全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（8）：1479–1488 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–05–10；修回日期：2011–07–14
基金项目：国家自然科学基金项目（30971849）；高校基本科研业务专项基金项目（XDJKC109）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhuliquan@swu.edu.cn；wxj@swu.edu.cn）
甘蓝 SRK 的 S 域及 SCR 酵母表达载体的构建
及其相互作用区段的研究
彭一波 1，朱利泉 1,*，杨 红 1，薛丽琰 1，罗 兵 1，吴志刚 1，黄 丹 1，
杨 昆 1，高启国 2，李成琼 2，任雪松 2，王小佳 2,*
（1 西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716；2 重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400716）
摘 要：为了深入研究 S 位点受体激酶（SRK）和 S 位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和
（self-incompatibility，SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制，以自交不亲和性高的结球甘蓝为材
料，采用酵母双杂交体系，构建 pGADT7-eSRKs 和 pGBKT7-SCRs 重组载体，并分别转化到 Y187 和
Y2HGold 酵母中，通过 SD/-Ade-His-Trp-Leu 平板上菌落的形成，PCR 以及 x-α-gal 显色反应鉴定转化到
酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明，SRK S 域的 SRK1 及 SRK4 分别与 SCR2 相互作用，且初步
显示其相互作用区域为 SRK 第 1 个外显子的第 16 ~ 421 bp 的片段和 SCR 第 1 876 ~ 2 068 bp 的片段。这
既为 SRK-SCR 相互作用提供了具体证据，也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。
关键词：甘蓝；SRK；eSRKs 基因；SCRs 基因；pGADT7 载体；pGBKT7 载体；酵母双杂交体系
中图分类号：S 635 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）08-1479-10
Studies on the Construction of S Domain of SRK and SCR Gene’s Yeast
Expression Vectors and Their Interaction in Yeast Two-hybrid System
PENG Yi-bo1，ZHU Li-quan1,*，YANG Hong1，XUE Li-yan1，LUO Bing1，WU Zhi-gang1，HUANG Dan1，
YANG Kun1，GAO Qi-guo2，LI Cheng-qiong2，REN Xue-song2，and WANG Xiao-jia2,*
（1College of Agronomy and Biotechnology，Southwestern University，Chongqing 400716，China；2Chongqing Key
Laboratory of Olericulture，Chongqing 400716，China）
Abstract：For further study on the interaction of SRK-SCR and between these two determinant
factors，Brassica oleracea with high self-incompatibility was used as research materials to construct a
group of pGADT7-eSRKs and pGBKT7-SCRs recombinant vectors that were subsequently transformed
accordingly into Y187 and Y2HGold yeast. The interaction between these two recombinant plasmids
transformed into the yeasts were tested by SD/-Ade-His-Trp-Leu fungal colony formation of plates，PCR
and x-α-gal color reactions. The results showed that there existed two kinds of interactions among all
interaction assays，which preliminary indicated that their interaction region span 16–421 bp fragment of
the first exon of SRK and 1 876–2 068 bp fragment of SCR. These results reconfirm the SRK-SCR
interaction，adding some insights into the mechanism of selt incompatibility in Brassica.
