全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (9) : 1385 - 1389
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 30; 修回日期 : 2009 - 06 - 25
基金项目 : 安徽省自然科学基金项目 (070411010) ; 安徽省教育厅省级自然科学基金项目 ( KJ2007B053)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hxl@ njau1edu1cn)
文心兰类原球茎液体增殖过程中秋水仙素化学诱变
崔广荣 1, 2 , 上官凌飞 1 , 张子学 2 , 胡能兵 2 , 张从宇 2 , 侯喜林 13
(1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095; 2安徽科技学院植物科学学院 , 安徽凤阳 233100)
摘 　要 : 采用秋水仙素对液体增殖培养中的文心兰类原球茎进行多倍体诱变 , 获得了大量的文心兰多
倍体试管苗。结果表明 , 秋水仙素浓度越高 , 处理时间越长 , 类原球茎受伤害程度越严重 , 再生苗多倍体
比例越大 , 最高诱变率可达 4617% ; 低浓度 , 短时间秋水仙素处理易产生嵌合体 ; 四倍体试管苗植株粗
短 , 健壮 , 叶片宽厚 , 叶片下表皮气孔张度较大 , 下表皮细胞核较大且靠近细胞壁边缘 ; 根尖细胞染色体
数加倍。
关键词 : 文心兰 ; 类原球茎 ; 多倍体 ; 秋水仙素 ; 液体培养 ; 化学诱变
中图分类号 : S 682131; Q 81311 + 2　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0921385205
Colch ic ines Chem ica l Induction D ur ing Propaga tion of Protocorm 2like Bod ies
of O ncid ium in L iqu id Culture
CU I Guang2rong1, 2 , SHANGGUAN L ing2fei1 , ZHANG Zi2xue2 , HU Neng2bing2 , ZHANG Cong2yu2 , and
HOU Xi2lin13
(1 S ta te Key Labora tory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, College of Horticulture, N an jing A gricu ltura l U niversity,
N anjing 210095, Ch ina; 2 Plan t Science School of A nhu i Science and Technology U niversity, Fengyang, A nhui 233100, China)
Abstract: Colchicines were emp loyed to induce polyp loid p lantlets of O ncid ium during p ropagation of
p rotocorm 2like bodies ( PLB s) in liquid culture. A lot of polyp loid p lantlets were obtained by this technique.
The results showed that the PLB s cultured in the medium contained higher concentration of colchicines got
harmed more severely and the rate of p loyp loid p lantlets was bigger with higher concentration of colchicines or
longer time of treatment . The biggest rate of polyp loid p lantlets regenerated from the PLB s could reach to
4617%. The m ixop loid could be p roduced under the condition of lower concentrations of colchicines and short
time of treatment. The tetraloid p lantlets were shorter and stronger and leaves changed broad and thick. The
diameter of lower ep idermal stomata in the tetrap loid was a little bigger than the one in the dip loid. The cell
nucleus of leaf lower ep idermal became bigger and app roached to cell wall. The number of chromosomes in
root tip cells of the polyp loid p lantlets were doubled.
Key words: O ncid ium ; p rotocorm2like body; polyp loid; colchicine; liquid culture; chem ical induc2
tion
国内外有关文心兰 (O ncid ium ) 研究多集中于离体快速繁殖方面 (L im2Ho, 1981; Sagawa &
Kunisaki, 1982; Kerbauy, 1984; 陈兴贻 , 1989; Chen et al. , 1999; 彭晓明 等 , 2000; 崔广荣 等 ,
2004, 2005) , 而兰花离体化学诱变多倍体的报道相对较少 (张志胜 等 , 2005; 陈超 等 , 2006)。本
