全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1203 - 1208
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 03 - 03; 修回日期 : 2009 - 07 - 03
基金项目 : 国家林业局 ‘948’项目 [ 2002208 (2) ]3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: dongleah@ yahoo1com1cn)
致谢 : 西南萱草为温放提供 , 特此致谢。
萱草部分野生种和栽培品种亲缘关系的 AFL P分析
黎海利 1, 2 , 董　丽 13
(1北京林业大学园林学院 , 国家花卉工程研究中心 , 北京 100083; 2湛江师范学院生命科学与技术学院 , 广东湛江
524048)
摘 　要 : 借助 AFLP标记对 35份萱草野生种和栽培品种进行亲缘关系研究 , 结果表明 , 7对引物组合
对萱草共扩增出条带 380条 , 其中多态性条带 357条 , 平均多态性达到 93139% , 单对引物扩增条带 19～
85条 , 平均每对引物组合扩增多态性条带 51条。7对引物扩增出的多态性条带均超过 9010%。种质资源相
似系数为 013822～019656, 平均相似系数为 017039。UPGMA聚类结果将供试材料分为 3类 , 即早花、中
花和晚花类 , 同一产地的品种基本能聚在一起。AFLP标记技术能较好地从分子水平揭示萱草种质资源的
亲缘关系。
关键词 : 萱草 ; 亲缘关系 ; AFLP标记
中图分类号 : S 68211 + 9　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0821203206
Rela tion sh ip of H em eroca llis spp . W ild Spec ies and Cultivars by AFL P
M arker
L I Hai2li1, 2 and DONG L i13
(1 College of Landscape A rch itecture, B eijing Forestry U niversity, China N ationa l Centre for Flow er Engineering Technique, B eijing
100083, China; 2 L ife Science and Technology School, Zhan jiang N orm al U niversity, Zhanjiang, Guangdong 524048, Ch ina)
Abstract: The genetic diversity and relationship of 35 accessions of daylilies in China was analyzed by
AFLP markers. Among the 380 polymorphic bands obtained from 7 selective p rimer pairs, 357 ( 93139% )
was polymorphic. The average number of DNA bands per p rimer pair was 51 with a range of 19 - 85. The
polymorphic rates of per p rimer pair were beyond 9010%. The average genetic sim ilarity among all 35 acces2
sions evaluated was 017039 and ranged from 013822 to 019656. Based on the UPGMA dendrogram, all the
materials could be divided into three types: Early2bloom ing type, m id2bloom ing type, late2bloom ing type.
Cultivars originated from the same country could be clustered together in the AFLP dendrogram. The results
showed that AFLP app roach was efficient in generating more accurate information on the genetic diversity and
relationship of daylily germp lasm s.
Key words: Hem eroca llis; genetic diversity; relationship; AFLP marker
萱草 (Hem eroca llis sp. ) 花色艳丽 , 适应性强 , 管理粗放 , 适合各种形式的园林应用。我国有丰
富的萱草资源 , 全世界萱草属植物约 15～18种 , 分布于中欧至东亚地区 (陈俊愉 , 2001) , 我国约
产 11种 , 占世界总种数的绝大部分。前人在萱草的植物分类学 (熊治廷 等 , 1996, 1997; Xiong &
Chen, 1998) 及遗传背景上 (李峰 等 , 1999; Tomkins et al. , 2001; 于晓英 等 , 2002; 洪亚辉 等 ,
2003; 朱云华 等 , 2007) 进行了研究。与欧美比较 , 我国对观赏萱草种质资源的开发利用远远不够。
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萱草易杂交 , 迄今国外已有 4万多个品种 (陈俊愉 , 2001) , 而我国因极度缺乏具有自主知识产权的
优良品种 , 目前园林应用的品种绝大多数引自国外。一方面 , 由于萱草野生种及目前引进的品种绝大
部分属橙黄色系 , 花色相近 , 花形相似 , 加上其他数量性状易受环境影响 , 因此表型相似品种的区分
非常困难 , 给生产和应用带来极大不便。另一方面 , 我国大部分萱草野生种都参与了萱草品种的培
育 , 长期以来品种间的反复杂交 , 导致大量品种遗传背景复杂 , 亲缘关系不清 , 给未来育种亲本的选
择带来极大不便。因此研究我国原产的野生资源与优良品种的亲缘关系十分必要。
AFLP标记能在遗传关系十分相近的材料中产生多态性 , 在待测样品较少的情况下 , 也能得到满
意的结果 (邹喻萍 等 , 2001)。其再现性和重复性好 , 适于品种指纹图谱的绘制、分子遗传连锁图谱
的构建、亲缘关系的研究 ( Evans et al. , 2002; Moja & Univ, 2002; Labra et al. , 2003; Raccuia et
al. , 2004; Noyer et al. , 2005; Ohara et al. , 2005; Goulao et al. , 2008)。作者采用 AFLP标记 , 初步
分析了参与萱草育种的重要亲本野生种 (张少艾和李洁 , 1995)、栽培种和栽培品种共 35份材料的
亲缘关系 , 旨在为萱草的品种分类研究、资源的收集、保存、创新和有效利用提供参考。
1　材料与方法
111　材料及其来源
试验于 2006年 6月至 2007年 12月进行。供试材料共 35份 (表 1) , 其中 1～26号来自北京林业
大学和北京植物园从国外引进的品种 , 栽植于北京植物园种苗繁育基地 ; 27～35号均来自中国 , 详
见表 1。上述材料均于生长期取叶片提取 DNA供后续研究。
表 1　萱草材料及来源
Table 1　Exper im en ta l ma ter ia ls and resources of H em eroca llis
代号
No.
