全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（9）：1477–1484
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–12–11；修回日期：2010–07–13
基金项目：国家‘十一五’科技支撑计划项目（2006BAD01A19-2）；国家‘863’计划项目（2006AA100109）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：sunzy@caf.ac.cn）
多年生黑麦草 P5CS基因的 cDNA克隆、表达及
亚细胞定位
曹 丽 1,2，孙振元 2,*，义鸣放 1，韩 蕾 2，辛海波 1
（1 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193；2 中国林业科学研究院林业研究所/国家林业局林木培育重点实
验室，北京 100091）
摘 要：以多年生黑麦草（Lolium perenne）‘Derby’为试材，采用 RT-PCR结合 RACE技术，克隆
获得 1个Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶基因（P5CS）的 cDNA序列，全长 2 528 bp，推断其编码 716个
氨基酸，命名为 LpP5CS。序列分析表明：LpP5CS基因与小麦 TaP5CS和水稻 OsP5CS基因核苷酸序列的
相似性分别为 92.05%和 85.82%，氨基酸序列的相似性分别为 93.99%和 87.99%。半定量 PCR结果表明，
LpP5CS基因在多年生黑麦草根、茎，叶均有表达。盐处理下，表达量高于对照，其中叶片中表达量最高，
根中最低。200 mmol · L-1 NaCl处理下，LpP5CS基因表达量随处理时间延长，有先升高后降低的趋势。
洋葱鳞茎表皮细胞的瞬时表达显示，LpP5CS蛋白定位于细胞膜和细胞核。
关键词：多年生黑麦草；P5CS；渗透胁迫；克隆；亚细胞定位内容
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）09-1477-08

Cloning，Expression and Subcellular Localization of P5CS Gene from
Perennial Ryegrass（Lolium perenne L.）
CAO Li1,2，SUN Zhen-yuan2,*，YI Ming-fang1，HAN Lei2，and XIN Hai-bo1
（1Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，
China；2Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry/Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation，State
Forestry Administration，Beijing 100091，China）
Abstract：In this study，full length cDNA sequence of a putative ∆1-pyrroline-5-carboxylate synthase
gene（LpP5CS）was cloned from perennial ryegrass（Lolium perenne L.‘Derby’）leaves using RT-PCR
and rapid amplification of cDNA ends（RACE）. Sequence analysis showed that the nucleotide sequence of
this gene is 2 528 bp，containing a complete open reading frame and encoding 716 amino acids. Nucleotide
and amino acid sequence analysis revealed that LpP5CS shares high identity with the orthologs from
Triticum aestivum（92.05%，93.99%）and Oryza sativa（85.82%，87.99%），respectively. Semi-quantitative
RT-PCR analysis showed that LpP5CS expressed in different tissues. Various elevated levels of LpP5CS
expression have been detected when the seedling roots exposed to high salinity. Tested with salt solution，
its expression was higher than control，and the highest in leaves，the lowest in roots，The contents of
LpP5CS increased first then decreased with the processing time is extended after 200 mmol · L-1 NaCl

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treatment. Finally，subcellular localzation assays showed that the LpP5CS protein was present in the