试验中以文心兰类原球茎液体培养增殖体系 (崔广荣 等 , 2007) 为基础 , 探讨秋水仙素不同浓度及
不同诱变时间对类原球茎生长、分化成苗和诱变效率的影响 , 并对多倍体苗进行了细胞学鉴定 , 建立
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
了文心兰多倍体诱导技术体系 , 为文心兰多倍体育种奠定基础。
1　材料与方法
试验于 2007年 9月至 2008年 12月在安徽科技学院生物技术中心进行。供试材料为文心兰优良
品种 ‘金西 ’由茎尖诱导出的类原球茎 (p rotocorm2like bodies, PLB s)。8 -羟基喹啉、秋水仙素、植
物生长调节剂等购于上海稼丰园艺用品公司。液体培养基为 MS + 62BA 015 mg·L - 1 + Ad 0105 mg·
L - 1 +NAA 0105 mg·L - 1 +椰汁 5% +蔗糖 715 g·L - 1 (崔广荣 等 , 2007) , 类原球茎分化苗培养基
为 MS + 62BA 210 mg·L - 1 +NAA 015 mg·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 , 试管苗生根培养基为 1 /2MS + IBA
015 mg·L - 1 +蔗糖 20 g·L - 1 (崔广荣 等 , 2004)。
将生长状态良好、直径约 2～3 mm的黄绿色类原球茎接种于盛有 30 mL液体培养基的三角瓶中 ,
振荡培养 , 摇床转速为 130 r·m in - 1 , 每瓶接种类原球茎 3 g, 培养周期为 21 d。培养至 14 、18和
20 d时分别加入过滤灭菌的高浓度秋水仙素溶液 , 使培养液中秋水仙素浓度依次为 0105%、011%和
012% , 共 9个处理 , 以空白为对照 , 重复 5次。
经过秋水仙素处理的文心兰类原球茎在液体培养结束后 , 用无菌水漂洗 3次 , 随机取 10粒类原
球茎测量直径 , 其余在固体培养基上分化成苗 , 观察统计苗分化及生长状况。
试管苗根长至 1～2 cm时 , 随机取 30棵苗 , 在超净工作台上剪下长约 1 cm根 , 采用常规细胞压
片技术进行染色体检测。撕取多倍体苗及二倍体苗叶片下表皮用 110% I2 - KI染色 3 m in, 观察气孔
及表皮细胞组织特征。细胞组织学检测用 OPTEC数码显微镜 (BH3002DM2000, 中国 ) 观察拍照 ,
试管苗用数码相机拍照。数据差异性采用 DPS软件进行 SSR法分析。
2　结果与分析
211　秋水仙素对类原球茎形态特征、生长及分化成苗的影响
表 1和图 1表明 , 不同浓度及不同时间秋水仙素处理对文心兰类原球茎的生长、形态特征及分化
成苗影响较大。随着秋水仙素浓度的增加及处理时间的延长 , 类原球茎直径变大 , 秋水仙素浓度越
高、处理时间越长 , 类原球茎肿胀、变大越明显 ; 同时部分原球茎受伤害程度也越明显 , 甚至褐化死
亡 (图 1, A～ I) , 且在颜色上呈现出有规律的变化 , 对照处理的类原球茎表现出颜色鲜绿、生长旺
盛的状态 (图 1, J)。
表 1　秋水仙素处理对文心兰类原球茎生长的影响
Table 1　Effects of colch ic ines trea tm en t on the growth of PL Bs
处理编号
No. of treatment
诱变时间 / d
Time of induction
秋水仙素浓度 /%
Concentrations of colchicines
原球茎平均直径 /mm
Average diameter of PLB s
原球茎伤害程度
Injured degree of PLB s
1 7 0105 414 bc +
2 7 0110 512 a + +
3 7 0120 516 a + +
4 3 0105 411 c -
5 3 0110 417 b +
6 3 0120 514 a + +
7 1 0105 215 ef -
8 1 0110 218 de -
9 1 0120 310 d -
10 (对照 Control) 0 0 213 f -
　　注 : “ + ”多少表示伤害程度大小 ; “ - ”表示无伤害 ; 不同小写字母表示在 5%水平上差异显著。
　　Note: “ + ” rep resents injured degree; “ - ” rep resents no injured. D ifferent small letters rep resent significant difference at 5% level.
6831
　9期 崔广荣等 : 文心兰类原球茎液体增殖过程中秋水仙素化学诱变 　
图 1　不同浓度及不同时间秋水仙素处理文心兰类原球茎生长状态
A～J分别对应表 1中 1～10处理。
F ig11　The growth sta tes of PL Bs trea ted w ith d ifferen t concen tra tion s of colch ic ines in d ifferen t tim e
A - J match with treatments 1 - 10 in the Table 1 respectively.
在分化成苗过程中 , 与对照处理相比 , 秋水仙素处理的类原球茎分化成苗时间晚 , 苗体呈现粗
短 , 肿胀 , 肉质芽 , 生长缓慢 (图 2, A、B ) , 秋水仙素浓度越大、处理时间越长 , 表现得越明显 ,
且在后期的生长过程中部分芽逐渐褐化死亡 (图 2, C, 箭头所示 )。总体上看 , 用 012%秋水仙素处
理 3 d效果较好 , 既有利于类原球茎生长和苗再生 , 又可获得较高的诱变频率。
图 2　各处理类原球茎在分化培养基中的成苗状况
A. 处理 1, 20 d; B. 对照 , 20 d; C. 处理 2, 60 d。
F ig12　The sta te of shoot regenera tion from the PL Bs cultured in d ifferen t m ed ium
