全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（12）：2273–2280 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–07–17；修回日期：2011–12–05
基金项目：‘十二五’国家科技支撑计划项目（2011BAD12B02）；山东省现代农业产业技术体系、水果创新团队专项
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：dsgao@sdau.edu.cn）
桃花芽休眠解除 SSH 文库构建及相关基因表达
分析
李 玲，王 慧，谭 钺，王 宇，陈修德，李冬梅，高东升*
（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）
摘 要：为了深入研究桃花芽休眠的分子机制，利用抑制差减杂交技术（SSH），以解除休眠期的花
芽的 RNA 为实验方 Tester，以休眠期花芽的 RNA 为驱动方 Driver，构建休眠解除 cDNA 文库，测定分析
了 180 个上调表达的 cDNA 片段，测序成功 128 个，除去冗余序列，得到 28 个单一序列。对序列进行
BLAST 比对及功能注释，发现这些序列分别属于新陈代谢、氧化还原、信号转导、抗性相关等类别基因。
运用 qRT-PCR 技术对 HisH3、Dhn 和 Metallothionein 基因进行检测，结果表明它们在花芽休眠解除过程
中均上调表达。
关键词：桃；花芽；休眠；抑制差减杂交；基因表达；qRT-PCR
中图分类号：S 662.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）12-2273-08

Construction of the Suppression Subtractive Hybridization Library and
Analysis of Related Genes of Floral Buds in Prunus persica During
Dormancy-releasing
LI Ling，WANG Hui，TAN Yue，WANG Yu，CHEN Xiu-de，LI Dong-mei，and GAO Dong-sheng*
（College of Horticulture Science and Engineering，State Key Laboratory of Crop Biology，Shandong Agricultural
University，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：To better understand the molecular and physiological mechanisms of seasonal bud
dormancy in perennial trees，the differentially expressed genes in peach[Prunus persica（L.）Batsch]floral
buds during dormancy-releasing were identified by suppression subtractive hybridization（SSH）. One
hundred and eighty positive clones were selected and sequenced from the libraries totally，and 28 unique
genes were obtained. According to the BLAST screening and functional annotation，metabolism，oxidation
reduction，signal transduction and defense-related genes were identified with high frequencies in fertility
cDNA library. In SSH library three representative genes，HisH3，Dhn and Metallothionein were selected
and analyzed qRT-PCR. The results showed that they were up-regulated during dormancy-releasing of
floral buds.
Key words：peach；floral bud；dormancy；suppression subtractive hybridization（SSH）；gene
expression；qRT-PCR