品种 /种名
Cultivars/ Species
来源
Source
代号
No.
品种 /种名
Cultivars/Species
来源
Source
1 大胆欺骗 Daring Decep tion 荷兰 Holland 19 卡伍德 CutWood Bury 比利时 Belgium
2 北极雪 A rctic Snow 荷兰 Holland 20 康东 Gertrude Condon 比利时 Belgium
3 贝拉 Bela Lugesi 荷兰 Holland 21 秃玛丽 Mary Todd 比利时 Belgium
4 少女 L ittle Lassie 荷兰 Holland 22 小酒杯 L ittle W ine Cup 比利时 Belgium
5 婴儿 A ll American Baby 荷兰 Holland 23 摩洛哥红 Marocco Red 比利时 Belgium
6 巴菲娃 Buffy Doll 荷兰 Holland 24 红色海盗 Crim son Pirate 比利时 Belgium
7 大拇指 Siloam Tom Thumb 荷兰 Holland 25 走好运 Bonanza 比利时 Belgium
8 瑙碧 Chicago Knobby 荷兰 Holland 26 芝加哥之火 Chicago Fire 荷兰 Holland
9 莫娜 Mauna Loa 荷兰 Holland 27 萱草 Hem erocallis fulva 河南鸡公山 J igongMountain, Henan
10 四十二街 Forty Second Str 比利时 Belgium 28 西南萱草 H. forrestii 云南大理 Dali, Yunnan
11 红酒 Red Run 比利时 Belgium 29 大苞萱草 H. m iddendorffi 吉林玉皇山 Yuhuang Mountain, J ilin
12 紫泉 Purp le W aters 比利时 Belgium 30 大苞萱草 H. m iddendorffi 吉林红叶谷 Redleaf Valley, J ilin
13 莱恩大厦 Lynn Hall 比利时 Belgium 31 北黄花菜 H. lilioasphodelus 河北小五台 XiaowutaiMountain, Hebei
14 白玉 W hite Jade 比利时 Belgium 32 小黄花菜 H. m inor 北京百花山 Baihua Mountain, Beijing
15 哈兴 J F Hodskins 比利时 Belgium 33 黄花菜 H. citrina 河南鸡公山 J igongMountain, Henan
16 节日愉快 Holiday Delight 比利时 Belgium 34 黄花菜 H. citrina 中国科学院植物所 Institute of Botany,
17 秋日舞会 Autumn Masque 比利时 Belgium The Chinese Academy of Sciences
18 月光舞会 MoonlightMasque 比利时 Belgium 35 小萱草 H. dum otieri 中国科学院植物所 Institute of Botany,
The Chinese Academy of Sciences
112　研究方法
11211　DNA的提取及检测 　DNA的提取用天根公司植物基因组 DNA提取试剂盒 (DP305) , 按其标
注的方法进行。DNA的检测用 018%琼脂糖凝胶 , 电泳缓冲液 1 ×TAE, 上样量为 7μL, 电压 80 V ,
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1 h, 最后在 Gel Doc2000TM型凝胶成相系统上照相 , 用 Quantity One系统软件进行处理分析。
11212　扩增 　酶切连接体系为 20μL 反应体系 , 其中 ddH2 O 10185μL、DNA (200 ng·μL - 1 ) 410
μL、EcoRⅠ接头 (50μmol·L - 1 ) 110μL、M seⅠ接头 (5μmol·L - 1 ) 110μL、10 ×T4 buffer 210
μL、EcoRⅠ (20 U·μL - 1 ) 0125μL、M seⅠ (10 U·μL - 1 ) 015μL、 T4 lingase ( 3 U ·μL - 1 ) 014
μL。37 ℃恒温酶切连接 10 h。
预扩反应时 , 将酶切连接产物稀释 5倍用作预扩增模板。预扩反应体系 2010μL, 其中 ddH2 O
918μL、DNA 510μL、10 ×buffer 210μL、dNTP 116μL、E00 016μL、M 00 016μL、 TaqE 014μL。
