茎、花和果实中均有表达，在嫩茎和花后 70 d 的成熟果实中的表达较高；在果实形成及发育
初期表达量略有下调，但在果实成熟过程中表达量明显上调；逆境胁迫（低温、盐、干旱）处理可引起
在叶或茎中上调表达；不同信号物质（脱落酸、水杨酸、双氧水）刺激均可引起叶中的表达上调。结果
表明，MiRab11 可能在杧果果实成熟和胁迫反应中发挥重要作用。
关键词：杧果；MiRab11；克隆；表达分析
中图分类号：S 667.7 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1335-09

Cloning and Expression Analysis of a GTP-binding Protein MiRab11 Gene
from Mangifera indica
LIU Zhao-liang1,*，LUO Cong1,*，DONG Long1，HE Xin-hua1,2,**，CAN Van Toan1，LI Li-shu1，and WEI
Peng-xiao1
（1College of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530004，China；2Guangxi Crop Genetic Improvement and
Biotechnology Key Laboratory，Nanning 530007，China）
Abstract：A MiRab11 gene，which belonged to small GTP-binding proteins Rab gene family，was
cloned by RT-PCR and RACE from Mangifera indica mixed tissues（leaves，stems，flowers，and fruits）.
The full-length cDNA sequence was 902 bp and contained an open reading frame of 654 bp，which
encoded a 218 amino acid protein. The deduced amino acid sequence exhibited high homology with Vitis
vinifera and Citrus sinensis（97% similarity）. Real-time quantitative PCR detection showed that the
ubiquitously expressed MiRab11 in young stems and fruit of 70 d after flowering was much higher than in
other tissues；The expression level of the gene was down-regulated during early fruit development from 20
d to 50 d after flowering and up-regulated during fruit ripening from 50 d to 70 d after flowering；It could
be up-regulated under different stress treatments（low temperature，salt，and drought）and stimulated by
different signal molecules stimulation（abscisic acid，salicylic acid，and hydrogen peroxide）. In a word，
a MiRab11 was identified from Mangifera indica，which might be associated with mango fruit ripening and

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play an important role in mango stress reaction.
Key words：Mangifera indica；MiRab11；cloning；expression analysis

Rab 蛋白家族是 Ras 蛋白超家族中最大最复杂的小 G 蛋白，其编码蛋白质的分子量为 22 ~ 25
kD，广泛存在于酵母、果蝇、小鼠、人类等真核细胞中，在膜泡运输过程中起作用。Rab 蛋白作为
囊泡运输的分子开关，循环于 GTP 结合形式（活化状态）和 GDP 结合形式（无活性），通过不同结
合状态的转换，调节囊泡的出芽、转运、粘附和融合，参与细胞的分化，细胞的内吞和外排，胞内
蛋白的运输、交换和定位等（Noviek & Zerial，1997）。转水稻 rgp1（Rab）基因的烟草在内源激素
含量、植株高度、花发育和对烟草花叶病毒的响应途径等方面都与野生型烟草有明显差异（Sano &
Ohashi，1995）。紫御谷 PgRab7 受低温、干旱、盐及生长素诱导表达，过量表达可提高对盐和干旱
的抗性（Hutagalung & Novick，2011）。烟草 NtRab11 调控花粉管的极性生长（Agarwal et al.，2008）。
Rab11 基因是 Rab 家族成员数量最多、定位与功能最复杂和多样的亚家族成员（Rutherford & Moore，
2002；Vernoud et al.，2003）。酵母基因组中有的两个 Rab11 蛋白（YPT31 和 YPT32），哺乳动物基
因组中有 3 个 Rab11 蛋白（Rab11a、Rab11b 和 Rab25），其功能已经有了比较深入的研究（Garcia-Ranea
& Valencia，1998；Bhartur et al.，2000）。拟南芥基因组中有 26 个 Rab11 基因，但其功能尚未见报
道（Vernoud et al.，2003）。
近年来，Rab11 编码的蛋白也成为植物中的研究热点。过量表达烟草 Rab11b 的结构域突变体抑
制花粉管的极性生长（de Graaf et al.，2005）。bin Zainal 等（1996）从成熟的杧果中分离了一个 MiRabX
基因，其仅在成熟果实中特异性表达。随后，Lu 等（2001）以此序列为探针，从成熟前期的番茄果
实中分离到 SlRab11 基因，其反义基因转化的番茄植株的果实不能正常成熟软化。最近的研究表明，
Rab11 可能与逆境胁迫反应有关。葡萄 VvRabA1c、VvRabA1e 和 VvRabA2a 基因受脱落酸诱导可上调
表达（Abbal et al.，2008）。转水稻 OsRab11 基因拟南芥及其突变体提高了对盐的耐受性（Son et al.，
2012）。从条斑紫菜中分离到的 PyRab11 基因，经原核蛋白诱导表达后可提高对盐的耐受性（王斌 等，
2012）。然而，在杧果中对 Rab11 功能的研究除 MiRabX 外未见其他报道。
作者在前期研究中克隆获得了多个与杧果逆境胁迫相关的功能基因，其中获得了 MiRab11 的部
分序列（Luo et al.，2012）。本试验中以 MiRab11 的部分序列为基础，用改良 5′RACE（rapid-
amplification of cDNA ends）技术克隆了 MiRab11 的全长序列，对序列进行了生物信息学分析，利用
实时荧光定量 PCR 对其在不同组织及其不同胁迫处理条件下的表达模式进行了分析和讨论。
1 材料与方法
1.1 植物材料与处理方法
所有样品于 2012 年 3—6 月采自广西大学农学院教学科研基地的果树标本园，试验在广西农业
科学院广西作物遗传改良与生物技术重点实验室完成，品种为‘四季杧’，砧木为土杧。不同组织及
各发育时期的果实均取自 11 年树龄的杧果树。逆境处理和信号物质刺激处理用穴盆栽培的 1 年树龄
‘四季杧’嫁接苗，种植于无纺布种植带中。
组织样品包括老叶、嫩叶、老茎（已木质化）、嫩茎（未木质化）和花。从花后 20 d 果实开始，
每隔 10 d 取 1 次样，直到成熟，共 7 次。选择长势一致的 1 年龄‘四季杧’嫁接苗嫁接苗，在光照
培养箱中进行 4 ℃低温处理；以清水为对照，设 300 mmol · L-1 NaCl 和 30% PEG-6000 处理，处理
后 0、24、48、72 h 采集叶片和茎。选择长势一致的 1 年龄‘四季杧’嫁接苗，分别喷 0.1 mmol · L-1
7 期 刘召亮等：杧果 Rab 蛋白基因 MiRab11 的克隆及表达分析 1337

