全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（12）：2007–2016
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–08–23；修回日期：2010–11–05
基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-06-0489）；农业部‘948’滚动项目（2008G3）；公益性行业（农业）科研专项
（200903020）；安徽省高等学校省级自然科学研究项目（KJ2010B429）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chenfd@njau.edu.cn）
那贺川野菊的离体保存
兰 伟 1,2，陈素梅 1，尹冬梅 1，陈发棣 1,*
（1 南京农业大学园艺学院，南京 210095；2阜阳师范学院生命科学学院，安徽阜阳 236041）
摘 要：以那贺川野菊为试材，研究了不同浓度蔗糖和多效唑（PP333）对试管苗离体保存的影响，
并对保存材料再生后代的遗传稳定性进行了分析。结果表明：常温（23 ± 2）℃、光照强度 2 000 ~ 3 000 lx、
光照时间 12 h · d-1的培养条件下，在 MS + 2.0 mg · L-1 KT + 0.1 mg · L-1 NAA + 6.5 g · L-1 琼脂培养基中，
蔗糖浓度为 15 ~ 30 g · L-1 时附加 6 ~ 9 mg · L-1 PP333 能保存试管苗 360 d 以上，存活率达 93.53% ~ 100%，
且恢复生长后试管苗长势良好，其再生后代的形态特征、过氧化物酶（POD）酶谱和 ISSR-PCR 扩增图谱
与对照相比没有明显差异。
关键词：菊；那贺川野菊；离体保存；遗传稳定性
中图分类号：S 682.1+1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）12-2007-10

Studies on in Vitro Conservation of Chrysanthemum yoshinaganthum
LAN Wei1,2，CHEN Su-mei1，YIN Dong-mei1，and CHEN Fa-di1,*
（1College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2Biology Department of Fuyang
Teachers College，Fuyang，Anhui 236041，China）
Abstract：The effects of different concentrations of sucrose and PP333 on in vitro conservation of
Chrysanthemum yoshinaganthum were investigated，and the genetic stability of the plants regenerated
from the in vitro preserved germplasm was tested too. The results showed that plantlets can be conserved
in vitro for > 360 days in the medium MS + KT 2.0 mg · L-1 + NAA 0.1 mg · L-1 + agar 6.5 g · L-1
supplemented with 15–30 g · L-1 sucrose and 6–9 g · L-1 PP333 under temperature（23 ± 2）℃，
illumination intensity 2 000–3 000 lx and 12 h · d-1 photoperiod. The survival rate of plantlets was
93.53%–100%. The plantlets grew well after growth recovery. There were no significant differences in
the morphology，peroxidase isoenzyme patterns and ISSR-PCR amplification profiles between the plants
regenerated from in vitro preserved plants and non-preserved control，suggesting in vitro conservation
didn’t affect the genetic stability of the germplasm.
Key words：chrysanthemum；Chrysanthemum yoshinaganthum；in vitro preservation；genetic stability

长期生存在逆境中的菊花近缘种野生资源，携带抗病、抗虫、抗逆性等重要基因，是菊花
（Chrysanthemum morifolium）种质创新和品种改良的优异亲本，同时也是探讨菊属系统发生和研究
栽培菊花起源的重要材料（李辛雷和陈发棣，2004；陈文汇和刘俊昌，2005）。以组织培养技术为基

