全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（9）：1409–1415
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–04–16；修回日期：2010–08–17
基金项目：国家转基因专项（2009ZX08009-122B）；国家自然科学基金项目（30971982，30800741，30700545，30671441）；中国博士
后科学基金特别资助项目（200902153）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：rschan@cau.edu.cn）
苹果属山荆子 MbNramp1 基因克隆、序列与表
达分析
肖海华 1,2,3，印莉萍 3，韩振海 1,*
（1 中国农业大学园艺植物研究所，北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室，北京 100193；2 四川农业大学资
源环境学院，四川雅安 625014；3首都师范大学生命科学学院，北京 100048）
摘 要：以苹果属山荆子为试材，根据 Nramp1 同源序列保守区设计两对简并引物进行 PCR，结合
RACE 技术获得了 3′末端和 5′末端片段，将 3 段片段序列拼接，根据拼接序列获取了 MbNramp1 基因全长
cDNA 序列。MbNramp1 cDNA 长 2 090 bp，包含一个长度为 1 656 bp 的开放阅读框，编码 551 个氨基酸
的多肽，分子量约为 59.7 kD。该基因编码的蛋白是一个膜蛋白，76%以上的氨基酸为非极性。MbNRAMP1
与二价铁、锰转运蛋白 NRAMP 基因家族保守性很高，具有 NRAMP1 金属转运蛋白家族基因典型特征，
即含有推断的 N–端相连的糖基化位点、10 个预测的跨膜结构域（TMs），在第 6 和第 7 跨膜结构域间有
一个相同的转运基序（CTM）。低铁胁迫时 MbNramp1 在根中表达量增加。
关键词：山荆子；Nramp1；MbNramp1；铁转运蛋白；锰转运蛋白
中图分类号：S 661 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）09-1409-07

MbNramp1 Gene Cloning，Sequence Analysis and Expression Analysis in
Malus baccata（L.）Borkh.
XIAO Hai-hua1,2,3，YIN Li-ping3，and HAN Zhen-hai1,*
（1 Institute for Horticultural Plants，Key Laboratory of Beijing Municipality of Stress Physiology and Molecular Biology
for Fruit Trees，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2 College of Resources and Environment，Sichuan
Agricultural University，Ya’an，Sichuan 625014，China；3 College of Life Science，Capital Normal University，Beijing
100048，China）
Abstract：Degenerate primers corresponding to the conserved motifs of NRAMP1 in plants were used
to amplify specific DNA fragments from Malus baccata（L.）Borkh. roots cDNA. Then the gene specific
primers were designed based on the obtained specific DNA fragments，the 3′ end and 5′ end fragments
were amplified by RACE. A 2 090 bp full length cDNA MbNramp1 containing a 1 656 bp ORF was
obtained based on specific DNA fragments. MbNramp1 encodes a polypeptide of 551 amino acids with a
predicted molecular mass of 59.7 kD and a membrane protein with more than 76% non-polar amino acids.
All conserved features of NRAMP described previously were present in the predicted MbNRAMP1
sequence，such as putative N-linked glycosylation sites，10 transmembrane domains（TMS）and a

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consensus transporter motif（CTM）located between Ⅵ and Ⅶ TM. Expression of MbNramp1 was
increased in roots under iron deficiency，and its mRNA accumulation patterns differed with the induction time.
Key words：Malus baccata（L.）Borkh.；Nramp1；MbNramp1；iron transporter；manganese transporter