nucleus and at the plasmalemma.
Key words：perennial ryegrass；∆1-Pyrroline-5-carboxylate synthetase；osmotic stress；cloning；
subcellular localization

多年生黑麦草（Lolium perenne L.）建植速度快，修剪后再生力强，耐践踏性和耐牧性强，是世
界最重要的草坪草种和禾本科牧草之一，世界各地的温带地区均有分布（Jauhar，1993；Xu et al.，
2001；Ma et al.，2006），适宜我国北方大部分地区种植。但绝大多数黑麦草品种耐盐抗旱性差，提
高其耐盐抗旱性对发展我国草坪业和畜牧业具有重要的意义。
吡咯啉–5–羧酸合成酶（delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）是植物通过谷氨酸
途径合成脯氨酸的关键酶（Hu et al.，1992），是双功能酶（Delauney & Verma，1993），也是限速酶
（Kavi Kishor et al.，2005）。逆境条件下该基因的诱导表达伴随着脯氨酸合成的增加（Chen et al.，
2008）。Su和Wu（2004）将豇豆的 P5CS基因转入水稻，结果发现水分胁迫前，用胁迫诱导型启动
子启动的两个转基因株系的脯氨酸含量分别是对照的 138％和 121％；水分胁迫 8 d后，脯氨酸含量
分别是对照的 182%和 169%。大量资料表明，脯氨酸积累与植物对干旱和盐胁迫适应性之间有显著
的正相关（Claussen，2005）。
目前，已经在豇豆（Hu et al.，1992）、拟南芥（Savoure et al.，1995）、蒺藜苜蓿（Armengaud et
al .，2004）等植物中克隆到了 P5CS基因。拟南芥中有两个 P5CS同源基因：AtP5CS1和 AtP5CS2。
在渗透胁迫下，AtP5CS1 基因在各种器官和不同的组织中都表达，并且在脱水，高盐和 ABA 处理
下主要是上调表达（Yoshiba et al.，1995；Szekely et al.，2008），但是在非逆境条件下该基因在培养
的分裂细胞中没有检测到它的表达。AtP5CS2 基因在培养的分裂细胞表达，并且逆境下该基因的诱
导依赖于蛋白质的合成（Strizhov et al.，1997）。Fujita等（1998）从番茄分离到两个 P5CS基因序列，
在 NaCl胁迫下，tomPRO2的 mRNA水平增加 3倍多，而 tomPRO1的信息没有检测到。由此可见，
同一类植物 P5CS 基因可以对不同的逆境胁迫作出反应，而不同的 P5CS 基因也可以受同一种胁迫
诱导表达。
目前尚未有多年生黑麦草 P5CS 基因的相关报道。本研究中利用 RT-PCR 结合 RACE（rapid
amplification of cDNA ends）技术，从 200 mmol · L-1NaCl处理 3 h的多年生黑麦草叶片中克隆到一
个 P5CS同源基因的全长 cDNA，并对其盐胁迫下的表达规律进行了分析，最后构建瞬时表达载体，
利用基因枪轰击洋葱鳞茎表皮细胞，分析了 LpP5CS 蛋白的亚细胞定位情况，为进一步研究脯氨酸
在多年生黑麦草中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
试验于 2008—2009年在北京进行。以多年生黑麦草（Lolium perenne L.）‘Derby’种子为材料，
用 15%的次氯酸钠消毒 20 min，然后用无菌水清洗 4 ~ 6次，在培养皿中用无菌水培养至种子萌发。
将萌发的种子转移到装有基质（基质组成为营养土︰蛭石︰珍珠岩 = 4︰1︰1）的塑料盆内（10 cm × 10
cm），于 25 ℃/18 ℃（昼/夜）温室下正常生长，光照 16 h，每盆 10株。幼苗 4 W时进行 200 mmol · L-1
NaCl盐处理，分别剪取对照（未经盐处理）和盐处理后 3、6、9、12和 24 h的根、茎和叶。液氮
速冻后–70 ℃保存，用于提取总 RNA。
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1.2 多年生黑麦草 P5CS同源基因 cDNA片段的克隆和分析
以经过盐处理 3 h 的多年生黑麦草叶片为材料，液氮中研磨，总 RNA 的提取采用 Trizol 法
（Invitrogen，CA，USA）。根据 GenBank 中已发表的小麦（AAX35536）、斑茅（ABV03819）、水
稻（BAA19916）P5CS基因的 cDNA序列，在同源区域设计 5′端引物：5′-GGATTCATCTGGTATA
TT(T/C)TGGGAT-3′和 3′端引物：5′-ACCTTATGCAATA(C/T)(G/T/C)G(C/T)GTTTGAT-3′。以总 RNA
为模板，RT-PCR反应参照 Promega公司的M-MLV Reverse Transcriptase说明书进行。PCR反应体
系为 25 µL，反应条件为 94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，50 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 70 s，40
个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR产物测序后用 DNAMAN软件与其他植物 P5CS基因的 cDNA序列
进行同源性比对。
PCR 产物的凝胶回收按照说明书进行。连接反应按 pMD19-T 载体试剂盒说明书进行。转化大
肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞，然后将转化的大肠杆菌用氨苄青霉素、X-gal和 IPTG
平板筛选，挑取白色菌斑进行菌体 PCR 扩增与质粒双酶切鉴定。选取 PCR 及酶切检测均呈阳性的
菌落测序。测序工作由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。测序结果利用 DNAMAN和 NCBI
BLAST进行序列分析。
1.3 多年生黑麦草 P5CS同源基因全长 cDNA序列的克隆和分析
根据上一步骤获得的 cDNA 片段序列，设计 5′端引物（GSP1：5′-TCGAATGGCTAAAGAC
GCAATCTGGA-3′；GSP2：5′-GCTGTATAGGCCATCCACATCAC-3′）和 3′端引物（GSP3：5′-AGT
GGTAATGGTCTTCTCCTAAAAGG-3′），5′RACE反应条件按照 TaKaRa公司 5′-Full RACE Kit操作
说明书进行，3′RACE反应条件按照 Clontech公司 BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit的说
明书进行。PCR产物测序后，用 Clustalx软件对由其序列推导的氨基酸序列和 GenBank中已发表的
其他植物的 P5CS氨基酸序列进行聚类分析。
1.4 P5CS基因在多年生黑麦草不同组织和不同处理下的表达和分析
根据获得的全长序列，设计 5′端引物：5′-GCTGTTATCACCAGAAAT-3′和 3′端引物：5′-CCAGT
AGACCTGCCAAAC-3′，以 eEF-1α（James & Ruth，2009）为内标基因（eEF-1α For 5′-GAGAGGTCC
ACCAACCTTG-3′；eEF-1α Rev 5′-GGCTTGGTGGGAATCATC-3′），RT-PCR法分析未经盐处理及盐
处理后 P5CS 基因在多年生黑麦草各组织中的表达情况，反应条件为退火温度 55 ℃，35 个循环。
每组处理重复 3次，用凝胶成像软件量化图片中 PCR产物，反应完毕后取 10 µL于 1.5%的琼脂糖
凝胶上进行电泳分析。
1.5 瞬时表达载体构建
根据目的基因 LpP5CS序列设计带有酶切位点 NcoⅠ/SacⅠ的引物对 GFP-1 For（5′-CGAACGAT
AGCCATGGTCATGGCGCCCGCCGACCCCAAC-3′）/GFP-1 Rev（5′-AATTCGAAGCTTGAGCTCTTG
CAAAGGAAGACTCTTATGG-3′）扩增 LpP5CS基因完整开放阅读框（不包含终止子）。扩增产物回
收纯化后连接到克隆载体 pMD19-T上，获得重组质粒，用 NcoⅠ/SacⅠ进行双酶切，回收目的片段
后，与经用 NcoⅠ/SacⅠ双酶切的 pSAT6-GFP-N1（原 RFP改造为 GFP，启动子为 CaMV 35S，质粒
由中国农业大学王涛教授课题组惠赠）载体用 T4连接酶进行连接，构建成瞬时表达载体 pSAT6-
LpP5CS-GFP-N1。获得的连接产物转化到 E. coli DH5α，经酶切和测序鉴定正确后，筛选阳性克隆
并提取质粒 pSAT6-LpP5CS-GFP-N1。
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1.6 基因枪轰击洋葱表皮
1.6.1 微粒子弹的制备
1 ~ 2 µg的 pSAT6-LpP5CS-GFP-N1和 pSAT6-GFP重组质粒 DNA分别与 8 µL 60 mg · mL-1的金
粉悬液（直径为 1.0 µm）、4 µL 0.1 mol · L-1亚精胺（抽滤灭菌）、8 µL 2.5 mol · L-1 CaCl2混合制作成
金粉悬浮液，振荡器上震荡 3 min，10 000 r · min-1 离心 15 s，收集金粉沉淀，20 µL无水乙醇重悬
金粉–DNA混合物。
1.6.2 轰击受体材料
撕取幼嫩的洋葱表皮平放在MS固体培养基（1.5%琼脂）上，25 ℃预培养 4 h。选用 1 100 psi
的压力膜，将 10 µL 金粉–DNA混合物点在轰击膜中央，采用 PDS 1000/He型基因枪（Bio-Rad）
进行轰击，轰击距离 6 cm，真空度为 25 In · Hg-1。轰击后的洋葱表皮细胞 25 ℃暗培养 24 h后在共
聚焦显微镜（C1 Nikon）下后观察 GFP的表达情况。
2 结果与分析
2.1 多年生黑麦草 P5CS同源基因全长 cDNA的克隆
以 P5CS蛋白保守序列为基础，设计简并引物，通过 PCR扩增，从多年生黑麦草叶片中获得了
一个 852 bp的 cDNA片段。测序后，在 GenBank中进行 Blast分析发现，该片段编码的氨基酸序列
与 P5CS 类蛋白高度同源。以此片段为模板，设计特异引物进行 3′RACE、5′RACE，获得了长度为
1 139 bp和 714 bp的 cDNA全长序列（图 1），经过 Blast比对后，与 P5CS类基因同源，将其定名
为 LpP5CS。
LpP5CS包含一个长度为 104 bp的 5′非翻译区和 272 bp的 3′非翻译区，其开放阅读框架（open
reading frame，ORF）编码一个含 716个氨基酸的蛋白质，推定的分子量为 77.537 kD，推测的等电
点为 5.80。
图 1 PCR产物检测
A：3′RACE产物；B：5′RACE产物；C：CDS产物；M：Marker。
Fig. 1 Agrose gel electrophoresis of PCR products
A，B and C show 3′，5′ RACE and CDS product respectively；M：Marker.