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Key words：Brassica oleracea；SRK；eSRKs gene；SCRs gene；pGADT7 vector；pGBKT7 vector；
yeast two-hybrid system
自交不亲和性（self-incompatibility，SI）在显花植物中普遍存在，是阻止自体受精，预防近亲
繁殖和保持遗传变异的一种重要机制。在包括甘蓝的芸薹属中，自体花粉的识别与拒绝发生在柱头
表面，自体花粉的花粉管生长在柱头表面受到抑制。因此，参与自交不亲和识别系统的 S 位点产物
应该在柱头中表达。S 位点糖蛋白（S-locus glycoprotein，SLG）和 S 受体激酶（S receptor kinase，
SRK）是 S 位点已经鉴定的两个紧密连锁的基因编码蛋白，它们均在柱头的乳突细胞中特异表达
（Nasrallah et al.，1987；Stein et al.，1991）。SRK 是一种跨膜的蛋白质激酶，具有蛋白质激酶的结
构和生化特征，包括胞外区域、跨膜区域和具丝氨酸/苏氨酸激酶活性的胞质区域 3 部分（Stein et al.，
1991）。SRK 的胞外区域（S 区域）与 SLG 具较高的同源性，并有较高的多态性。SRK 基因包含 7
个外显子，其中第 1 个外显子编码 S 区域。与 SLG 类似，SRK 于发育阶段在柱头中特异表达，且
表达水平与 SLG 密切相关（Stein et al.，1991；Glavin et al.，1994；Watanabe et al.，1994）。Takasaki
等（2000）的转基因试验结果表明 SRK 才是自交不亲和专一性的决定因子，而 SLG 仅是辅助因子。
SRK、SCR（S-locus cystein-rich protein，SCR）和 SLG 作为 3 个完全连锁的 S 基因，只占整个 S 位
点大小的 1% ~ 4%，它们协同进化为决定着甘蓝自交不亲和特异性的多种 S 单倍型（S-haplotype）。
所谓 S 单倍型，可以在功能上定义为其翻译产物能形成或促进 SRK-SCR 相互作用的这 3 个多态性 S
基因的特异组合。Sushma 等（2007）用酵母双杂交技术进一步表明，SRK 的 C–端激酶区可以同
源折叠，在无 SCR 时发生自发二聚化作用。因此，利用酵母双杂交技术来鉴定与 SRK 相互作用的
蛋白质是切实可行的。但是，该技术至今未用于鉴定 SRK 的 N–端 S 结构域与包括 SCR 在内的蛋
白质之间的相互作用。因此作者拟构建酵母双杂交重组载体，并应用酵母双杂交体系研究 SRK 的
N–端胞外 S 结构域与 SCR 的相互作用及初步检测其作用区域，以期能够确定 S 受体激酶的 SCR
识别模体，为进一步研究 SRK-SCR 相互作用和建立芸薹属自交不亲和性的新测定方法奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验主要于 2009 年 9 月至 2011 年 1 月在西南大学植物生理生化重庆市重点实验室完成。结
球甘蓝高度自交不亲和材料 B3（亲和指数系数为 0.08）由西南大学蔬菜学实验室提供。大肠杆菌
DH5α 为本实验室保存；酵母双杂交表达载体 pGBKT7、pGADT7，酵母菌种 Y2HGold、Y187 及酵
母培养试剂购自 Clontech 公司（MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual）。
限制性内切酶 EcoRⅠ、BamHⅠ，T4DNA 连接酶，DNA Marker 均购自上海生工生物工程公司；
pMDTM19-T Vector 克隆载体、DNA 重组所用各种限制性内切酶购自宝生物（大连）有限公司；DNA
回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。试验所用各种选择性培养基及 YPDA 培养基均购自
Clontech 公司。
1.2 方法
1.2.1 甘蓝 gDNA 的提取和 PCR 引物设计
取结球甘蓝 B3 的嫩叶片 5 g，放入研钵中，加液氮迅速研磨成粉末，用改良的 CTAB 法（朱利
泉和王小佳，2000）提取其 gDNA。
8 期 彭一波等：甘蓝 SRK 的 S 域及 SCR 酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究 1481
由上海生工生物工程公司合成 PCR 引物。引物（表 1）均以 GenBank 公布的甘蓝 S28-SRK（登
录号 AB190355）及 S28-SCR（登录号 AB190356）的基因组 DNA 为模板设计。eSRKs 和 SCRs 分
别引入了限制性内切酶 EcoRⅠ与 BamHⅠ的识别位点（黑体下划线处）以便于克隆；为了进一步便
于酶切并在 eSRKs 的酶切位点前分别另加了保护碱基（斜体字处）。
表 1 扩增 SRK 的 S 结构域和 SCR 的引物
Table 1 Primers used for amplification of the S domain of SRK and SCR
名称
Name
基因
Gene
引物序列（5′–3′）
Sequence
位置
Position
参考文献
Reference
F-GGAATTCCGAATTCCTCGTCTTCGTTGTCTTGATTC eSRK1 eSRK
R-CGGGATCCCGGGATCCTAACCAAGGTCAGCAGCAGCCA
1外显子
Exon 1
杨洋等，2009
F-GCCGGAATTCCGACGCAAGTGGATTCTTATGG eSRK2 eSRK
R-CGGGATCCCGGGATCCTAACCAAGGTCAGCAGCAGCCA
1外显子
Exon 1
本研究
This study
F-GGAATTCCGAATTCCTCGTCTTCGTTGTCTTGATTC eSRK3 eSRK
R-CGGGATCCCGGGATCCTCGGGATCAACGTCAGTCGCTG
1外显子
Exon 1
本研究
This study
F-GGAATTCCGAATTCCTCGTCTTCGTTGTCTTGATTC eSRK4 eSRK
R-CGGGATCCCGGGATCCCGTCGTTGTTATTGGAGTCTCG
1外显子
Exon 1
本研究
This study
F-GAATTCGTAGAAGCTTGCATCTGTAGCGAAT SCR SCR
R-GGATCCCTAGCAAATGTTTCGTTTAGCATGG
2 外显子
Exon 2
杨洋等，2009
F-GAATTCGTAGAAGCTTGCATCTGTAGCGAAT SCR1 SCR
R-GGATCCGTAAACGCAGAATCAGCTGTTGATG
2 外显子
Exon 2
本研究
This study
SCR2 SCR F-GAATTCGCGAATCGTTTGAGGGAGGATGTCT 2 外显子 本研究
R-GGATCCCTAGCAAATGTTTCGTTTAGCATGG Exon 2 This study
注：下划线处为识别位点。斜体字示保护碱基。
Note：Recognition site by underline. Protect base in italics.