缺铁诱发的植物新叶变黄是全球普遍存在的主要农业问题之一（Römheld & Marschner，1986；
Ling et al.，1999）。从分子水平克隆与鉴定植物中活化吸收利用铁的转运蛋白基因是目前很有必要
开展的课题。目前，已经发现植物中存在两类参与铁吸收的基因即 Irt/Zip 和 Dmt/Nramp（Eide et al.，
1996；Belouchi et al.，1997；Curie et al.，2000；Thomine et al.，2000；Connolly et al.，2002；Vert et
al.，2002；Bereczky et al.，2003）。NRAMPs（Natural resistance-associated macrophage proteins）是
具有高度保守膜蛋白，广泛存在于细菌、真菌、植物、微生物中（Cellier et al.，1996，2001；Williams
et al.，2000）。前人的研究表明，不同物种中 Nramps 表现出功能差异。番茄中 LeNramp1 受铁营养
状况调节在根中专一表达（Bereczky et al.，2003）。拟南芥 AtNramp1，AtNramp3 和 AtNramp4 编码
功能性金属转运蛋白，当植株中供铁量低时表达量较高（Curie et al.，2000；Thomine et al.，2000）。
据报道，AtNramp1 作为金属转运蛋白能够互补酵母 Fe（II）转运突变株 DEY1453（Curie et al.，2000；
Thomine et al.，2000）。AtNramp3 作为金属转运蛋白能够将液泡中的金属运输到液泡膜附近的细胞
质中（Thomine et al.，2003）。AtNramp3 和 AtNramp4 活化液泡中的铁对种子萌发有促进作用（Lanquar
et al.，2005）。TjNramp4 存在于 Ni 超富集植物（Thlaspi japonicum）中，专一转运 Ni，而不转运 Zn，
Cd 或 Mn（Mizuno et al.，2005）。山荆子［Malus baccata（L.）Borkh.］具有极强的抗寒性，能够耐
–45 ˚C 的低温，在我国北方广泛用作苹果砧木（韩振海和沈隽，1991）。为了弄清 Nramp 家族基因
是否在木本植物中存在并在金属元素铁的吸收转运过程中发挥着作用，本试验中以山荆子为试材，
采用简并引物结合 RACE 技术克隆山荆子中的 Nramp1 基因，并对基因全长序列进行生物信息学分
析，同时初步研究了低铁胁迫时该基因在根中的表达特性。
1 材料与方法
1.1 植物材料
试验于 2003 年 3 月—2004 年 10 月在中国农业大学北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验
室进行。取 2 个月苗龄山荆子[Malus baccata（L.）Borkh.]无菌苗于生根培养基中培养，生根后的
壮苗移入半完全营养液中培养，1 周后更换完全营养液（Han et al.，1994）。培养 3 个月后分为正常
处理与缺铁胁迫处理组。正常处理组供铁 40 µmol · L-1（EDTA-Fe2+）作为对照，缺铁胁迫处理组供
铁 4 µmol · L-1（EDTA-Fe2+），其余营养成分不变，缺铁胁迫处理 15 d。胁迫期间进行取样，取样时
期为 5 d 和 15 d，取样部位为新生幼嫩白根，立即用液氮速冻后保存于–80 ℃冰箱中。
1.2 cDNA 的制备、引物设计、基因克隆与序列分析
总 RNA 提取采用 SDS 法。第一链 cDNA 合成按照 SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase 试剂
说明书操作。通过对高等植物中 NRAMP1 蛋白进行比对，发现该类蛋白有 7 个保守区（Region），
根据第 1，4，7 个保守区设计简并引物进行目的片段扩增，各引物代码与序列见表 1。
目的片段扩增按照 LA Taq 酶说明书进行操作。PCR 法扩增反应体系：模板 10 × bufferⅡ 5 µL，
dNTP mix（各 2.5 mmol · L-1）8 µL，引物（10 mmol · L-1）各 1 µL，cDNA 0.5 µL，LA Taq 酶 1.0 µL，
ddH2O 补充至总体积 50.0 µL。PCR 程序设计参照 Sambrook 和 David（2003）的方法：94 ℃ 变性 3
9 期 肖海华等：苹果属山荆子 MbNramp1 基因克隆、序列与表达分析 1411

图 1 MbNramp1 全长 PCR 产物
Fig. 1 MbNramp1 PCR producut
min，94 ℃ 变性 40 s，58 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 2 min，30 个循环，72 ℃延伸 10 min。3′-RACE
和 5′-RACE 按照 Takara 试剂盒说明书进行。T-A 克隆按照 T-Vector 试剂盒说明书进行。感受态制备、
转化、蓝白筛选参照文献（印莉萍和刘祥林，2001）中的方法。
通过网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行检索，用 DNAMAN 6.0.3.48 进行进化树分
析，用 TMHMM 2.0 进行蛋白跨膜结构域分析。
表 1 引物代码与引物序列
Table 1 Primers’ code and their sequence
引物
Primer
序列
Sequence