2.2 多年生黑麦草 P5CS同源基因的序列分析
将 LpP5CS 进行 Blast 同源性分析，发现其与小麦（AAX35536）、水稻（BAA19916）、拟南芥
P5CS1（CAA60446）、豇豆（M92276）P5CS cDNA序列的同源性分别达 92.05%、85.82%、68.71%
和 70.33%，氨基酸序列的同源性分别为 93.99%、87.99%、73.22%和 67.92%。
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氨基酸序列比对显示，LpP5CS都包含有高等植物 P5CS蛋白质的 6个主要功能域：ATP结合位
点，两个亮氨酸结构域，NADPH结合位点，谷氨酰激酶（GK）结构域和谷氨酸半醛（GSA）结构
域（图 2），说明 LpP5CS可能在多年生黑麦草脯氨酸合成中起作用。从图 2可以看到，除谷氨酰激
酶（GK）结构域和 1个亮氨酸结构域差异较大外，其它 4个功能域的差异都较小，说明 P5CS蛋白
质的主要功能域相对保守。豇豆 VaP5CS蛋白质序列 129位的苯丙氨酸（Phenylalanine，F）是脯氨
酸反馈抑制位点，这个反馈抑制位点在原核生物和真核生物中是比较保守的，该位点的突变能使
VaP5CS酶的反馈抑制作用丧失(Hong et al.，2000)。在 LpP5CS的 128位点发现苯丙氨酸（图 2），
说明 LpP5CS和 VaP5CS酶一样，其活性可能被高浓度脯氨酸抑制。
图 2 LpP5CS氨基酸序列与其它植物 P5CS氨基酸序列的比较分析
框内表示 5个主要功能域的序列。*表示苯丙氨酸。
Fig. 2 Comparison of the deduced amino acid sequences of LpP5CS with other plants
Sequences under square show the conserved P5CS function domains. * indicate Phenylalanine.

采用 ClustalW和 Phylip程序分析了 LpP5CS基因与其它 P5CS基因的进化关系。结果（图 3）
表明：所选的 P5CS聚成二组：双子叶植物杨树，葡萄，大豆，苜蓿等分在同一个组群（Ⅰ）；LpP5CS
与其他单子叶植物小麦、玉米、斑茅、稻类 P5CS蛋白（TaP5CS，GmP5CS，SaP5CS，OsP5CS）分
在同一个组群（II），在这个组内 TaP5CS和 LpP5CS的距离最近，LpP5CS2和 OsP5CS的距离最远。

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图 3 LpP5CS基因与已知的 P5CS基因序列聚类
Fig. 3 Phylogenetic tree for P5CS from Lolium perenne and those from different species
2.3 盐胁迫下 LpP5CS同源基因在多年生黑麦草各组织中的表达
分别提取根、茎，叶的 RNA进行半定量 RT-PCR，分析 LpP5CS在不同器官和不同盐处理下的
表达模式。结果表明，LpP5CS基因在多年生黑麦草各组织中均表达，未经盐处理的各组织 LpP5CS
基因表达量均较弱，盐处理后，组织中表达量急剧升高（图 4）。用凝胶成像软件量取 DNA条带密
度值，对根、茎和叶片表达量进行相对定量，结果表明，盐处理后，多年生黑麦草叶片和茎中 P5CS
基因表达量最高，差异不大，根中最低。本试验中克隆到的多年生黑麦草 P5CS 基因与水稻和小麦
的 P5CS基因表达特性相同。
用叶片分离的 mRNA反转录成 cDNA作为模板，对 LpP5CS不同盐处理时间的表达情况进行了
分析。图 5结果显示，200 mmol · L-1NaCl处理下，LpP5CS基因表达量随处理时间延长，有先升高
后降低的趋势。盐处理后基因表达量逐渐增高，处理后 9 h基因表达量最高，12 h到 24 h略降低。
以上结果表明，LpP5CS基因受盐诱导而表达。
2.4 LpP5CS蛋白亚细胞定位
为了探索 LpP5CS 蛋白在植物亚细胞结构中的分布情况，构建了 LpP5CS 基因的瞬时表达载体
pSAT-LpP5CS-GFP。将 LpP5CS-GFP融合基因转化到洋葱表皮细胞，借助于绿色荧光蛋白信号确定
目标蛋白在细胞内的分布。基因枪轰击洋葱表皮细胞 24 h后，通过共聚焦激光扫描显微镜观察绿色
荧光蛋白的信号。结果显示，转 pSAT-GFP 载体的洋葱细胞内绿色荧光分布在整个细胞膜、细胞核
和细胞质中（图 6，B），转 pSAT-LpP5CS-GFP（图 6，C）载体的洋葱细胞内绿色荧光都分布在细
胞膜和细胞核中，说明 LpP5CS蛋白可能分布在细胞膜和细胞核上。
图 4 LpP5CS在多年生黑麦草不同组织中的表达
1 ~ 3：未经 NaCl处理的根、茎、叶；4 ~ 6：200
mmol · L-1NaCl处理的根、茎、叶。
Fig. 4 LpP5CS expression in various tissues
1–3：Root，stem and leaf without NaCl treatment；4–6：Root，
stem and leaf at 200 mmol · L-1 NaCl.