2274 园 艺 学 报 38 卷
果树进入秋冬季节进行休眠，是对低温环境的一种适应。国内外科研工作者对休眠的生理和分
子机制进行了一定的研究。Pacey-Miller 等（2003）、Tattershall 等（2007）和 Mathiason 等（2009）
对葡萄休眠的研究发现氧化胁迫、钙信号及碳水化合物代谢在休眠解除过程中起重要作用。Horvath
等（2003）对大戟草（Euphorbia esula）地下芽研究后发现休眠与细胞周期调控密切相关，HisH3
作为细胞周期中 S 期表达的一个标记基因参与休眠进程。
关于桃树（Prunus persica）休眠的研究大多集中于非休眠突变体，从该突变体中鉴定出 6 个与
休眠相关的 MAD-BOX 基因 DAM1 ~ 6。DAM1、DAM2 和 DAM4 被认为是调控季节性停长和顶芽形
成的候选基因（Li et al.，2009）。近期的研究显示，DAM5 和 DAM6 主要在冬季表达，与需冷量和
开花日期有关（Fan et al.，2009）。然而植物芽休眠的解除是个复杂的过程，涉及到新陈代谢，激素
调控，营养物质合成及转运，细胞信号转导，细胞分裂及分化等多个方面，是多基因共同作用的结
果，多基因的差异表达是导致这些变化的根本原因。
抑制性差减杂交（SSH）技术具有假阳性率低，整个过程所需时间短（仅 3 ~ 4 d）等优点，一
次可分离得到多个基因，特别适合于分离发育阶段转型前后，以及受环境因子影响较大的差异表达
基因。因此，作者采用 SSH 技术以‘曙光油桃’休眠期及解除休眠期的花芽为材料，构建桃花芽休
眠解除 cDNA 文库，并对部分差异基因进行表达分析。获得这些基因可从整体水平上揭示花芽自然
休眠解除的分子机理。
1 材料与方法
1.1 材料与休眠进程的确定
试验所用品种‘曙光油桃’（10 年生）花芽采自山东省泰安市群星园艺场。
2008 年 9 月开始至 2009 年 2 月，每 10 d 从田间取健壮枝梢一次，放入光照培养箱进行水培。
温度：昼/夜 25 ℃/15 ℃；光强：300 μmol · m-2 · s-1；光周期：16 h 光/8 h 黑暗。每 2 d 更换 1 次水，
且将枝条基部剪掉 1 cm。根据第 1 芽萌发所需的天数及水培 20 d 后芽萌发情况，确定休眠及解除休
眠的时间。调查 10 个枝条的萌芽率，枝条有 50%芽体萌发视为休眠解除（Yooyongwech et al.，2009）。
1.2 cDNA 消减文库构建
将进入休眠期和解除休眠期的花芽在液氮中速冻后，放入–80 ℃超低温冰箱备用，用于提取
RNA 以构建差减 cDNA 文库。
总 RNA 提取采用 CTAB 法；mRNA 分离纯化采用 Invitrogen mRNA 分离试剂盒提供的方法。
依照 PCR-Select cDNA Subtraction Kit（Clontech）的说明书进行 SSH 操作。
以解除休眠的花芽 RNA 为实验方 Tester，休眠芽的 RNA 为驱动方 Driver，构建休眠解除特异
表达基因的 cDNA 文库。将分离纯化后的 mRNA 样品逆转录成 cDNA，纯化 Tester 和 Driver cDNA，
然后用 RsaⅠ酶切，将酶切后的实验方 cDNA 一分为二，分别连接不同的接头（接头 1 和接头 2R
由试剂盒自带）。
连接反应结束后将实验方 cDNA 与过量驱动方 cDNA 进行两轮分子杂交。杂交产物稀释后，接
着进行两轮特异 PCR。SSH 产物经过纯化和浓缩与 PMD18-T Vector（TaKaRa 公司，大连）载体连
接，形成质粒文库。连接产物转化感受态细胞 DH5α，涂于含有 Amp/X2gal/IPTG 的 LB 培养基上，
进行蓝白斑筛选，构建 SSH 文库。
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1.3 PCR 鉴定候选基因片段
从构建的文库中随机挑取部分克隆用含 50 ng · mL-1 氨苄青霉素的 LB 培养，37 ℃过夜。PCR
验证每个克隆中的插入片段。每个过夜培养的菌液用试剂盒中的 nested primer 1 和 nested primer 2R
来验证。PCR 产物（8 μL）用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 上调表达的 cDNA 阳性克隆的筛选
参照试剂盒 PCR-Select Differential Screening kit（BD-Biosciences-Clontech，Palo Alto，CA）的
方法进行点杂交筛选上调表达的基因。将正反向杂交后的 PCR 产物标记成探针，并于 72 ℃杂交过
夜，最后洗膜显色筛选阳性克隆。
1.5 序列测定和 BLAST 分析
挑取筛选的阳性克隆送青岛华大生物工程公司进行测序。所获序列去除载体和接头序列，获得
EST。采用 NCBI（http：//www. ncbi. nih. Gov）的 BLASTx 在线序列比对工具及 TAIR 蛋白数据库
（http：//www. arabidopsis.org/ Blast/index. jsp）进行 BLAST 分析。
1.6 qRT-PCR 分析
根据桃花芽休眠进程确定结果，从自然休眠期开始至休眠解除期间（2009 年 11 月至 2010 年 2
月）分别于 11 月 24 日、12 月 9 日、12 月 24 日、1 月 15 日取桃花芽，置于液氮中速冻，然后保存于
–80 ℃备用。提取 RNA，然后用 DNaseⅠ处理 RNA 去除 DNA 污染，使用反转录试剂盒（TaKaRa
公司）进行反转录。取适量的反转录产物进行 RT-PCR，以 β-actin 为内参，研究差异基因的表达模
式。
从已构建的差减文库中选取有差异表达的基因 HisH3、Dhn 和 Metallothionein 进行荧光定量表
达。荧光定量分析仪为 Icycler IQ（Bio-Rad），荧光染料为 SYBR-Green，荧光定量引物见表 1。每
个基因每个处理 3 次重复。
反应条件为 95 ℃ 180 s，95 ℃ 30 s，40 个循环，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。最后得到溶解曲线，
用 2%琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测，缓冲液为 1 × TAE。