预扩增程序 94 ℃变性 3 m in, 94 ℃变性 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃延伸 1 m in, 共 30个循环 , 最后 72 ℃
延伸 5 m in, 4 ℃保存。
选择性扩增。预扩增反应的产物稀释 10倍后用作选择性扩增反应的模板。反应体系 2010μL,
其中 ddH2 O 912μL、DNA 510μL、10 ×buffer 210μL、 dNTP 118μL、EcoRⅠ引物 (表 2) 018μL、
M seⅠ引物 (表 2) 018μL、TaqE 014μL。选扩程序 94 ℃变性 3 m in, 94 ℃变性 30 s, 65 ℃ 30 s (每
循环下降 017 ℃) , 72 ℃延伸 1 m in, 共 13个循环 , 94 ℃变性 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃延伸 1 m in, 共
30个循环 , 最后 72 ℃延伸 5 m in, 4 ℃保存。
11213　PCR产物检测 　取 6μL于 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电压 2 000 V, 恒定功率 100 W 015
h, 70 W电泳 115 h。
统计带型在相同片段位置上的谱带 , 有带计为 1, 无带计为 0, 建立数据矩阵。用 NTSYS2pc 211
分析软件 , 采用 UPGMA (Unweighted Pair Group Method A rithmetic Average) 法进行聚类分析。
2　结果与分析
211　D NA提取结果及检测
电泳检测结果表明基因组 DNA主带清晰完整 , 无弥散带。用紫外分光光度计对所提取的 DNA进
行检测 , OD260 /OD280值在 118左右 , 符合 AFLP技术要求。
212　AFL P扩增多态性
由表 2可见 , 7对引物组合对萱草扩增出条带 380条 , 其中多态性条带 357条 , 平均每对引物组
合扩增出条带 54129条 , 平均每对引物组合扩增出的多态性条带 51条 , 平均多态性达到 93139% ,
7对引物组合多态性均超过 90%。其中多态性最高的引物组合为 E2ACC & M 2CTT, 扩增多态性高
达 98104% , 其次为 E2ACC & M 2CAG和 E2ACC & M 2CAC, E2ACT & M 2CTT扩增多态性为 93133%
表 2　7对引物组合对萱草扩增的多态性
Table 2　The polym orph ic bands produced by d ifferen t pr im er com b ina tion s in daylilies
引物组合
Primer combination
总带数
Total number of bands
多态性带数
Total number of polymorphic bands
多态性 / %
Percent of polymorphic loci
E2ACC & M2CAC 90 85 94144
E2ACC & M2CAG 88 84 95145
E2ACC & M2CTT 51 50 98104
E2ACC & M2CAT 21 19 90148
E2ACT & M2CTT 30 28 93133
E2AAC & M2CAG 50 46 92100
E2AAC & M2CAT 50 45 90100
总计 Total 380 357 -
平均 Average 54129 51 93139
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(图 1) , 最低的为 E2AAC & M 2CAT。
213　聚类分析
通过计算样本间的相似系数 , 并以此建立矩
阵 , 萱草种质资源相似系数为 013822～019656,
平均相似系数为 017039。相似系数最大的为 13
与 17号 , 亲缘关系最近 ; 最小的为 24与 27号 ,
二者亲缘关系最远。
利用 NTSYS211软件 , 对 AFLP扩增条带进行
分析 , 获得遗传距离矩阵 , 利用非加权配对算术
平均法 (UPGMA ) 得到萱草种质聚类图 (图 2)。
图 1　引物 E2ACT & M 2CTT的扩增结果
F ig1 1　AFL P am plif ica tion products
using pr im er E2ACT & M 2CTT
图 2　萱草 AFL P聚类图
1～35种质代号同表 1。
F ig1 2　D endrogram of H em eroca llis by AFL P
The material No. 1 - 35 are showed in Table 1.