脱落酸、1 mmol · L-1 水杨酸、1 mmol · L-1 双氧水，方法参照 Agarwal 等（2005）、Xu 等（2008）的
报道，处理后于 0、0.5、1、2、4、8、12 和 24 h 采集叶片。上述处理取样均设 3 次重复，取样后
液氮中速冻后，保存于–80 ℃冰箱，用于分析。
1.2 RNA 提取及 cDNA 合成
取上述存放于–80 ℃冰箱中的样品，按多糖多酚植物 RNA 快速提取试剂盒说明书（北京华越
洋）分别提取总 RNA，用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测 RNA 的完整性。取完整性良好的总 RNA
经 RNase-Free DNase 处理，以去除含有的基因组 DNA，使用 M-MLV 反转录酶进行逆转录，按照
TaKaRa 公司产品说明书操作。
1.3 MiRab11 的克隆
以逆转录通用 AUP1 引物，用 PrimeScript 逆转录酶（TaKaRa），按逆转录酶说明书合成 cDNA
第一链。逆转录后，用 RNase H 处理。将纯化后的 cDNA 加尾后，用 PCR 产物纯化试剂盒纯化。
利用降落 PCR 和 5′RACE 技术，以加尾产物 1 μL 为模板，用包含多聚 dC 尾巴序列的 AP1 引物和
5′RACE 特异引物 D2 进行第 1 轮扩增。以稀释 40 倍的第 1 轮 PCR 产物 1 μL 为模板，用巢式基因
特异引物 AP2 和 5′RACE 特异引物 D1 继续进行第 2 轮扩增，反应体系和反应程序与第 1 轮相同。
反应体系 25 μL：加尾产物 1 μL，dNTP（10 mmol · L-1）0.5 μL，上下游引物（10 μmol · L-1）各 1 μL，
Dream Taq 酶 0.15 μL，Dream Taq Buffer 2.5 μL，ddH2O 18.85 μL。PCR 反应程序：预变性 95 3 min℃ ，
95 40 s℃ ，62 50 s℃ ，72 2 min℃ ，共 2 个循环；95 40 s℃ ，60 50 s℃ ，72 2 min℃ ，95 40 s℃ ，
58 50 s℃ ，72 2 min℃ ，95 40 s℃ ，56 50 s℃ ，72 2 min℃ ，30 个循环。
1.4 实时荧光定量分析
利用实时荧光定量 PCR 技术分析 MiRab 在不同组织、不同发育阶段果实、以及各种胁迫处理
下的幼苗叶片或茎 MiRab11 的表达。以已公布的 MiGAPDH 为内参，引物见表 1（罗聪 等，2011b）。
以逆转录 cDNA 为模板，用 LightCycler® 480 SYBR Green I Master kit（Roche Applied Science）试剂
盒，在 Light Cycler® 480 上对目的基因的表达水平进行检测。