表 1 RT-PCR所用引物
Table 1 Primers used for quantitative RT-PCR analysis
基因 Gene 前端引物（5′–3′）Forward 后端引物（5′–3′）Reverse
HisH3 AGGAGTCAAGAAGCCCCACA TGGGCAATTTCACGAACAAG
Dehydrin（Dhn） AGGGCTCGACGATATCAGTCC TGCATACGGGTCAAATGCAGG
Metallothionein TCCACCAATCAACAAACACCTCAC TAGCAAGTAATCTATGCGTGTGTGG
β-actin GTTATTCTTCATCGGCGTCTTCG CTTCACCATTCCAGTTCCATTGTC
2 结果与分析
2.1 休眠进程的确定
通过对一年生枝梢定期培养，发现休眠诱导期桃花芽萌发所需天数随着采样时间的推迟而增
加。9 月 7 日前采集的枝条的花芽皆能在 10 d 内萌发，表明桃花芽仍处于生长状态。之后所采集的
枝梢花芽萌发所需时间逐渐增加，均超过 10 d，表明桃花芽开始由生长状态转入休眠状态，进入休
眠诱导期。10—11 月上旬萌芽所需时间迅速增加，但在培养期内仍可萌发，表明桃花芽休眠状态迅
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图 1 酶切前后ds cDNA电泳检测
M.15 000 bp DNA marker；1. 休眠芽酶切后；2. 休眠芽酶切前；
3. 解除休眠芽酶切后；4. 解除休眠芽酶切前。
Fig. 1 The electrophoresis patterns of ds cDNA before and after
RsaⅠdigestion
M.15 000 bp DNA marker；1. Electrophoresis of digested of dormant
buds；2. Electrophoresis of undigested of dormant buds；
3. Electrophoresis of digested of dormancy-released buds；
4. Electrophoresis of undigested of
dormancy-released buds.
图 2 抑制性差减（A）和未差减（B）杂交后二次PCR产物分析
Fig. 2 The electrophoresis patterns of products of the second
PCR from the subtracted（A）and unsubtracted
（B）cDNA fragments
M：2 000 bp DNA marker.
速加深，直至 11 月 24 日，枝条花芽在培养后再无萌发，表明该阶段桃花芽已进入深休眠状态，即
进入自然休眠期。
1 月初采集的枝条，培养后陆续萌发，说明休眠开始解除；1 月 15 日采集的枝条，培养 20 d 后
超过 50%的芽体萌发，说明 1 月 15 日为休眠解除期。
2.2 桃花芽 cDNA 消减文库构建及上调表达的 cDNA 阳性克隆的筛选
2.2.1 总RNA的提取与mRNA分离纯化
本试验获得的总RNA完整性好，没有降解，
且没有基因组的污染，28S 与 18S 带型亮度比
2︰1，达到文库构建要求。
进一步用紫外分光光度计检测其纯度，总
RNA OD260/OD280 的值均在 1.9 ~ 2.0 之间，表
明其纯度较高，无蛋白和 DNA 污染，可以用
于 mRNA 的纯化。
对总 RNA 进行定量，然后分离纯化实验
组和对照组的 mRNA，纯化后的 mRNA 经定
量后用于下一步试验。
2.2.2 双链 cDNA的合成和 RsaⅠ酶切
合成 Tester 和 Driver 的双链 cDNA，再以
RsaⅠ酶切合成的双链，以产生平头末端，用于
后续的接头连接试验。
将酶切前和酶切后的双链 cDNA 样品于
1.0%琼脂糖凝胶上电泳（图 1），结果显示：休
眠花芽和解除休眠花芽的ds cDNA在酶切前后
均呈现弥散，而且酶切后 cDNA 的平均大小均
变小，带型下移，说明 RsaⅠ酶切效果较好，
可进行后续的差减杂交。
2.2.3 抑制性差减杂交后的二次 PCR 产物分
析
用 1.0%琼脂糖/EB 凝胶电泳分析差减杂交
和未差减杂交的二次 PCR 产物，发现差减杂交
后弥散条带较未差减杂交弥散条带明亮，而且
正向差减杂交后的 cDNA 弥散条带分布在
250 ~ 1 000 bp，但在 300 ~ 500 bp 处最亮，表
明差减杂交后富集的 cDNA 片段大小集中分布
于 300 ~ 500 bp 处，符合差减杂交后的规律（图
2）。
2.2.4 插入片段的 PCR鉴定
构建差减文库后，用巢式引物对白色克隆菌液进行 PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示（图
3），插入片段长度多在 300 ~ 500 bp 之间，并呈现出较强的多态性，具有低重复率的特点，表明经
12 期 李 玲等：桃花芽休眠解除 SSH 文库构建及相关基因表达分析 2277