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础建立起来的缓慢生长离体保存技术具有占地空间小，繁殖系数高，无病虫和自然灾害，节省人力
物力，可保持种质优良性状，便于运输与交换等许多优点（伊华林和邓秀新，1999），已成功应用于
咖啡（Bertrand et al.，1992）、铁皮石斛（史永忠 等，1994）、凤仙花（兰芹英 等，2004）、百合（陈
辉 等，2006）、高山景天（刘剑锋 等，2007）、豆蔻（Tyagi et al.，2009）等多种植物。国内外有关
野生植物资源离体保存的研究报道较少（刘瑛，2002；吴祝华 等，2006；张志坷 等，2008）。
那贺川野菊（Chrysanthemum yoshinaganthum）原产日本，分布在日本北部四国、德岛县的那贺
川流域两岸，生长在河边向阳岩石斜坡，具有抗虫性、耐盐性、耐水湿、耐贫瘠等优良性状，推测
由龙脑菊演变而来（Masashi et al.，1987；晨卉 等，2009）。植物缓慢生长保存较多利用低温处理
（李明军 等，2008；赵艳华 等，2008；宋尚伟 等，2009），但长期低温保存致使设备和能源损耗
过大，温度控制不稳定且成本较高。本试验旨在研究常温条件下培养基中添加不同浓度蔗糖与多效
唑（PP333）对那贺川野菊离体保存的影响，进一步分析保存后再生植株的遗传稳定性，为野生菊种
质资源的中长期保存和利用提供理论和技术借鉴。
1 材料与方法
1.1 外植体材料及无菌再生体系的建立
试材那贺川野菊于 2005 年从日本筑波实验植物园引进，保存于南京农业大学中国菊花种质资源
保存中心。2007 年 3 月—2008 年 9 月在南京农业大学花卉遗传育种实验室进行试验。
将试材幼芽清洗去表面尘土，流水下冲洗 10 min，75%乙醇表面消毒 30 s，用 0.1%升汞溶液消
毒 7 min，无菌水冲洗 4 次。用无菌滤纸吸干表面水分，将带有两个节的茎段按生长极性方向接种
于 MS 培养基上。20 d 后，把萌发的腋芽转接到 MS + 2.0 mg · L-1KT + 0.1 mg · L-1NAA + 30 g · L-1
蔗糖 + 6.5 g · L-1 琼脂的培养基上进行增殖扩繁。
1.2 离体保存及组织学观察
选用继代培养 30 d 生长健壮的试管苗两个节茎段为材料，MS + 2.0 mg · L-1 KT + 0.1 mg · L-1
NAA + 琼脂 6.5 g · L-1 为基本培养基，附加 30 g · L-1 蔗糖作为对照，改变培养基中蔗糖与多效唑
（PP333）浓度组合，共 16 种处理（表 1），对试管苗进行保存。培养基 pH 均为 5.8。各组试验材料
在各自条件下先期培养 5 d，以便去除污染材料。在常温（23 ± 2）℃、光照强度 2 000 ~ 3 000 lx、
光照时间 12 h · d-1 条件下培养。每处理随机选取 7 瓶，每瓶 4 株材料，每隔 45 d 观察统计 1 次试管
苗存活率和平均株高，不更换培养基连续统计至 360 d。45 d 和 90 d 时，针对单因子蔗糖处理，增
加统计试管苗平均增值倍数。基部向上所有节间及叶片全部枯死的植株作为死亡株统计。各指标统
计参照王艳芳等（2007）的方法。
保存 12 个月时，取存活率最高的试材茎段、叶片制作常规石蜡切片，进行组织学观察，以正常
条件下每 90 d 继代 1 次的试管苗作为对照。切片厚度 10 μm，番红、固绿染色，光学显微镜下拍照
（Olympus2CY30，Japan）。
1.3 恢复培养及遗传稳定性检测
恢复培养：试管苗保存 12 个月后，在常温条件下，与每 90 d 继代 1 次正常培养的试管苗同时
转接到继代培养基和生根培养基上，30 d 后进行增殖、生根情况以及生物学性状调查。
再生植株的同工酶检测：以恢复生长 1 个月后的植株为材料，取嫩叶 0.2 g，参照何忠效和张树
政（1999）的方法提取粗酶液，每槽加样 20 μL，采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析过氧化物
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酶（POD）同工酶。采用改良联苯胺法染色，凝胶成像分析仪中（上海培清科技有限公司，JS-380
型）观察并拍照，比较缓慢生长保存苗和正常继代对照苗的酶谱差异。
再生植株的 ISSR 标记检测：取植株嫩叶，采用 CTAB 微量法提取基因组 DNA（邹喻萍 等，
2001），Lambda DNA 琼脂糖凝胶检测 DNA 质量和浓度，并稀释至 20 ng · μL-1。ISSR-PCR 反应体
系总体积为 20 μL，其中包括 75 μmol · L-1 dNTP、0.5 μmol · L-1 primer、1.5 mmol · L-1 MgCl2、0.5