引物
Primer
序列
Sequence
R1UP
R4LP
R4UP
R7LP
R1-7UP
R1-7LP
RT-primer
gAR ACT gAT YTN CAA gCW ggW gC；
gC HgA gtg vAR RRA ADA gAT TRT gYg gCA T
gTD ATg CCR CAY AAT CTM TTC YTB CAC TC
TCA TTg CHT CKA TGA THY TWT CCT TTG A
ggA gCA AAT CAC AGA TAC gAg C
CAA TgA TAA TgA gCC TTC CTg C
5′（p）-CA ggC CAA gAA ggA g-3′
A1
S1
A2
S2
GSUP for 3′-RACE
UP
3 sites Adaptor Primer
5′-AgC AgA AgT AgC CgT CAT AgC g-3′
5′-TTC CgC CTT gCA TAA TTC TgA C-3′
5′-TgA CAT ACC CgA AgT TAT Tgg C-3′
5′-ggT TTg CTg AgA gAg ACT ggA T-3′
5′-CAT TAT Cgg Cgg ATC TTC Agg A-3′
5′-CAC ATT CAg gCA ATA CTA gTC ATC-3′
3′-Full RACE Core set
1.3 半定量 RT-PCR 分析
采用特异引物 R1-7UP 和 R1-7LP 进行 RT-PCR，对照选用 Actin 基因，引物为 AUP：gac atg gag aag
atc tgg cac cac a；ALP：cgc cac gta cgc cag ctt cta ctt c。RT-PCR 反应 25 µL：10 × PCR buffer 2.5 µL；
dNTP mix（10 mmol · L-1）1 µL，引物（10 mmol · L-1）各 1 µL，cDNA 1 µL，ddH2O 18 µL，Taq DNA
聚合酶 0.5 µL。94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，28 个循环。
2 结果与分析
2.1 MbNramp1 基因扩增、克隆与测序
依据 Nramp1 同源序列设计了两对简并引物 R1UP/R4LP 和 R4UP/R7LP。以 cDNA 为模板进行扩
增，两对简并引物分别扩增出了一条 500 bp 左右的片段。根据片段测序结果将两序列拼接，根据拼
接序列设计特异引物 R1-7UP/R1-7LP，进行 PCR 获得产物为 1 000 bp 左右的基因片段，将该片段命名
为 MbNramp1R1-7。
3′-Full RACE PCR 产物片段 3′端长度为 836 bp，该 cDNA5′端包含特异引物序列 GSUP 及已知
MbNramp1R1-7 的部分序列，3′末端包含互补 Oligo dT-3sites Adaptor Primer 和一段 poly（A）尾巴。
5′-RACE 产物片段长为 628 bp，其中包含已知
MbNramp1R1-7 的部分序列片段和相应的引物
序列，并含有起始密码子。
将已经得到的 5′端、MbNramp1R1-7、3′
端 3 个片段进行序列拼读，初步获得全长序列
信息，然后在上游设计特异引物 UP 与 3sites
Adaptor Primer 配对扩增全长，大小与拼读全长
大小基本一致，将该片段命名为 MbNramp1，
测序结果表明该序列含有 2 090 bp，与拼读序
列一致（图 1）。
1412 园 艺 学 报 37 卷
2.2 序列比对与进化树分析
利用生物学软件 DNAMAN6.0 对 MbNramp1 全长序列进行分析（图 2），MbNramp1 cDNA 包含
一个长度为 1 656 bp 的开放阅读框，其中 A、T、G、C 4 种碱基含量分别为 27.85%（A），28.37%
（T），21.39%（G）和 22.30%（C），3′非翻译区长度为 345 bp，5′非翻译区为 89 bp，由此 cDNA 核
苷酸序列推导出一条编码 551 个氨基酸的多肽，分子量约为 59.7 kD。































图 2 Mbnramp1 基因序列及其编码蛋白质
Fig. 2 The nucleotide sequence and amino acid sequence of MbNramp1 gene