由图 2可见 , AFLP可较好的将供试材料分为 3类 , 第一类 1、3、5、2、7、8、35、27、29、32、
30, 此类包含的品种均为荷兰引进 , 野生种有萱草、玉皇山和红叶谷的大苞萱草、小黄花菜、小萱
草 ; 第二类 4、10、28、31、34、33、6、20、16、12、13、17、18、23、19、22、26、25、24, 此类
大部分为比利时引进的品种 , 包含的野生种为西南萱草、北黄花菜、黄花菜野生种和栽培种 ; 第三类
含 9、15、11、21、14, 大部分为比利时的品种 , 其中 9为荷兰引进品种。说明品种 1、2、3、5、7、
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8与野生种萱草、大苞萱草、小黄花菜、小萱草的亲缘关系较近 , 育种过程中可能有萱草、大苞萱
草、小黄花菜、小萱草的参与 ; 而品种 4、6、10、12、13、16、17、18、19、20、22、23、24、25、
26与野生种西南萱草、北黄花菜、黄花菜的亲缘关系较近 , 育种过程可能有这 3个野生种的参与 ;
其余品种聚为一类 , 说明它们可能是萱草属下其他种间的育种后代。
3　讨论
前人对萱草有过不少研究 , 大多集中在植物学 (熊治廷 等 , 1996, 1997; Xiong & Chen, 1998)
和野生种质资源的研究上。朱云华等 (2007) 对萱草野生种质资源的 ISSR2PCR研究认为 , 我国野生
种质资源具有丰富的遗传多样性。洪亚辉等 (2003) 用 RAPD分子标记对黄花菜和种下部分品种进
行研究 , 为选出高产的食用黄花菜奠定基础。李峰等 (1999) 用 RAPD对不同生境的 3个北黄花菜
野生居群进行遗传多样性分析 , 结果表明 , 野生居群的遗传多样性主要集中于居群内部 , 居群的遗传
多样性与生境具有相关性 , 居群间的遗传关系与其地理分布具有一定的相关性。于晓英等 ( 2002)
构建了 5个萱草材料的 AFLP指纹图谱。Tomkins等 (2001) 用 AFLP法从园艺学角度对萱草进行遗
传背景的分析 , 揭示了萱草随着育种进程的加快 , 品种间的相似性也逐渐增大。本研究用 7对引物对
萱草种质进行扩增 , 得到丰富的多样性条带 , 而且重复结果相同 , 表明本试验得到的萱草种质的指纹
图谱非常稳定 , 可作为萱草品种亲缘关系和品种鉴定的有效手段。其中用任何一对高效引物就可以区
分遗传上非常接近的品种 , 这些品种可能都具有相同或相似的亲本 , 亲缘关系很近 , 常规方法难以区
分 , AFLP对品种指纹图谱的绘制 , 可为萱草品种的鉴定提供分子依据。
从遗传多样性看 , 本研究用 7对引物对萱草进行扩增 , 共获条带 380条 , 多态性达 9314% , 高
于 Tomkins等 (2001) 和于晓英等 (2002) 的研究结果 , 这种差异可能是由于使用的材料不同所致 ,
本研究使用的野生种均为野外采集 , 遗传基础较广 , 这可能是获得条带多态性较高的原因之一。
本研究的遗传相似系数 013822～019656, 平均值 017039, 低于 Tomkins等 (2001) 的研究结果 ,
可见萱草种质之间的遗传相似系数跨度较大 , 最高已接近 0197, Tomkins等 (2001) 的研究结果表明
了随着萱草遗传育种的进程的加快 , 品种间的相似系数在不断增加 , 因此 , 要想使萱草育种有进一步
的突破 , 必须引进新的野生种基因。
从地理相似性看 , 不同地域引进的品种基本可以聚到一起 , 引自同一国家的品种具有较近的亲缘
关系 , 说明萱草品种的亲缘关系与来源相关 , 这与孔秋生等 (2005) 的研究结果一致。
从野生种和栽培品种的关系看 , 第一类包含的品种与大苞萱草、小黄花菜、小萱草、萱草等有较
近的亲缘关系 , 从物候上看 , 此类品种的花期最早 , 可归于早花型品种 , 其中最早开花的为小萱草及
大苞萱草 , 5月中旬已进入盛花期 ; 第二类包含的品种与野生种西南萱草、北黄花菜、黄花菜有较近
的亲缘关系 , 此类萱草的盛花期通常为 6月中旬至 6月底 , 可归结为中花型品种 ; 第三类包含的品种
大部分来自于比利时 , 其中 9号为荷兰引进品种 , 此类品种盛花期相对前两类晚 , 盛花期均为 7月初
至 7月中旬 , 归类为晚花型品种。AFLP分子标记反映出了萱草野生种和栽培品种的亲缘关系与物候
有一定的相关性 , 在目前的园林应用中 , 大多数萱草为中花型的品种 , 本研究结果为培育特早花、特
晚花或四季开花的萱草新品种提供了理论参考。
本研究引入野生种与栽培品种联合进行亲缘关系分析 , 实际应用中可以指导亲本选配 , 选择亲缘
关系较远的材料 , 增加后代的遗传和变异 , 选育出杂种优势更强 , 综合性状更好的萱草新品种。因此
本研究结果对萱草的进一步育种具有直接的理论指导和借鉴意义。
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