μmol · L-1 primer、1.5 U Taq polymerase、40 ng Template DNA。PCR 扩增反应在 MJ Research 公司生
产的 PTC-100TM 型 PCR 仪上进行。随机扩增引物 I35[序列：（AG）8TA]、I34[序列：（AG）8AA]
和 I32[序列：（AG）8TT]。扩增程序为：95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 45 s；53 ℃复性 40 s，72 ℃
延伸 70 s，45 个循环；72 ℃延伸 7 min，最后 4 ℃保存。扩增后每管各加入 6 × 溴酚蓝 0.5 μL，离
心混匀后取 7 μL 扩增产物在 2.0%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶中含有 0.05%的溴化乙锭（EB）。电极缓
冲液为 1 × TAE，电压 5 V · cm-1。在上海培清科技有限公司生产的 JS-380 型凝胶成像分析仪上观测
并照相，比较离体保存苗与正常继代对照苗的条带差异。上述 PCR 反应体系所用试剂均购自南京生
兴生物技术有限公司。使用 DPS 和 Excel 软件对试验数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同浓度蔗糖对试管苗保存效果的影响
常温条件下，基本培养基中添加 15 ~ 90 g · L-1 蔗糖，随着蔗糖浓度的增加，那贺川野菊试管苗
保存时间逐渐缩短，存活率逐渐降低（表 1）。单因子方差分析结果表明，平均增殖倍数随蔗糖浓度
的升高而增加，平均株高随蔗糖浓度（30 ~ 90 g · L-1）的升高有逐渐降低的趋势（表 2）。蔗糖浓度
较低时（15 和 30 g · L-1），保存前期 90 d 内，植株较高，叶片较大，整体色泽绿，长势旺盛，两种
处理试管苗存活率与平均株高差异不大（图 1，B1、B5），这是由于此浓度范围内蔗糖提供了试管
苗生存和生长适量的碳源；随着保存时间的延续，植株因过度生长而开始衰老，基部叶片干枯，蔗
糖浓度为 30 g · L-1 的对照组试管苗保存至 180 d 时植株全部死亡。与对照组相比，蔗糖浓度降至 15
g · L-1 时，保存时间延长了 45 d。蔗糖浓度提高至 60 ~ 90 g · L-1 时，植株色泽加深，顶端 1 ~ 4 片叶
表 1 不同蔗糖与多效唑浓度配比对试管苗存活率的影响
Table 1 Effects of different concentrations of sucrose and PP333 on the survival rate of in vitro plantlets conservation
存活率/% Survival rate 编号
Code
蔗糖/(g · L-1)
Sucrose
PP333/
(mg · L-1) 45 d 90 d 135 d 180 d 225 d 270 d 360 d
B1 15 0 100 100 88.48 42.31 0 0 0
B2 15 3 100 100 100 58.32 40.29 36.08 36.08
B3 15 6 100 100 100 100 96.78 96.78 93.53
B4 15 9 100 100 100 100 100 100 96.72
B5（对照 Control） 30 0 100 100 27.62 0 0 0 0
B6 30 3 100 100 100 96.26 83.29 77.81 44.42
B7 30 6 100 100 100 100 100 100 97.43
B8 30 9 100 100 100 100 100 100 100
B9 60 0 100 49.31 0 0 0 0 0
B10 60 3 100 93.28 80.00 66.73 33.33 0 0
B11 60 6 100 100 84.42 77.94 77.94 0 0
B12 60 9 100 91.81 82.02 68.91 62.33 0 0
B13 90 0 100 29.58 0 0 0 0 0
B14 90 3 100 90.00 70.04 70.04 30.20 0 0
B15 90 6 100 85.92 65.44 57.71 25.62 0 0
B16 90 9 100 60.82 38.04 25.61 22.83 0 0
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变狭且纵向内卷，株高变矮，叶柄缩短，生长受到明显抑制，与此同时，试管苗茎的向重力性反应
强烈，茎秆表现出特殊的斜向至横向上生长现象（图 1，B9、B13）。当蔗糖为 90 g · L-1 时，保存至
90 d，仅有 29.58%的植株存活，且长势较弱。
试验结果表明，高浓度蔗糖不适于那贺川野菊试管苗保存；降低蔗糖浓度，可延长其保存时间。