1.2.2 PCR 扩增及产物鉴定
经反复试验获得 SCRs 基因和 eSRKs 基因的 PCR 程序：（A）SCRs 基因的 PCR 反应体系参照北
京全式金生物技术有限公司 PCR 试剂盒的规定。反应程序为：94 ℃ 4 min；循环中：94 ℃ 45 s，
58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s 共 30 个循环；72 ℃延伸 10 min。（B）eSRKs 基因的 PCR 反应体系：在 50 μL
反应体系中依次加入 5 μL 10 × PCR buffer（不含 mg2+）、4 μL dNTP（2.5 mmol · L-1）、上下游引物各
2 μL、模板 DNA 1 μL、Taq 酶（5 U · μL-1）1 μL、补 ddH2O 至 50 μL。反应程序为：94 ℃ 5 min；
循环中：94 ℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s 共 35 个循环；72 ℃延伸 10 min。取 10 μL PCR
产物进行 0.01 kg · L-1 琼脂糖凝胶电泳检测后，分别回收 eSRKs 与 SCRs 目的基因片段。
纯化的 PCR 产物与 pMD19-T 载体 16 ℃连接过夜，转化感受态 DH5α 菌，进行蓝白斑筛选。经
菌液 PCR 和酶切鉴定含插入目的片段的阳性克隆送华大基因公司测序。
1.2.3 钓饵载体 pGBKT7-SCRs 及表达载体 pGADT7-eSRKs 的构建与鉴定
参照试剂说明书，用 EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切 pMD19-T-SCRs、pMD19-T-eSRKs 和载体
pGBKT7、pGADT7。回收 SCRs 和 eSRKs 目的基因片段及 pGBKT7、pGADT7 载体片段。在 6 μL
连接反应体系中加入 2 μL 回收的目的基因片段和 1 μL 回收的质粒片段，按 1︰1 比例加入 T4 连接
酶 3 μL，16 ℃连接过夜。利用 CaCl2 法制备感受态细胞，将连接产物 6 μL 转化感受态 DH5α 中。
钓饵载体 pGBKT7-SCRs 涂布于含有卡那霉素（50 μg · mL-1）的 LB 平板培养基；表达载体 pGADT7-
eSRKs 铺于含氨苄青霉素（100 μg · mL-1）的 LB 平板上，37 ℃培养过夜。从平板中随机挑取单克
隆，分别接种于含卡那霉素和氨苄的 LB 液体培养基中，220 r · min-1 振荡过夜；提取质粒，并用 EcoR
Ⅰ与 BamHⅠ双酶切鉴定阳性克隆。
1.2.4 酵母感受态细胞的制备及转化
取出于–70 ℃冰箱保存的 Y2HGold 和 Y187 酵母菌株，分别划线于 YPDA 平板，于 30 ℃培养
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3 d；分别挑单菌落于 3 mL YPDA 液体培养基中。250 r · min-1，8 h，再转接 5 μL 于 50 mL YPDA 液
中振荡培养 16 h 至 OD600 达到 0.15 ~ 0.30，700 × g 常温离心 5 min，弃上清液于 100 mL YPDA 培养
液中孵育 3 h 至 OD600 达到 0.40 ~ 0.50；分装离心，用 30 mL 灭菌蒸馏水清洗，最后用 1.5 mL 1.1 ×
LiAc/TE 重悬沉淀，分装于 1.5 mL 离心管中，高速离心 15 s，600 μL 1.1 × LiAc/TE 重悬沉淀，用于
转化质粒 DNA。此感受态现用现制备。
利用 PEG/LiAc 转化法，向提前预冷的 1.5 mL 的离心管中分别加入已构建好的钓饵载体 pGBKT7-
SCRs和表达载体 pGBADT7-eSRKs 0.1 μg，同时设置阳性、阴性对照质粒，再分别加入 5 μL的Yeastmaker
carrier DNA，50 μL 酵母感受态细胞轻微混匀，再添加 500 μL 的 PEG/LiAc 混匀；30 ℃孵育 30 min，