表 1 引物序列及使用
Table 1 Sequence of primers and application
引物名称
Primer ID
引物序列
Sequence（5′–3′）
用途
Application
AUP1 GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT 逆转录引物 Reverse transcription primer
AP1 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGGGGGGG 锚定引物 Anchored primer
AP2 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 锚定引物 Anchored primer
Rab11D1 TCATACACCAGAAGGGCACC 5′RACE
Rab11D2 GAGACAGCAACGAGATGGCG 5′RACE
3 Side GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3′下游引物 3′ downstream primer
Rab11F ATGGCTGGCTTCAGAGCTG 扩增 CDS 序列 Amplification of CDS sequence
Rab11R GCCTGAGCAGCAGCCAGCTT 扩增 CDS 序列 Amplification of CDS sequence
qMiRab11F TGAATGTTGATGGCAAGGTC 实时定量 PCR Real-time PCR
qMiRab11R ATACACCAGAAGGGCACCA 实时定量 PCR Real-time PCR
MiGAPDHF CTAGTGGTCCAAGTCTCCAAGAAAA 内参 Internal control
MiGAPDHR CAAGGGGCTCATCACAAACA 内参 Internal control

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PCR 反应体系为 20 μL，包括 10 μL SYBR Premix Ex Taq，上、下游引物各 0.6 μL（10 μmol · L-1），
2 μL cDNA（50 ng · μL-1），6.8 μL 去离子水。PCR 程序如下：95 30 s℃ ，95 5 s℃ ，60 20 s℃ ，60 ℃
收集荧光信号，45 个循环，95 ℃溶解曲线，65 15 s℃ ，42 ℃冷却。反应结束后绘制溶解曲线，以
判定产物的特异性。使用 2-ΔΔCT 方法计算基因相对定量（Livak & Schmittgen，2001）。实时荧光定
量 PCR 数据分析用 Spss 17.0 和 Microsoft Office Excel 2003 进行统计分析，结果均用平均值 ± 标准
误表示。
1.5 生物信息学分析
采用在线 NCBI 的 BLAST 和 DNAMAN5.22 软件对 MiRab11 及其编码氨基酸序列比对分析。用
以下工具对编码氨基酸预测：ExPASy Param 分析蛋白质基本理化性质；SignalP 4.0 Server 分析信号
肽；PSORT 分析亚细胞定位。其它物种的氨基酸序列来源于 NCBI 数据库，采用 MEGA5.0 软件对
基因编码蛋白进行同源性比对和系统进化树分析。
2 结果与分析
2.1 MiRab11 克隆及测序
将提取的混合组织样品（叶、茎、花和果实）的 RNA 进行电泳检测，结果（图 1，A）显示，
28S 和 18S 清晰可见，两者比例约为 2︰1，而且 5S 条带可见，表明提取的总 RNA 完整。总 RNA
经 RNase-Free DNase 去除基因组 DNA 后，取 1 μg 进行逆转录生成第一链 cDNA，用琼脂糖凝胶电
泳检测（图 1，B），呈弥散状，说明逆转录效率高，可用于基因克隆。
在前期 cDNA-SCoT 研究中，获得了缺少 5′末端的部分 MiRab11 序列片段。参照高效获取 5′末
端 RACE 方法获得该基因的缺失部分序列（罗聪 等，2011a）。利用降落 PCR 和巢式 PCR 技术，
用包含多聚 dC 尾巴序列的 AP1 长引物和基因特异引物 d2 进行第 1 轮扩增。以稀释 40 倍的第 1 轮
PCR 产物为模板，用巢式基因特异引物 AP 短引物和基因特异引物 d1 继续扩增。经过 2 轮巢式 PCR
后，获得包含完整开放阅读框序列。测序结果经 DNAMAN 拼接，获得了长为 902 bp 序列，包含完
整开放阅读框 657 bp（图 1，C）。
NCBI 在线分析同源性后，命名该基因为 MiRab11（登录号：KF768564）。核苷酸序列及编码氨
基酸序列如图 2。



图 1 杧果总 RNA（A）、逆转录 cDNA（B）及 MiRab11（CDS）序列（C）琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 Total mango mixed trisues RNA（A），cDNA（B），and the CDS of
MiRab11 gene（C）by Agarose gel electrophoresis
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图 2 杧果 MiRab11 核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the MiRab11