表 2 不同浓度蔗糖试管苗增殖倍数及株高
Table 2 Proliferation rate and height of in vitro plantlets conserved and different concentration of sucrose
平均株高/ cm Mean height 编号
Code
蔗糖/（g · L-1）
Sucrose
PP333/
（mg · L-1）
平均增殖倍数（90 d）
Mean proliferation rate 45 d 90 d
B1 15 0 2.06 ± 0.31 b 2.15 ± 0.27 a 4.74 ± 0.54 a
B5 30 0 2.31 ± 0.55 ab 2.20 ± 0.19 a 4.56 ± 0.36 a
B9 60 0 2.50 ± 0.46 ab 1.83 ± 0.13 b 3.33 ± 0.37 b
B13 90 0 2.88 ± 0.14 a 1.68 ± 0.22 c 2.04 ± 0.39 c
注：同列内相同字母表示在 0.05 水平上差异不显著。下同。
Note：Means with in the same column followed by the same letter are not significantly differently at 0.05 level. The same below.

图 1 不同处理中离体保存植株的生长状况
Fig. 1 The growth state of conserved plantlets in different treatments
2.2 不同浓度蔗糖与多效唑（PP333）配比对试管苗保存效果的影响
从表 1 可以看出，培养基中添加不同浓度配比的蔗糖和 PP333，减缓了试管苗生长，存活率均得
到提高。蔗糖浓度为 15 ~ 30 g · L-1 时，随 PP333 浓度升高，存活率逐渐提高，PP333 浓度 6 ~ 9 mg · L-1
时，保存 360 d 存活率均为 93.53%以上（图 1，B3、B4、B7 和 B8）；蔗糖为 60 ~ 90 g · L-1 时，蔗
糖与 PP333 配比表现出明显的“互作效应”，PP333 减缓了高浓度蔗糖对试管苗的毒害，保存时间比单
独使用高浓度蔗糖延长了 135 d。蔗糖浓度 60 g · L-1条件下，添加 6 mg · L-1PP333，225 d 时存活率达
77.94%， PP333提高至9 mg · L-1，存活率降为62.33%；蔗糖浓度达到90 g · L-1时，添加3 mg · L-1 PP333，
存活率最高，继续提高 PP333 浓度，试管苗存活率逐渐降低。当 PP333 浓度一定时，添加低浓度蔗糖
（15 ~ 30 g · L-1），随蔗糖浓度的增加，试管苗存活率上升；提高蔗糖浓度（30 ~ 90 g · L-1），随蔗糖
浓度增加，试管苗存活率逐渐下降。说明较低浓度蔗糖和较高浓度 PP333 有利于试管苗的离体保存。
从试管苗的株高变化来看，蔗糖浓度一定时，PP333 浓度升高，株高逐渐降低，随着时间的延长，
抑制作用逐渐强烈，12 种培养基保存的植株生长过程一致，0 ~ 90 d 生长缓慢，90 ~ 180 d 进入快速
生长，180 ~ 225 d 又进入缓慢生长期（图 2），试管苗的保存时间均得到延长。与此同时，随蔗糖和
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PP333 浓度的递增，植株变得粗壮，茎、叶颜色加深，叶片增厚，叶片长宽比缩小，叶柄和节间长度
极度缩短，叶片表皮毛缩短且数量增多。
图 2 试管苗在不同浓度蔗糖与多效唑配比的培养基中保存不同时间的株高变化
Fig. 2 Dynamic of height of in vitro plantlets conserved in medium with different concentration of sucrose and PP333 for different duration