添加 20 μL DMSO，42 ℃水浴 15 min，高速离心 15 s，于 1 mL YPD plus 培养液悬浮，再 30 ℃孵育
30 min；离心弃上清液，用 1 mL 0.9%的 NaCl 重悬沉淀，吸取钓饵载体 pGBKT7-SCRs 100 μL 铺于
SD/-Trp 筛选培养基上；吸取表达载体 pGBADT7-eSRKs 100 μL 铺于 SD/-Trp 筛选培养基上，于 30 ℃
培养 3 ~ 5 d。
1.2.5 钓饵蛋白毒性及其自激活检测
根据 Clontech 公司 MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual 体系操作说明，本
试验的毒性参考证据是导入带有目的片段载体的酵母菌与导入空载体的酵母菌所生长菌落的大小差
异作为依据。将质粒 pGBKT7-SCRs 和 pGBKT7 空载分别转化酵母菌 Y2HGold 感受态细胞，30 ℃
培养 3 ~ 5 d 后，分别涂布于 SD/-Trp，并同时把转化酵母 pGBKT7-SCRs 涂布在 SD/-Leu/x-α-gal、
SD/-Trp/x-α-gal/AbA 和 SD/-Leu-Trp 平板上，观察生长情况。同时设立 Y2HGold[pGBKT7-Lam] ×
Y187[pGADT7-T]（阴性对照）组和 Y2HGold[pGBKT7-p53] × Y187[pGADT7-T]（阳性对照）组。
1.2.6 酵母双杂交系统鉴定 eSRK 与 SCR 的相互作用
PCR 验证：分别在 SD/-Leu 和 SD/-Trp 固体培养基平板上挑取一个饱满的 pGADT7-eSRKs 和
pGBKT7-SCRs 菌斑，进行 PCR 扩增，经 0.01 kg · L-1 琼脂糖凝胶电泳检测载体含有目的片段。
转酵母质粒融合表达：分别挑取一个经 PCR 验证的 pGADT7-eSRKs 和 pGBKT7-SCRs 菌斑放
入同一个盛有 650 μL 2 × YPDA 液体培养液的 1.5 mL EP 管中孵育 18 ~ 20 h，然后取 10 μL 菌液铺
于载玻片上用美蓝染色后电子显微镜镜检。
SD 选择性培养基筛选：取镜检含有三叶草形状融合菌体的菌液 10 μL，用水稀释 100 倍后吸取
80 μL 均匀的铺于 SD/-Trp-Leu 筛选培养基上，倒置于 30 ℃培养箱中孵育 3 ~ 5 d，待菌斑长到直径
2 mm 时，挑选饱满的菌斑对其分别做 eSRKs 和 SCRs 菌落 PCR 验证；将 PCR 验证正确的单克隆子
再用接种环挑到盛有 650 μL SD/-Trp-Leu 液体培养基的 1.5 mL EP 管中孵育 18 ~ 20 h；最后取 10 μL
用水稀释 100 倍，吸取 80 μL 均匀平铺于 SD/-Ade-His-Trp-Leu/AbA 筛选培养基上，倒置于 30 ℃培
养箱中孵育 5 ~ 7 d，等菌斑长到直径 2 mm 时，在无菌操作工作台上每个菌斑点 1 μL x-α-gal，菌斑
在 8 h 内观察其颜色变化。
2 结果与分析
2.1 SCRs 和 eSRKs 基因的克隆及序列分析
以 GenBank 公布的甘蓝 S28-SRK 基因组 DNA 为模板，再结合 SRK 胞外 S 结构域氨基酸序列
含有 3 个超多变区（HV1、HV2 和 HV3）（Kusaba et al.，1997），SCR 含有 1 个高变区及测序结果
来设计引物（表 1）：eSRK1（1 265 bp）包含 3 个超多变区，eSRK2（864 bp）包含 HV2 和 HV3 两
个超多变区，eSRK3（804 bp）包含 HV1 和 HV2 两个超多变区，eSRK4（405 bp）包含 HV1 一个
8 期 彭一波等：甘蓝 SRK 的 S 域及 SCR 酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究 1483
超多变区；SCR（211 bp）：含 SCR 的 1 个高变区，SCR1（174 bp）不含 SCR 高变区，SCR2（192 bp）
含 SCR 的 1 个高变区。经过反复试验和优化 PCR 反应，从图 1 可知 eSRKs 及 SCRs 的 PCR 扩增产