过差减后高丰度基因的均一化效果较好，构建的文库质量较高。



图 3 差减cDNA文库外源插入片段检测
M. 2 000 bp DNA marker；1 ~ 10. 随机挑选的克隆。
Fig. 3 Identification of the inserted fragments of the subtracted cDNA library
M. 2 000 bp DNA marker；1–10. Clones amplified by PCR.

经过总 RNA 和 mRNA 质量、RsaⅠ酶切效率及抑制性差减杂交后二次 PCR 产物分析，各项指
标均符合要求。消减文库共获得约 800 个正向差减片段的重组克隆，将所得克隆进行 PCR 扩增，对
PCR 产物检测，结果表明连接、转化效果较好。去除非单克隆及电泳条带不清晰的克隆后，剩余 380
个重组克隆。
根据杂交结果，有 180 个克隆信号强度增强 3 ~ 4 倍，可作为上调表达的阳性克隆，进行 DNA
测序。
2.3 桃花芽 cDNA 消减文库 EST 功能分类
通过对上调表达的 180 个克隆进行测序，结果共有 128 个克隆测序成功，除去冗余序列和菌的
基因片段后，共得到 28 个单一序列。将所得序列分别在 NCBI 和 TAIR 蛋白数据库中进行 BLAST
分析，发现这些序列分别属于新陈代谢、氧化还原、信号转导、抗性相关等类别基因，比对结果见
表 2。
通过生物信息学分析，差异表达 cDNA 文库中，以防御功能蛋白及新陈代谢类占的比例最大，
分别达到 25.00%和 17.86%，其次是氧化还原与信号转导类，分别达到 14.29%和 7.14%，另外结构
功能活性基因、功能未知蛋白、没有匹配蛋白、转运活性蛋白基因等占 35.71%。

表 2 休眠解除库中的EST与GenBank 功能已知基因同源性比较（BLASTx）
Table 2 Similarity analysis（BLASTx）of dormancy release library EST with the function
identified genes in GenBank
基因
Unigene
同源性比对登录号
Homology comparison
Accession
同源性物种
Homology species
功能注释
Functional annotation
E 值
E value
新陈代谢 Metabolism
（17.86%）

T3 BAB33421.1 挪威云杉
Picea abies
衰老相关蛋白
Senescence-associated protein
2.00E–14
T56 NP-195214 拟南芥
Arabidopsis thaliana
酰胺酶家族蛋白
Amidase family protein
2.00E–34
T57 NP-188929 拟南芥
Arabidopsis thaliana
硫酸酯腺苷转移酶
Sulfate adenylyl transferase（ATP）
6.00E–134
T58 NP-565032 拟南芥
Arabidopsis thaliana
脱氧核苷激酶
Deoxynucleoside kinase family
1.00E–108
T59 NP-001152099 玉米
Zea mays
羧基端肽
Carboxyl-terminal peptidase
2.00E–42
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续表 2