比较以上结果可以得出，较低浓度的蔗糖（15 ~ 30 g · L-1）结合高浓度的 PP333（6 ~ 9 mg · L-1），
试管苗存活率较高，生长健壮，且叶片增厚，叶色浓绿，适宜于那贺川野菊试管苗的中长期离体保存。
2.3 保存材料的组织学观察
经蔗糖与 PP333 配比处理保存 360 d 且存活率为 100%（B8 处理）的那贺川野菊试管苗与正常继
代对照相比，组织结构发生了一定变化，主要表现为植株叶片叶肉细胞层数增加，细胞间隙减小，
细胞密度增加，栅栏组织排列更加致密，海绵组织增厚（图 3，a、b）；茎段皮层薄壁细胞变小，细
图 3 B8 处理后保存 360 d 的试管苗与对照苗叶片（a，对照；b，B8）和茎（c，对照；d，B8）组织切片
E．表皮；C．皮层；U．上表皮；P．栅栏组织；S．海绵组织。
Fig. 3 The cross section of leaf（a，control；b，B8 treatment conserved for 360 d）and
stem（c，control；d，B8 treatment conserved for 360 d）of the plantlets
E. Epidermis；C. Cortex；U. Upper epidermis；P. Palisade tissue；S. Spongy tissue.

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胞层数增加，间隙减小（图 3，c、d）。由此说明，试管苗在保存过程中添加一定浓度蔗糖和 PP333
使其细胞、组织结构发生一些适应性变化，减缓了其生长速度，使保存时间得以延长。
2.4 保存材料恢复培养生长状况
将保存 360 d 存活率较高的 B3、B4、B7、B8 处理中的那贺川野菊试管苗转接至继代及生根培
养基上，植株生长旺盛，形态正常，与正常条件下继代试管苗相比，其平均增殖倍数、株高与根数
无显著差异（表 3；图 4）。

表 3 保存 360 d 的试管苗的恢复生长情况
Table 3 Recovering ability of plantlets conserved for 360 d
编号
Code
蔗糖/(g · L-1)
Sucrose
PP333/
(mg · L-1)
平均增殖倍数
Mean proliferation rate
平均株高/cm
Mean height
平均根数
Mean number of roots
B3 15 6 2.38 ± 0.14 a 4.57 ± 0.31 a 7
B4 15 9 2.25 ± 0.00 a 4.77 ± 0.65 a 6
B7 30 6 2.38 ± 0.25 a 4.73 ± 0.29 a 6
B8 30 9 2.29 ± 0.10 a 4.57 ± 0.67 a 8
对照 Control 30 0 2.31 ± 0.13 a 4.70 ± 0.43 a 7


图 4 保存 360 d 的试管苗再生植株与对照植株增殖倍数及株高的比较
A．正常继代试管苗（对照）；B3、B4、B7 和 B8 同表 1。
Fig. 4 Contrast of regenerated plants of conserved for 360 d and control in proliferation rate and height
A．Following the generation of normal plantlets（control）；B3，B4，B7 and B8：See table 1.

2.5 再生植株遗传稳定性检测
B3、B4、B7、B8 处理中保存 360 d 的试管苗再生后代过氧化物酶（POD）同工酶酶谱及引物
为 I35、I34、I32 的 ISSR 扩增谱带与正常继代对照组相比，没有检测到多态性条带产生（图 5，图
6），说明那贺川野菊离体保存保持了良好的遗传稳定性。