物经 0.01 kg · L-1 琼脂糖凝胶电泳显示 eSRK1、eSRK2、eSRK3、eSRK4（图 1，A）及 SCR、SCR1、
SCR2（图 1，B）的各泳道目的条带位置正确。eSRK1 基因回收测序获得 1 265 bp 的目的片段，重
复测序及序列分析表明，所扩增的 eSRK1 基因氨基酸序列与登录在 GenBank 中的 AB190355 的氨基
酸序列有一个氨基酸发生突变（图 2 中箭头所示）。而 SCR 基因回收测序获得 211 bp 的目的片段。
序列分析表明，所扩增的 SCR 基因序列与登录在 GenBank 中的 AB190356 的序列完全一致。
图 1 eSRKs 基因（A）和 SCRs 基因（B）PCR 电泳图
Fig. 1 Anlysis the PCR production of eSRKs（A）and SCRs（B）
图 2 eSRK1 氨基酸序列比对
Fig. 2 Alignment of eSRK1 amino acid sequence
2.2 重组质粒 pGBKT7-SCRs 及 pGADT7-eSRKs 的构建及酶切鉴定
如图 3，A 所示，酵母表达载体 pGADT7 的序列全长为 8.0 kb，EcoRⅠ和 BamHⅠ两个酶切位
点相距 22 bp；如图 3，B 所示，酵母钓饵载体 pGBKT7 的序列全长 7.3 kb，EcoRⅠ和 BamHⅠ两个
酶切位点相距 4 bp，所以经 EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切后 AD 和 BD 载体片段大小变化不大。经 0.01
kg · L-1 琼脂糖凝胶电泳检测得到 pGADT7-eSRK1、pGADT7-eSRK2、pGADT7-eSRK3 和 pGADT7-
eSRK4 双酶切（图 4，A）及 pGBKT7-SCR、pGBKT7-SCR1 和 pGBKT7-SCR2 双酶切（图 4，B）
与 eSRK1、eSRK2、eSRK3、eSRK4、SCR、SCR1、SCR2 大小一致的片段，表明各目的片段已插
入酵母载体。
再将酵母载体质粒 pGADT7、pGBKT7 及 eSRKs 和 SCRs 基因同时经 EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切
后，用 T4 连接酶连接并转化感受态 DH5α 中扩大培养，提取质粒 pGADT7-eSRKs 和 pGBKT7-SCRs
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送上海英骏生物技术有限公司测序，其结果在 GenBank 中进行 BLAST 分析，显示重组质粒分别含
目的基因片段，且读码框正确，无碱基错配和移码突变。再次经 0.01 kg · L-1 琼脂糖凝胶电泳检测
eSRKs 序列插入酵母载体 pGADT7 和 SCRs 序列插入酵母载体 pGBKT7 位置正确。结果表明甘蓝
SRK 的胞外域真核表达载体 pGADT7-eSRKs 及钓饵载体 pGBKT7-SCRs 的构建成功。
图 3 重组体 pGADT7-eSRK（A）和 pGBKT7-SCR（B）的遗传结构图
Fig. 3 Analysis of recombinant pGADT7-eSRK（A）and pGBKT7-SCR（B）genetic structure
图 4 pGADT7-eSRK（A）和 pGBKT7-SCR（B）双酶切鉴定结果图
Fig. 4 Identification of pGADT7-eSRK（A）and pGBKT7-SCR（B）
A：M1. 2 000 bp DNA marker；1. pGADT7-eSRK1；2. pGADT7-eSRK2；3. pGADT7-eSRK3；4. pGADT7-eSRK4；
5. pGADT7；6. DNA pGADT7；M2. DNA marker DL8000.
B：1. DNA marker plus II 2k；2. DNA pGBKT7；3. pGBKT7-SCR；4. pGBKT7-SCR1；5. pGBKT7-SCR2.