图 5 200 mmol · L-1 NaCl处理后不同时间 LpP5CS
在叶片中的表达
Fig. 5 LpP5CS expression in leaves at different time after
200 mmol · L-1 NaCl treatment
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图 6 pSAT-LpP5CS-GFP载体基本结构（A）、GFP（B）、LpP5CS（C）基因在洋葱内表皮细胞中的瞬时表达
1、4：洋葱内表皮细胞外观图；2：1与 3的重叠；5：4与 6的重叠；3、6：共聚焦显微镜下
GFP蛋白，LpP5CS-GFP融合蛋白的绿色荧光信号。
Fig. 6 The construction of pSAT-LpP5CS-GFP（A），transient expression of GFP（B），LpP5CS（C）gene in onion cells
1，4：Out-look of onion epidermal cells；2：Overlaid of 1 and 3；5：Overlaid of 4 and 6；3，6：Images of green
fluorescence of GFP，LpP5CS-GFP protein in onion cells under the confocal microscope.
3 讨论
已有研究表明，植物中脯氨酸的合成有两条途径——谷氨酸途径和鸟氨酸途径，其中谷氨酸途
径在渗透胁迫和氮素缺乏的情况下发挥了重要作用（Delauney & Verma，1993）。在植物中，谷氨酸
经由 P5C 合成脯氨酸是由两个酶催化的，即 P5CS 和 P5CR。对基因在胁迫下表达的分析显示，脯
氨酸含量的上升和下降与 P5CS基因的 mRNA水平的消长成比例。而 P5CR受胁迫的影响不大。无
论是干旱、盐胁迫或是 ABA，都不能明显提高 P5CR的表达水平（Yoshiba et al.，1995）。
本试验中通过 RT-PCR结合 RACE技术从多年生黑麦草中克隆到 P5CS基因，氨基酸序列比对
显示，该基因推导的氨基酸序列与已知的其它植物该基因的氨基酸序列同源性都在 60%以上，说明
该基因在物种进化上具有高度的保守性。LpP5CS包含有高等植物 P5CS蛋白质的保守结构域，包括
共同的 ATP和 NADPH结合位点，两个亮氨酸结构域，谷氨酰激酶（GK）结构域和谷氨酸半醛（GSA）
结构域，且与水稻 P5CS蛋白结构类似（比较结果未列出），都不具有跨膜结构及信号肽，进一步说
明该基因在物种进化过程的保守性很高。
半定量 RT-PCR结果表明，与报道的水稻（Hur et al.，2004）、仙人掌（Silva-Ortega et al.，2008）
P5CS基因表达特性相同，多年生黑麦草 P5CS基因受盐诱导而表达，进一步证明多年生黑麦草体内
存在着渗透胁迫后脯氨酸积累的适应机制（Kemble & MacPherson，1954），这为进一步研究多年生
黑麦草体内脯氨酸的生理功能及通过生物技术提高多年生黑麦草的抗逆性提供了线索。本文所获得
的基因是否会被其他逆境胁迫诱导表达以及与脯氨酸积累的量化关系，值得进一步研究。
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洋葱鳞茎表皮细胞的瞬时表达显示，LpP5CS定位于细胞膜和细胞核，与普通菜豆 P5CS蛋白亚
细胞定位结果一致（Chen et al.，2008），进一步说明脯氨酸合成的第一步反应可能发生在细胞膜和
细胞核上。然而逆境胁迫下多年生黑麦草脯氨酸的合成是否如此，值得进一步探讨。

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