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图 5 再生植株的同工酶鉴定
0. 正常继代试管苗；B3、B4、B7 和 B8 同表 1。
Fig. 5 Appraisal of the regenerated plantlets with isoenzyme
0. Following the generation of normal plantlets；B3，B4，B7 and B8：See table 1.
图 6 再生植株的 ISSR 分子标记鉴定
A．引物 I35 扩增条带；B．引物 I34 扩增条带；C．引物 I32 扩增条带。M．100 bp DNA ladder；
0. 正常继代试管苗；B3、B4、B7 和 B8 同表 1。
Fig. 6 Appraisal of the regenerated plantlets with ISSR-PCR
A. Amplified profile using primer I35；B. Amplified profile using primer I34；C. Amplified profile using primer I32；M. 100 bp DNA ladder.
0. Following the generation of normal plantlets；B3，B4，B7 and B8：See table 1.
3 讨论
研究结果表明，培养基中添加高浓度蔗糖（50 ~ 90 g · L-1）能够显著抑制试管苗的生长，延长
保存时间（王桂兰 等，2002；陈辉 等，2006；周逊 等，2006），其机理是由于高渗化合物提高了
培养基的渗透压，造成水势逆境，细胞膨压降低而吸水困难，同时细胞壁酶的活性受到抑制，细胞
生长受到阻碍而延缓（董龙英和颜季琼，1992）。但本研究却得到了相反的结果：培养基中加入 60 ~
90 g · L-1 蔗糖，那贺川野菊试管苗保存时间比对照缩短，且存活率降低，植株细弱，毒害症状明显，
可能是不同植物对蔗糖浓度的敏感性不同，试管苗因培养基中蔗糖浓度过高而吸水困难，导致了生
长不良的后果；降低培养基中的蔗糖浓度至 15 g · L-1，能够减缓试管苗生长，比对照延长存活时间
45 d，可用于其短期保存，可能是由于蔗糖浓度偏低，植株无法合成足够多的碳水化合物满足自身
生长的需要，故长势减弱，从而延长了保存时间，这与切花菊‘神马’上的研究结果一致（王艳芳 等，
2007）。
PP333 是一种高效低毒的植物生长延缓剂，培养基中加入一定浓度的 PP333 可以延长培养材料的
保存时间。前人研究认为 0.1 ~ 0.2 mg · L-1 的 PP333 可以有效延长野生草莓、金铁锁试管苗的继代周
期（赵密珍 等，2003；刘小莉 等，2009）。多数研究者报道，PP333 0.5 ~ 2.5 mg · L-1 有利于葡萄、
猕猴桃、欧李、巴戟天、红根草、怀地黄等植物的离体保存（张利平 等，1994；郭延平和李嘉瑞，
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1995；钟士传，2006；付传明 等，2007；李锋 等，2008；张晓丽 等，2009）。蒋小满等（2007）
则指出，越橘试管苗对 PP333 极为敏感，在极低浓度下（0.05 mg · L-1）仍对越橘试管苗的生长产生
强烈抑制，并使试管苗畸形，这都与本研究结果不尽一致。本试验对蔗糖与 PP333 组合配比进行研
究，发现 6 ~ 9 mg · L-1 PP333 与 15 ~ 30 g · L-1 蔗糖配比，对那贺川野菊试管苗离体保存有良好效果，
连续保存 12 个月存活率达到 93.53% ~ 100%，这与甜菜、生姜试管苗保存中分别使用的 PP333 最佳
质量浓度 5 mg · L-1、8 ~ 10 mg · L-1 结果基本一致（王小兰和李同祥，2005；陈传红 等，2006），可
见 PP333 在离体保存中的效果因植物种类而异，可能与培养材料本身的遗传基础、来源、生理状况、
内源激素水平以及植物激素种类与浓度等有关。
试管苗在离体保存过程中，植株亦出现了其它形态特征变化，如茎杆增粗，叶片增厚、长宽比
缩小、叶柄极度变短，表皮毛缩短增密等，继代恢复培养后，这些形态特征均能恢复正常，说明这
是植物对逆境刺激所产生的适应性变化，并非遗传性变异，这与前人的研究结果（Bonnier & van
Tuyl，1997；陈辉 等，2006）一致。那贺川野菊试管苗茎段及叶片细胞间隙减小，细胞密度与层数
增加，海绵组织厚度增加，细胞组织排列致密等细胞、组织学特征的变化与高强和花永怒（1991）
报道基本一致，可能是试管苗长时间保存的另一种适应。缓慢生长离体保存除利用蔗糖浓度与添加
生长抑制物质等措施外，还常与培养基成分及低温等进行复合处理。因此，通过降低培养基成分与
调节培养温度，以及选择其他更合适的生长抑制物质种类与浓度，以期进一步延长保存时间，将有
待于未来的探讨。
植物向重力性反应对其生长发育有着重要的生理作用，直接影响到植物体从外界获得水分、矿
物质及光能等生长必需物质。前人研究认为，高等植物向重力性反应与生长素有关（Kiss et al.，1996；
Tasaka & Kato，1999），可能涉及生长素的极性运输和对生长素敏感性的改变（Behringer & Lomax，
1999），生长素运输及信号转导途径中任何一步发生异常均将影响植物的向重力性反应（张红宇 等，
2006）。本试验发现，培养基中添加高浓度蔗糖促进植株茎的重力响应，引起那贺川野菊试管苗茎明
显斜向至横向上生长的向重力性反应，尚未见类似报道，其原因还有待于进一步的研究。

References
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