2.3 质粒 pGBKT7-SCRs 钓饵蛋白毒性及其自激活检测分析
将质粒 pGBKT7-SCRs 和 pGBKT7 分别转化酵母菌 Y2HGold，30 ℃培养 3 d 后，转化酵母在
SD/-Trp 平板上都长出菌落（图 5），菌落 PCR 也能扩增出相应的目的条带（未附图），说明质粒转
化酵母成功。同时如图 5 可知：转化酵母（pGBKT7-SCRs）菌斑大小与转化酵母（pGBKT7）菌斑
大小相当，表明融合蛋白对酵母 Y2HGold 生长没有毒害。如图 6 所示，转化酵母 pGBKT7-SCRs 在
SD/-Trp 和 SD/-Trp/x-α-gal 平板上都能长出菌落。虽然在 SD/-Trp/x-α-gal 平板上菌落呈淡蓝色，但
在 SD/-Leu-Trp/x-α-gal/AbA、SD/-Leu-Trp 上均不能生长。阳性对照酵母（pGBKT7-53 × pGADT7-T）
在 SD/-Leu-Trp 和 SD/-Leu-Trp/x-α-gal/AbA 板上皆有菌落生长，并且后者的菌落呈蓝色（图 7）。而
阴性对照酵母（pGBKT7-Lam × pGADT7-T）只在 SD/-Leu-Trp 固体培养基平板上生长，在
SD/-Leu-Trp/x-α-gal/AbA 固体培养基平板上未能生长（图 6）。这说明 SCRs 蛋白不能自激活 AUR1-C
等报告基因，无自身转录激活活性（图 6，图 7）。
8 期 彭一波等：甘蓝 SRK 的 S 域及 SCR 酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究 1485
2.4 融合表达分析
分别在SD/-Leu和SD/-Trp固体培养基平板上随机挑取饱满的pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs
菌斑，进行 PCR 扩增后，经 0.01 kg · L-1 琼脂糖凝胶电泳检测确定其目的片段插入到载体中。经 PCR
验证的 pGADT7-eSRKs 和 pGBKT7-SCRs 菌斑在 2 × YPDA 培养液孵育后相互融合后，将会出现三
叶草形状的结构，如图 8 中箭头所示。其三叶草结构表示两个单倍体双亲细胞和酵母二倍体芽殖细
胞的结合体的形状。从图 8中可知转酵母质粒 pGADT7-eSRK1和 pGBKT7-SCR2及pGADT7-eSRK4
和 pGBKT7-SCR2 融合表达良好，其它的转酵母质粒除 eSRK3-SCR、eSRK3-SCR1、eSRK3-SCR2
外融合后通过镜检也均发现三叶草形状（未附图）表示融合表达良好。
图 8 融合酵母镜检图
Fig. 8 Protein microscopy of the transformed yeast strain
图 6 转质粒 pGBKT7-SCRs 酵母的自激活检测
Fig. 6 Autoactivation assay of the yeast strain by recombinant
pGBKT7-SCRs on SD/-Trp plate plasmid pGBKT7-SCRs
1. SD/-Trp；2. SD/-Trp/x-α-gal；3. SD/-Trp/x-α-gal/AbA；4. SD/-Trp-Leu.
图 5 质粒 pGBKT7-SCRs 对酵母 Y2HGold 的毒性检测
Fig. 5 Yeast cytotoxicity assays of the plasmid
1. pGBKT7-SCRs；2. pGBKT7.
图 7 转质粒酵母 pGBKT7-SCRs 的自激活检测
Fig. 7 Autoactivation results of the transformed yeast strain
A. pGBKT7-Lam × pGADT7-T；B. pGBKT7-53 × pGADT7-T；C. pGBKT7-SCRs.
1，3 and 5. SD/-Trp-Leu；2 and 4. SD/-Trp-Leu/x-α-gal/AbA.