2.2 MiRab 基因同源性比较
利用 NCBI 的 Blastp 在线工具对 MiRab11 基因的蛋白序列进行比对，结果（图 3）显示：MiRab11
基因的蛋白与葡萄（Vitis vinifera）VvRab11B、柑橘（Citrus sinensis）CsRab11B、CsRab11C、番茄
（Solanum lycopersicum）SlRab11、拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtRab11B、葡萄（V. vinifera）

图 3 杧果 MiRab11 与其它物种 Rab11 氨基酸序列同源性比对
Mi：杧果；At：拟南芥；Ca：鹰嘴豆；Cs：柑橘；Sl：番茄；Vv：葡萄。
Fig. 3 The multiple sequence alignment of MiRab11 in mango with other Rab11 proteins
Mi：Mangifera indica；At：Arabidopsis thaliana；Ca：Cicer arietinum；Cs：Citrus sinensis；
Sl：Solanum lycopersicum；Vv：Vitis vinifera.
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VvRab11D、杧果（M. indica）MiRabX 相似性较高，分别为 97%、97%、93%、89%、89%、87%和
86%。在 NCBI 上进行保守结构域分析表明：MiRab11 包含 5 个 G 结构域、5 个 RabF 模体、4 个 RabSF
模体和 1 个 C 端的半胱氨酸模体（C motif），MiRab11 基因氨基酸序列的保守域与其它物种具有较
高的一致性。
2.3 系统进化分析
用 MEGA 5.2 近邻相接法（Neighbor-Joining，NJ）对 MiRab11 蛋白及其它物种 Rab11 氨基酸序
列进行系统进化树分析。从图 4 中可以看出，MiRab11 与杧果 MiRabX 同源性最高；与柑橘 CsRab11B
及葡萄 VvRab11B 同源性次之；与葡萄 VvRab11D、番茄 Rab11 和鹰嘴豆 Rab11 同源性最低。分析
结果表明，MiRab11 与 MiRabX 同源性最高，同为 Rab11B 类成员。

图 4 杧果 MiRab11 与其它物种 Rab11 的系统进化树分析
各节点处数字代表 bootstrap 值。
Fig. 4 Phylogenetic tree of mango MiRab11 and previously reported Rab11 protein
The numbers at node represent the bootstrap values.

2.4 MiRab11 在不同组织中的表达
实时荧光定量分析显示，MiRab11 在杧果树叶、茎、花和果实中均有表达，其中在嫩茎中表达
量明显高于老叶、嫩叶、老茎和花，为老叶表达量的 6 倍（图 5，A）。不同发育时期果实表达分析
显示，在果实形成及发育初期，表达量略有降低；随着果实发育成熟，表达量随之升高，但在果实
成熟时，表达量又降低（图 5，B）。
图 5 MiRab11 在不同组织（A）和不同发育时期果实（B）中的表达
Fig. 5 MiRab11 expression in various tissues（A）and fruit at different development stages（B）
2.5 MiRab11 在逆境条件下的表达
模拟了 3 种常见逆境胁迫对杧果 MiRab11 表达的调控，结果（图 6）显示，该基因受低温、NaCl
和 PEG 调控。低温处理后，MiRab11 在叶片中的表达量在 24 h 时降至处理前的 10%，随后逐渐升
7 期 刘召亮等：杧果 Rab 蛋白基因 MiRab11 的克隆及表达分析 1341

高，72 h 时为处理前的 70%；而在茎中表达量在 48 h 内逐渐降低，但在 72 h 时表达量为处理前的 9
倍。NaCl 处理后，叶片中 MiRab11 表达量在 24 h 时略有降低，48 h 时急剧升高（为处理前的 13.5
倍），72 h 时降低至处理前的 20%；在茎中 48 h 内上调为处理前的 2.8 倍，72 h 时降为处理前的 80%。
PEG 处理后，在叶片中 MiRab11 表达了量 24 h 达到最高（为处理前的 7 倍），48 h 时降为处理前的
1.3 倍，72 h 时略微有些回升；在茎中处理后 24 h 时下调，48 h 时上调至处理前的 2.6 倍，72 h 时
又降至处理前的 50%。
2.6 MiRab11 在信号刺激物质下的表达
在脱落酸（ABA）刺激下，MiRab11 表达量除了 8 h 时外，呈上调表达，12 h 表达量最高（为
处理前的 2.2 倍）；在水杨酸（SA）刺激下，该基因在起初 1 h 内呈下调表达，1 h 时为处理前的 45%，
随后 2 h 时上升为 76%，4 h 时下降到最低为处理前的 43%，此后逐渐回到处理前表达水平，在 24 h
时下降为处理前的 50%；在双氧水（H2O2）刺激下，该基因在 0.5 h 出现上调表达，表达量最高（为
处理前的 4.3 倍），1 h 时降为处理前的 70%，随后又出现缓慢上调，在 24 h 时增至处理前的 2 倍（图
7）。