基因
Unigene
同源性比对登录号
Homology comparison
accession
同源性物种
Homology species
功能注释
Functional annotation
E 值
E value
激酶活性 Kinase activity
（3.57%）

T28 NP194059.1 拟南芥
Arabidopsis thaliana
蛋白激酶
Protein kinase，putative
7.00E–30
信号转导 Signalling and
transcription（7.14%）

T30 ACL54967.1 菊苣
Cichorium intybus
MADS-开花相关蛋白
MADS FLC-like protein 3
8.00E–04
T94 O04011 桃
Prunus persica
生长素绑定蛋白
ABP20 Auxin-binding protein ABP20；
Flags：Precursor
1.00E–107
防御 Defence（25.00%）
T14 AAL85480.1 桃 Prunus persica 防御蛋白 Defensin protein 1 1.00E–17
T83 EEF43287.1 蓖麻
Ricinus communis
脱水反应蛋白前体
Dehydration-responsive protein RD22
precursor，putative
4E–74
T82 AAS46614.1 桃 Prunus persica 脱水蛋白 Dehydrated protein 2E–36
T86 BAF62159.1 桃 Prunus persica 水孔蛋白 Aquaporin TIP1 1.00E–47
T87 XP_002531349.1 蓖麻 Ricinus communis 水孔蛋白 Aquaporin PIP1.1，putative 1e–94
T95 ACH58424.1 苦杏仁
Prunus dulcis
金属硫蛋白
Metallothionein-like protein
7.00E–24
T40 ABA27017.1 蒲公英
Taraxacum officinale
病原体和取食防御蛋白
Pathogen and herbivory defense protein
5.00E–18
氧化还原
Oxidation-reduction
（14.29%）

T85 XP_002519251 蓖麻
Ricinus communis
过氧化物酶前体
Peroxidase 40 precursor，putative
8.00E–120
T10 ABO20851.1 红花烟草
Nicotiana tabacum
细胞色素
P450 Cytochrome P450 like_TBP
1.00E–44
T5 XP_002298430.1 毛果杨
Populus trichocarpa
类胡萝卜素裂解双加氧酶
Bixa orellana carotenoid cleavage
dioxygenase mRNA，complete cds
1.00E–14
T41 BAH95951.1 细菌
Uncultured bacterium
亚硝酸还原酶
Nitrite reductase
9.00E–06
转运 Transport（7.14%）
T96 AY620230.1 桃 Prunus persica 脂质转移蛋白前体
Lipid transfer protein 1 precursor
3.00E–36
T108 AAL14776 拟南芥
Arabidopsis thaliana
ATP 绑定转运蛋白
ATP-binding cassette transporter MRP6
1.00E–20
结构活性 Structural
molecular activity
（10.71%）

T43 ATMG00020.1

拟南芥
Arabidopsis thaliana
26S 核糖体蛋白
26S ribosomal protein
1.00E + 10
T79 L28749.1 桃
Prunus persica
18S 核糖体蛋白
18S ribosomal protein
0
T104 DQ667962.1 葡萄
Vitis vinifera
26S 核糖体蛋白
26S ribosomal protein
1E–149
其他 Others（7.14%）
T128 ABG37638.1 毛果杨
Populus trichocarpa
转座酶
Transposase
4E–18
T129 DY652233.1 桃 Prunus persica 组蛋白 Histone H3.3 0
未知 Unknown（3.57%）
T32 ACR36970.1 玉米 Zea mays 未知 Unknown 1E–22
没有匹配 No match
（3.57%）