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2.5 相互作用区段分析
将已知蛋白质的基因构建在钓饵载体上，而将 cDNA 文库的基因连接到表达载体上，同时将上
述两种载体转化改造后的酵母 Y187 和 Y2HGold。这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生
GAL4，又不能合成 Leu、Trp、His、Ade，因此，酵母在相对应的缺陷性培养基上无法正常生长。
当 pGBKT7-SCRs 和 pGADT7-eSRKs 两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式
作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因 His、Ade、Mel1，从而通过功能互补和 x-α-gal 显色反
应筛选到阳性菌落。当筛选的阳性菌落变蓝色，则表示两种蛋白能够相互作用（图 9）。如表 2 所示：
编号 1 ~ 6 和 10 ~ 12 的 eSRK1-SCR、eSRK1-SCR1、eSRK1-SCR2、eSRK2-SCR、eSRK2-SCR1、
eSRK2-SCR2、eSRK4-SCR、eSRK4-SCR1、eSRK4-SCR2 均能在 SD/-Trp-Leu 固体培养基平板上生
长，编号 7 ~ 9 的 eSRK3-SCR、eSRK3-SCR1、eSRK3-SCR2 在 SD/-Trp-Leu 固体培养基平板上却未
能生长。于 1 ~ 6 和 10 ~ 12 的 SD/-Trp-Leu 固体培养基平板上挑取分别经过菌落 PCR 验证的单克隆
菌落，经 SD/-Trp-Leu 液体培养基孵育后转涂到 SD/-Ade-His-Trp-Leu/AbA 固体培养基平板上，只有
eSRK1-SCR2 和 eSRK4-SCR2 有菌落长出，其它均未能出现菌斑。最后在 eSRK1-SCR2 和
eSRK4-SCR2 的 SD/-Ade-His-Trp-Leu/AbA 固体培养基平板上的每个菌落点加 1 μL x-α-gal，菌落在
4 h 内均变蓝色；做进一步验证，把显蓝色的阳性菌斑划线于 SD/-Ade-His-Trp-Leu/x-α-gal/AbA 平板
上，仍显蓝色（图 9）。由以上试验结果可知 eSRK1 和 SCR2 及 eSRK4 和 SCR2 相互作用，而 eSRK1
包含 SRK 的 S 域全长且包含 eSRK4，eSRK4 位于 SRK 的 S 域的第 16 ~ 421 bp 的片段处；SCR2 位
于 SCR 的第 1 876 ~ 2 068 bp 的片段处，因此可知 SRK 的 S 域与 SCR 相互作用且相互作用的区域
可能是 SRK 胞外域的第 16 ~ 421 bp 的片段和 SCR 的第 1 876 ~ 2 068 bp 的片段。
表 2 酵母中 eSRK 和 SCR 之间相互作用分析
Table 2 Analysis of the interactions between eSRK and SCR in yeast
编号
Number
酵母质粒
Yeast plasmid
选择培养基
Selective agar plate
菌斑
Colony
颜色
Color
SD/-Leu-Trp 有 Yes 白色 White 1 eSRK1-SCR
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 无 No 无 No
SD/-Leu-Trp 有 Yes 白色 White 2 eSRK1-SCR1
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 无 No 无 No
SD/-Leu-Trp 有 Yes 百色 White
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 有 Yes 白色 White
3 eSRK1-SCR2
SD/-Ade-His-Leu-Trp/x-α-gal/AbA 有 Yes 蓝色 Blue
SD/-Leu-Trp 有 Yes 白色 White 4 eSRK2-SCR
SD/-Ade-His-Leu-Trp/Aba 无 No 无 No
SD/-Leu-Trp 有 Yes 白色 White 5 eSRK2-SCR1
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 无 No 无 No
SD/-Leu-Trp 有 Yes 白色 White 6 eSRK2-SCR2
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 无 No 无 No
SD/-Leu-Trp 无 No 无 No 7 eSRK3-SCR
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 无 No 无 No
SD/-Leu-Trp 无 No 无 No 8 eSRK3-SCR1
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 无 No 无 No
SD/-Leu-Trp 无 No 无 No 9 eSRK3-SCR2
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 无 No 无 No
SD/-Leu-Trp 有 Yes 白色 White 10 eSRK4-SCR
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 无 No 无 No
SD/-Leu-Trp 有 Yes 白色 White 11 eSRK4-SCR1
SD/-Ade-His-Leu-Trp/AbA 无 No 无 No
12 eSRK4-SCR2 SD/-Leu-Trp 有 Yes 白色 White
SD/-Ade-His-Leu-Trp/Aba 有 Yes 白色 White
SD/-Ade-His-Leu-Trp/x-α-gal/AbA 有 Yes 蓝色 Blue
8 期 彭一波等：甘蓝 SRK 的 S 域及 SCR 酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究 1487
图 9 酵母中 eSRK 和 SCR 之间相互作用分析
Fig. 9 Analysis of the interactions between eSRK and SCR in yeast on the SD/-Ade-His-Leu-Trp/x-α-gal/AbA plate