MbNramp1 基因的保守结构域分析结果（图 3）表明：MbNramp1 与 Nramp 基因家族的 Mn2＋和
Fe2＋转运蛋白极保守，E 值（E value）为 2e-122，得分（Score）434 bits。
CACATTCAGGCAATACTAGTCATCCCTACTCAATTTAACTAGCTGCTGCAGATCACAGACACAGAGAGAGATGGAAAACAAA
1 M E N K
ATACAAGATCAGCAACAGGGAACGAGTACAGATGGAGCTTCCAAACGCATATCAGCCATCTATTCAGAACCCACACCACCA
I Q D Q Q Q G T S T D G A S K R I S A I Y S E P T P P
CCACCCAGCGAACACTTTGATCTTGAGCTTGATCATAATACTGACCCTAAGGATGAGCCTCAGAAGCCTGGATTGAGAAA
P P S E H F D L E L D H N T D P K D E P Q K P G L R K
GTTTCTAGCACATGTTGGCCCTGGCTTCCTTGTCTCTTTGGCTTACCTTGATCCTGGCAACTTGGAAACTGATCTCCAAGC
F L A H V G P G F L V S L A Y L D P G N L E T D L Q A
TGGAGCAAATCACAGATACGAGCTGCTATGGGTGATTCTTATTGGATTGATCTTCGCTCTCATAATCCAGTCTCTCTCAGC
G A N H R Y E L L W V I L I G L I F A L I I Q S L S A
AAACCTTGGTGTGATAACTGGGAAACATTTGTCAGAATTATGCAAGGCGGAATACCCACCATTTGTGAAGTATTGTTTGTG
N L G V I T G K H L S E L C K A E Y P P F V K Y C L W
GTTGCTAGCAGAAGTAGCCGTCATAGCGGCTGACATACCCGAAGTTATTGGCACAGCGTTTGCCCTAAATATACTGTTCAA
L L A E V A V I A A D I P E V I G T A F A L N I L F N
TATTCCAGTTTGGACTGGAGTACTCTTAACTGGTTTCAGTACTCTTCTCCTTCTTGGCCTGCAGAAATATGGGGTGAGGAA
I P V W T G V L L T G F S T L L L L G L Q K Y G V R K
GCTGGAAATGCTGATAGCAGTGCTGGTGTTTGTGATGGCTGCCTGTTTCTTTGGGGAAATGAGTTATGTGAAGCCTCCGGC
L E M L I A V L V F V M A A C F F G E M S Y V K P P A
ATCCGGTGTGCTCAAAGGCATGTTCATCCCTAAGCTCAGCGGCCAGGGAGCCACCGGAGATGCCATTGCCCTCTTGGGTGC
S G V L K G M F I P K L S G Q G A T G D A I A L L G A
CCTTATTATGCCGCACAATCTTTTTCTCCACTCAGCTCTTGTGCTTTCAAGGAAAATTCCAAATTCTGTCCGTGGCATGAA
L I M P H N L F L H S A L V L S R K I P N S V R G M N
CGATGCATGTCGATATTTCTTGATAGAGAGTGGATTTGCATTATTTGTAGCATTTTTAATCAATGTTGCTATTATATCCGT
D A C R Y F L I E S G F A L F V A F L I N V A I I S V
ATCCGGCACCGTTTGCCATCAGAGCAACCTCTCGGATAAGAACAACGACACATGCAGTGATCTTACTCTCAATTCTGCTTC
S G T V C H Q S N L S D K N N D T C S D L T L N S A S
CTTTCTTCTCCAGAATGTGTTGGGACGATCAAGCAAAATCTTGTATGCCATTGCACTATTAGCCTCAGGCCAAAGCTCCAC
F L L Q N V L G R S S K I L Y A I A L L A S G Q S S T
GATTACAGGCACTTACGCAGGACAATTTGTCATGCAGGGTTTCTTGGACATTAAGATGAAAAAATGGGCTAGAAACTTGAT
I T G T Y A G Q F V M Q G F L D I K M K K W A R N L M
GACGAGGTGCATTGCCATTACACCAAGCCTCATTGTTTCCATTATCGGTGGATCTTCAGGAGCAGGAAGGCTCATTATCAT
T R C I A I T P S L I V S I I G G S S G A G R L I I I
TGCCTCGATGATACTATCTTTTGAGCTCCCATTTGCTCTAATTCCACTCCTCAAATTCAGCGGTAGTGCCACCAAAATGGG
A S M I L S F E L P F A L I P L L K F S G S A T K M G
ACCCCACAAGAATTCAATCTATATCATTGTGATATCATGGATTATAGGAATGGCAATCATAGGCATCAACATCTACTACCT
P H K N S I Y I I V I S W I I G M A I I G I N I Y Y L
CAGCACAGGATTTGTAGGGTGGATAATCCACAGCAGTCTACCCAAAGTTGCAACTGTGTTCATTGGGATCTTGGTGTTCCC
S T G F V G W I I H S S L P K V A T V F I G I L V F P
TATCATGGCCATTTACATCCTTGCAGTCCTTTACCTAGCCCTAAGAAAAGACAGTGTGGTAACTTTTGTTGAGCCCACAAA
I M A I Y I L A V L Y L A L R K D S V V T F V E P T K
GAACGACCCAGCAGCCCAAAACCAAATGGAAAATGGGCTTCCCAACTATGGTGAGCCCCCAGTGCCTTTCAGAGAGGACTT
N D P A A Q N Q M E N G L P N Y G E P P V P F R E D L
GGCTGACGTATCTTTACCTCAATAGAGGACATATATATTTTCATATGCATATGCTTCCCACTTTGCATTACGAGTGTTAGT
A D V S L P Q *
CGAACCTAATACCTGTTGAACTTCGTACCGGTTCAAGACCTTCGAGGAAAAGAGACGAGCCGTGTTAGTCGAACTTAATAC
CTGCCGAATCTTTGTACCGTTTCGAGACCTTGAGAGGAAAGGGACCAGCGTTGCACTTAAGAATTAAGATTGTAATGGTTT
TTTATGAACTAGAAGATAGAAGCTCTTTAAGAAGTAGTAGGACTCTTATTGTATCACTCGGATAGTGTCCCCGAGAGGATT
ATGTGGTGTTTATCATATTGAATAATAAATTATCTAAGGGAAGAATAATCAAAAAAAAAAAAAAA
9 期 肖海华等：苹果属山荆子 MbNramp1 基因克隆、序列与表达分析 1413