T81
12 期 李 玲等：桃花芽休眠解除 SSH 文库构建及相关基因表达分析 2279

2.4 部分基因表达分析
从构建的 SSH 文库中，选取 3 个候选基因：HisH3、Dhn 和 Metallothionein 基因，采用 qRT-PCR
技术分析其在花芽休眠解除过程中的表达模式。由图 4 可以看出：各个候选基因在花芽休眠解除过
程中均出现了表达上调的趋势，但略有不同。HisH3 和 Dhn 的表达量在整个花芽休眠解除过程中表
现为波动性变化，在休眠解除期表达量最高；Metallothionein 的表达量在花芽休眠解除期间呈稳定
上升的趋势，休眠解除后达到最高。

图 4 桃花芽自然休眠解除过程中不同基因的表达模式分析
Fig. 4 Expression changes of several genes（HisH3，Dhn，Metallothionein）during floral bud dormancy release
3 讨论
文库中筛选到的新陈代谢、氧化还原及转运蛋白类基因为花芽休眠解除提供了物质基础和能量
支持；信号转导系统则启动激素生成、细胞分裂等特定基因的表达，开启相关代谢途径；细胞色素
P450 蛋白是该文库中筛选到最多的一种，是植物中最大的酶蛋白家族，参与许多萜类化合物如赤霉
素、类胡萝卜素及植物防御物质的生物合成，在解除休眠过程中起到重要作用。本研究中筛选到的
丝/苏氨酸蛋白激酶是植物生长和发育过程中的重要调节子并存在于多个信号转导途径中。钙依赖蛋
白激酶（CDPKs）是其中一员，在对逆境的适应中起作用。高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在众
多的细胞周期事件，尤其是有丝分裂过程中起至关重要的作用，与休眠解除相关。在休眠解除过程
中还发现与植物逆境胁迫反应有关基因的表达变化如防御素蛋白基因、脱水蛋白基因、金属硫蛋白
基因等。由此可见，休眠是一个相当复杂的过程，是众多基因共同作用的结果。
本研究中通过对 HisH3、Dhn 和 Metallothionein 基因的 qRT-PCR 分析发现，在休眠解除后这些
基因均呈现上调表达的趋势。Devitt 和 Stafstrom（1995）以豌豆（Pisum sativum）芽为材料进行试
验，发现芽休眠诱导和解除与细胞分裂静止和细胞增殖存在相互关系。HisH3 基因作为细胞增殖的
标记基因，在大戟草地下芽的细胞周期研究中已有报导（Anderson & Horvath，2001；Horvath &
Anderson，2002）。休眠的解除导致细胞在 G1-S 期转换中表达的基因上调，例如 HisH3 和 CYCD 基
因（Devitt & Stafstrom，1995），本研究中也得出一致的结果。脱水素是低温、渗透胁迫和种子成熟
2280 园 艺 学 报 38 卷
时积累的一个典型的植物蛋白，属于 Lea D-l1 蛋白家族，当植物细胞氧代谢的平衡在低温等逆境中
被破坏时，它可以清除活性氧自由基的产生，保护细胞膜系统，该类蛋白的积累有助于增强植物的
抗逆性。脱水素在木本植物中的积累与季节变化和休眠程度有关（Arora et al.，2003）。Yamane 等
（2006）通过蛋白质双向电泳分析发现需冷量高的梅品种脱水蛋白有较高积累。Pacey-Miller 等
（2003）用基因芯片的方法也发现该蛋白与葡萄的休眠有关。本试验表明，在桃休眠解除过程中，
Dhn 基因的表达呈波动性变化，在休眠解除后的 1 月中旬表达量最大，说明其在花芽休眠解除过程
中起到一定的调控作用，与前人研究结果（Artlip et al.，1997；Rowland & Arora，1997；Rorat，2006）
一致。金属硫蛋白在重金属解毒及金属离子平衡方面具有重要功能，在清除活性氧方面也具有重要
作用。本试验中随休眠的解除 Metallothionein 转录水平逐渐升高，与休眠解除时的低温胁迫密切相
关。与前人在覆盆子（Mazzitelli et al.，2007）、挪威云杉（Yakovlev et al.，2006）芽休眠解除时上
调表达的研究结果一致。因此，该类蛋白在休眠解除期的积累很大程度上与抵抗低温胁迫保护植物
免受 ROS 的伤害有关。

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