1. SD/-Ade-His-Trp-Leu/x-α-gal/AbA SRK1-SCR2；2. SD/-Ade-His-Trp-Leu/x-α-gal/AbA SRK4-SCR2.
3 讨论
目前的研究普遍认为 SRK 的胞外域是与 SCR 相互作用的区域，Kachroo 等（2001）通过对 SRK
和 SCR 标记的内源蛋白 eSRK6-FLAG 和 SCR6-myc-His6 相互作用的研究，展示了 SCR 是特异性地
与同类 S 型 SRK 的胞外域相结合。Shimosato 等（2007）也证明 SP11 与同型 SRK 高度亲和，并且
SP11 与 SRK 结合后会导致 SRK 自磷酸化，从而引发下游信号传导。本试验结果显示 eSRK1 的氨
基酸序列与 NCBI 中公布的 S28 氨基酸序列只有一个氨基酸发生突变（图 2），而 SCR 与 NCBI 中公
布的 S28 序列完全一致。说明本试验扩增得到的 eSRK1 和 SCR 是同一 S 单倍型。分别把 eSRKs 及
SCRs 做 TA 克隆，提取质粒后双酶切与同样双酶切的酵母载体 pGADT7 和 pGBKT 连接构建酵母表
达载体和钓饵载体。重组载体经测序和 PCR 以及双酶切鉴定（图 4）表明插入目的片段正确，说明
酵母重组载体构建成功。以上结果说明，本试验获得的 eSRKs 的不同 pGADT7 表达载体和 SCRs
的不同 pGBKT7 钓饵载体可以作为研究 eSRK 与 SCR 之间相互识别的材料。
从采用 Clontech 公司的酵母双杂交体系的试验结果中可知，证明 B3 材料的 SCR 和 GAL4 报告
基因 DNA 结合域的融合蛋白（pGBKT7-SCR，钓饵载体）没有表现自激活现象且没有毒性（图 5 ~
图 7）。将试验组二倍体酵母 1 ~ 12 分别涂在 SD/-Leu-Trp 平板上后，除 7 ~ 9 外均能长出白色菌落
（表 2）且镜检有三叶草型结构（图 8）；再将它们分别转接种在 SD/-Ade-His-Trp-Leu/AbA 平板上
后，只有二倍体酵母 3 和 12 能长出菌落，且点加 x-α-gal 后在规定时间内菌落呈蓝色；进一步验证，
把 3 和 12 的阳性单克隆菌落划板在 SD/-Ade-His-Leu-Trp/x-α-gal/AbA 平板上，有菌落长出，且菌落
呈蓝色（表 2，图 9）。这些结果充分说明在二倍体酵母组合中，只有 pGADT7-eSRK1 与 pGBKT7-SCR2
之间以及 pGBKT7-eSRK4 与 pGADT7-SCR2 之间表现出相互作用，而其它二倍体酵母组合均没表
现相互作用。同时也说明在酵母双杂交体系中 eSRK 与同单倍型的 SCR 之间的 Km 可能较低。
目前的研究一般认为，THL 同柱头上的 SRK 胞质区激酶结构域可逆结合，使 SRK 的激酶活性
不能发生，自交不亲和反应信号传导途径的启动受阻；当花粉粒落在柱头乳突细胞表面时，SCR 等
花粉胞被蛋白在花粉和柱头之间形成接触层，如果 SCR 与 SRK 的单倍型一致，那么 SCR 即与 SRK
胞外 S 结构域结合，结合造成的构象变化通过跨膜结构域而传递到激酶结构域，使其释放出原本结
合在此处的 THL，从而激活 SRK 的胞内丝氨酸/苏氨酸激酶活性，SRK 下游蛋白 ARC1 等被磷酸化，
然后在乳突细胞内发生级联生物化学反应，最终导致水孔蛋白关闭（Goring & walker，2004），使柱
1488 园 艺 学 报 38 卷
头上的水不能进入干燥的花粉，致使花粉缺水而不能萌发（Nasrallah，2000）。因此，在体内 SRK
与 SCR、THL 之间的相互作用可能是调控自交不亲和反应的关键靶位，SCR 在 SRK 的 N–端的结
合将使 SRK 的 C–端已经结合的 THL 解聚，SRK-SCR 的聚合或解聚将直接起到加强或减弱自交不
亲和性的分子开关作用。本试验与杨洋等（2009）的体外表达试验不同，是采用在酵母细胞体内表
达的方式验证 SRK 与 SCR 相互作用。试验结果表明利用酵母双杂交系统研究 SRK 和 SCR 之间相
互作用的体系已建立，并初步确定其相互作用的区域，这为进一步研究二者相互作用位点奠定了基
础。
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