图 3 MbNramp1 保守结构域分析
Fig. 3 Analysis conserved domain of MbNramp1
用 TMHMM 2.0 对蛋白质结构进行预测，MbNRAMP1 蛋白含有推断的 N–端相连的糖基化位
点、10 个推断的跨膜域（TMs）（图 4），在第 6 和第 7 跨膜结构域间有一个相同的转运基序（CTM）。
图 4 MbNRAMP1 蛋白跨膜结构域预测
Fig. 4 Prediction of trans-membrane helices in MbNRAMP1 protein

图 5 植物中 Nramp 基因家族亲缘关系进化分析
Fig. 5 Dendrogram showing amino acid sequence similarity among plants Nramps
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已知生物体中 Nramps 是一个基因家族。将 MbNRAMP1 与 3 个番茄蛋白、8 个水稻蛋白、6 个
拟南芥蛋白、1 个葡萄蛋白、1 个杨树蛋白、1 个蓖麻蛋白、1 个遏蓝蛋白和 1 个高粱蛋白进行进化
树分析（图 5），结果表明 MbNRAMP1 与葡萄中 VvNRAMP1 亲缘关系最近。
2.3 山荆子 MbNramp1 基因在根中的表达特性分析
在克隆到山荆子 MbNramp1 基因的特异片段 MbNramp1R1-7 后，对其进行半定量 RT-PCR 分析，
结果表明（图 6），与正常供铁（40 µmol · L-1）相比，低铁（4 µmol · L-1）胁迫后，MbNramp1 基因
在山荆子根中加强表达，低铁胁迫 5 d 时，表达量最高，随着时间延长，低铁胁迫达到 15 d 时，表
达量减弱，但是与对照相比，表达量仍稍微高一些。
图 6 MbNramp1 基因表达特性分析
Fig. 6 Expression of MbNramp1 in Malus baccata（L.）Borkh.
3 讨论
作者从苹果属山荆子中获得了 NRAMP 金属离子转运蛋白的 cDNA 克隆，MbNramp1。推测的
氨基酸序列分析表明该基因编码一个膜蛋白，76%以上的氨基酸都是非极性的，且和已知的植物中
NRAMP 蛋白具有较高的同源性，尤其和葡萄中的 VvNRAMP1 同源性最高，因而将该基因命名为
MbNramp1。MbNramp1 具有 Nramp 金属转运蛋白家族典型特征。RT-PCR 分析结果表明，山荆子中
MbNramp1 的时空表达受外界供铁状况影响，在正常供铁条件下，根中有少量转录，当受到低铁胁
迫时， MbNramp1 mRNA 表达呈增加趋势。这些结果与 Eide 等（1996）在植物生理方面的研究结
果一致，在供铁充足条件下，植物对铁吸收处于一个较低的基本水平，当铁缺乏时，吸铁速率是供
铁充足的 2.8 倍。铁胁迫时诱导 MbNramp1 表达量增加，这表明 MbNramp1 在苹果体内可能参与了
缺铁应答反应。然而低铁胁迫 5 d 后，MbNramp1 在根中表达随时间延长，表达量减弱。这表明在
缺铁的苹果根中 MbNramp1 mRNA 表达量迅速增加。低铁胁迫条件下苹果中 MbNramp1 表达受到正
向调控。对此可能的解释是，一旦植物感应到其生长环境中受到低铁胁迫，植物细胞将大规模吸收
铁。植物自身必须防止细胞质中迅速累积大量自由态铁，以免对细胞造成损伤，这样 MbNramp1 开
始将胞内自由态铁运输到细胞的各区域。
本试验中仅克隆了山荆子中的 NRAMPs 蛋白家族其中一个成员基因 MbNramp1，NRAMPs 蛋白
家族其它成员基因克隆工作已经展开，以期全面了解 NRAMPs 蛋白在山荆子铁营养吸收、转运方面
发挥的作用。
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