3 讨论
本研究中利用 5′RACE 技术从杧果中克隆了 MiRab11 基因全长。该基因编码蛋白的一级结构包
图 7 MiRab11 在 ABA、SA 和 H2O2 处理下的表达
Fig. 7 MiRab11 expression stimulated by
ABA，SA and H2O2
图 6 MiRab11 在低温、NaCl 及干旱（PEG）处理下的表达
Fig. 6 MiRab11 expression under cold，NaCl and drought
（PEG）treatments
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含了 Rab 基因家族成员的许多重要结构特征。具有小 G 蛋白家族成员保守的 GTP/GDP 结合和水解
结构域、Rab 蛋白家族所特有 RabF 模体、C 端的半胱氨酸模体（C motif）和 Rab11 蛋白的 RabSF
序列。其中，C 端的半胱氨酸模体（C motif）中的半胱氨酸经异戊二烯化修饰能增加 Rab 的疏水性，
有利于 Rab 与膜的结合；RabSF 序列是划分和鉴定 Rab 基因亚家族成员的重要依据（李江姣 等，
2008）。同源性比对及进化树分析进一步表明，MiRab11 与 MiRabX 同属于 Rab11 亚家族成员。
Rab11 在不同物种的组织表达存在较大差异。MiRab11 在叶、茎、花和果实中均有表达，且其
表达量在嫩叶中高于老叶，在嫩茎中高于老茎，在果实形成和发育初期（花后 20 ~ 40 d 的）表达量
下调，在果实成熟过程中明显上调，表明 MiRab11 可能参与杧果生长和果实成熟。这与前人从杧果
中分离的仅在成熟果实中表达的 MiRabX 基因有明显的区别（bin Zainal et al.，1996）。前人在桃树
中也分离到 3 个与果实成熟相关的同源的 Rab11（Falchi et al.，2010）。利用基因探针分析百脉根基
因组获得 10 个 Rab11 基因（LjRab11A ~ LjRab11J）中，其中 4 个在根瘤形成过程中有不同的表达（Borg
et al.，1997）。而在模式植物拟南芥基因组中，57 个 Rab 基因，其中 26 个为同源 Rab11（Vernoudal
et al.，2003）。由此表明，Rab11 在同一物种中存在功能上的冗余现象。
以 4 ℃、NaCl 和 PEG 模拟常见环境胁迫（低温、盐和干旱）均可诱导 MiRab11 的上调表达。
转水稻 OsRab11 基因的拟南芥及其突变体提高了对盐的耐受性（Son et al.，2012）。据报道条斑紫菜
PyRab11 基因的原核重组蛋白表达后可提高大肠杆菌的耐盐性（王斌 等，2012）。由此可见，MiRab11
基因也可能参与抗逆境胁迫。
脱落酸（ABA）是特殊的信号分子介导环境胁迫，调控大量相关基因参与低温、盐、干旱等逆
境的响应，提高植物对逆境的耐受性（马延宏，2009）。当有病原体侵入植物时，引起水杨酸（SA）
含量增加，而水杨酸作为信号分子，激活相关的防御基因的转录参与抵御活动（Glazebrook et al.，
2003）。H2O2 是活性氧（ROS）的重要内容之一，其作为第二信使诱导防御基因表达，已被证实参
与植物与病原菌互作（Orozco-Cárdenas et al.，2001）。本研究中外源信号刺激物质脱落酸、水杨酸
和双氧水均可不同程度地诱导 MiRab11 上调表达，表明该基因可能参与了脱落酸、水杨酸和双氧水
的信号转导过程。类似研究也表明，葡萄 Rab11 基因在脱落酸诱导下可上调表达（Abbal et al.，2008）。
本研究中 MiRab11 在杧果不同阶段器官中均有表达，但在嫩茎和成熟果实中的表达量较高，植
株在环境胁迫下，该基因在茎和叶中的表达明显提高；在信号分子物质刺激下，也可上调表达，表
明该基因可能参与了杧果的抗逆应答及信号转导。本研究结果为理解杧果的抗逆分子机理提供了试
验依据，为杧果抗逆遗传改良提供了理论依据和候选基因资源。

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