A. Treatment 1, 20 days; B. Control, 20 days; C. Treatment 2, 60 days.
212　不同处理再生试管苗根尖染色体倍性鉴定及诱变率
‘金西 ’品种文心兰体细胞染色体数为 2n = 42 (图 3, A)。
表 2结果表明 , 随着秋水仙素浓度提高及处理时间的延长 , 诱变率逐渐提高。秋水仙素处理 1 d
(处理 7、8、9) 诱变效果较差 , 90株再生苗中检测出 7株同质多倍体苗 , 6株嵌合体苗 , 这可能是
由于短时间内秋水仙素难以渗透到类原球茎的所有细胞中 , 只能使类原球茎部分细胞受到诱变的缘
故。
总体看 , 本试验诱变多倍体频率较高 , 除了 6株嵌合体苗外 , 其余全为同质多倍体 (图 3, B )。
在处理 3中检测到 1株染色体重复加倍的八倍体 (图 3, C) , 但植株畸型 , 生长异常缓慢。
7831
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
表 2　不同处理再生试管苗染色体加倍频率差异
Table 2　D ifferences am ong a ll trea tm en ts in chrom osom es doubled
处理编号
No. of treatment
检测苗数
Test number of
p lantlets
四倍体苗数
Plantlet number of
tetrap loid p lantlets
嵌合体苗数
Number of mosaic
八倍体苗数
Number of octap loid
诱变率 /%
Rate of mutation
inducted
1 30 6 0 0 2010 cd
2 30 9 1 0 3010 c
3 30 13 0 1 4617 a
4 30 5 0 0 1617 d
5 30 5 1 0 1617 d
6 30 12 2 0 4010 b
7 30 1 1 0 313 ef
8 30 2 3 0 617 e
9 30 4 2 0 1313 de
10 (对照 Control) 30 0 0 0 0 f
　　注 : 诱变率 ( % ) =染色体加倍苗数 /检测苗总数 ×100, 嵌合体不计入染色体加倍苗数 ; 不同小写字母表示在 5%水平上差异显著。
　　Note: The rate of mutation ( % ) = the number of chromosomes doubled p lantlets / the number of tested p lantlets ×100, m ixop loidswere not
counted in the mutated p lantlets. D ifferent small letters rep resent significant difference at 5% level.
图 3　植株细胞染色体、试管苗及其叶片下表皮细胞组织
A. 二倍体 (10 ×40) ; B. 四倍体 (10 ×40) ; C. 八倍体 (10 ×20) ; D. 二倍体试管苗 ;
E. 多倍体试管苗 ; F. 二倍体叶片 (5 ×10) ; G. 多倍体试管苗叶片 (5 ×10)。
F ig13　Test2tube plan tlets, chrom osom e of cell and h istolog ica l character of lower ep iderma l cell of leaf
A. The dip loid (10 ×40) ; B. The tetrap loid (10 ×40) ; C. The octap loid, (10 ×20) ; D. D ip loid p lantlets;
E. Tetrap loid p lantlets; F. The leaf of dip loid p lantlet (5 ×10) ; G. The leaf of tetrap loid p lantlet (5 ×10) .
213　突变体试管苗形态特征及叶片下表皮气孔组织学特征
二倍体苗 (图 3, D) 在形态上与四倍体苗 (图 3, E) 差异明显。继代苗生长 45 d时 , 多倍体
苗平均高度较二倍体苗短约 1 cm, 但叶片宽度较二倍体苗平均约宽 012 cm, 叶片厚实 , 植株总体表
现粗短、健壮。从叶片下表皮组织学特征来看 , 多倍体苗气孔数、直径与二倍体苗差异并不明显 , 但
气孔的张度较大 (图 3, F、G) , 这与其他植物田间多倍体气孔状态不同 , 可能与试管苗生长在透气
性较差的培养瓶内的因素有关。多倍体苗下表皮细胞的大小与二倍体苗无差异 , 但细胞核较大 (图
3, F、G箭头所示 ) , 且靠近细胞壁边缘 , 叶绿体的含量也相对丰富 (图 3, G)。
8831
　9期 崔广荣等 : 文心兰类原球茎液体增殖过程中秋水仙素化学诱变 　
3　讨论
把化学诱变育种技术与植物组织和细胞离体培养技术相结合 , 对遗传变异的诱发、繁殖、改良选
择技术具有独特的优势和发展潜力 , 具有不受环境条件限制、节省大量人工和时间、扩大变异谱和提
高变异率等优点 (刘进平和郑成木 , 2004; 董颖苹 等 , 2005)。影响植物离体组织细胞染色体加倍的
主要因素有基因型、外植体的种类、诱导组织块大小、培养基、诱导方式、诱导剂的浓度和处理时间
等。本文结果进一步证明了诱导剂秋水仙素的浓度及处理时间对诱变率大小的关键性作用。文心兰类
原球茎液体培养中 , 颗粒较小且增殖生长速度快 (崔广荣 等 , 2007) , 这对于秋水仙素有效渗入类原
球茎组织或正在分裂增殖的组织细胞起着重要作用 , 也是能够获得较高诱变率的原因之一 , 张志胜等
(2007) 在进行红掌离体诱变时也证明了液体培养较固体培养获得更高频率的多倍体 , 这为其他植物
的离体化学诱变提供了有益的借鉴。
References
Chen Chao, W ang Gui2lan, Q iao Yong2xu, Zhang L i2m in. 2006. The PLB chem ical induced mutagenesis and regeneration of Phalaenopsis.
Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 20 (2) : 99 - 102. ( in Chinese)
陈　超 , 王桂兰 , 乔永旭 , 张莉敏. 2006. 蝴蝶兰类圆球茎的化学诱变试验. 核农学报 , 20 (2) : 99 - 102.
Chen J T, Chang C, ChangW C. 1999. D irect somatic embryogenesis on leaf exp lants of O ncidium Gower Ram sey and subsequent p lant regen2
eration. Plant Cell Rep, 19: 143 - 149.
Chen Xing2yi. 1989. Tissue culture of O ncidium. Plant Physiology Communications, (6) : 49. ( in Chinese)
陈兴贻. 1989. 文心兰的组织培养. 植物生理学通讯 , (6) : 49.
Cui Guang2rong, L iu Yun2bing, Zhang Jun2chang, Gu Ye2li. 2004. Studies on tissue culture of O ncidium. Acta Horticulturae Sinica, 31
(2) : 253 - 255. ( in Chinese)
崔广荣 , 刘云兵 , 张俊长 , 谷业理. 2004. 文心兰组织培养的研究. 园艺学报 , 31 (2) : 253 - 255.
Cui Guang2rong, L iu Shi2xun, He Yu2hua, L iu Yun2bing, Gu Ye2li. 2005. Establishment of the high efficiency system of O ncid ium shoot
p ropagation. Acta Bot Boreali2occident Sin, 25 (3) : 562 - 567. ( in Chinese)
崔广荣 , 刘士勋 , 何玉华 , 刘云兵 , 谷业理. 2005. 文心兰试管苗丛生芽高效增殖体系的建立. 西北植物学报 , 25 (3) : 562 - 567.
Cui Guang2rong, Zhang Zi2xue, Zhang Cong2yu, Sun Tao. 2007. The study on O ncid ium PLB s p ropagation in liquid culture. Acta LaserB iolo2
gy Sinica, 16 (3) : 338 - 343. ( in Chinese)
崔广荣 , 张子学 , 张从宇 , 孙　涛. 2007. 文心兰原球茎液体增殖培养研究. 激光生物学报 , 16 (3) : 338 - 343.
董颖苹 , 连　勇 , 何庆才 , 徐　涵. 2005. 植物化学诱变技术在育种中的运用及其进展. Ⅰ化学诱变技术及诱变效率. 种子 , 24
(7) : 54 - 58.
Kerbauy G B. 1984. Plant regeneration of O ncid ium varicosum (O rchidaceae) by means of root tip culture. Plant Cell Rep, 3: 27 - 29.
L im2Ho C L. 1981. Experimental findings of the tissue culture of orchid hybrids at the Singapore Botanical Gardens. Gard Bull, 34: 148 - 160.
L iu J in2p ing, Zheng Cheng2mu. 2004. Induced mutation in connection with in vitro culture for crop breeding. Acta Agriculturae Shanghai, 20
(1) : 19 - 22. ( in Chinese)
刘进平 , 郑成木. 2004. 诱变结合植物组织培养在植物育种中的应用. 上海农业学报 , 20 (1) : 19 - 22.
Peng Xiao2m ing, Zeng Song2jun, Zhang J ing2li, Zhao Feng2pan. 2000. In vitro p ropagation of O ncidium by bud and inflorescence culture. Ac2
ta Horticulture Sinica, 27 (2) : 127 - 129. ( in Chinese)
彭晓明 , 曾宋君 , 张京丽 , 赵逢畔. 2000. 文心兰的茎尖及花梗组织培养和快速繁殖. 园艺学报 , 27 (2) : 127 - 129.
Sagawa Y, Kunisaki J T. 1982. Clonal p ropagation of orchids by tissue culture∥Furusawa W. Proc 5 th Plant Tissue cell cult. Tokyo, 683 -
684.
Zhang Zhi2sheng, L i Yang2hui, J iang Lei, L i Yun, W ang Zhu2ying, Xia Q ing, YiMao2sheng. 2007. In vitro tetrap loid induction and its identifi2
cation in Anthurium andraeanum. Acta Horticulturae Sinica, 34 (3) : 729 - 734. ( in Chinese)
张志胜 , 黎扬辉 , 姜　蕾 , 李　运 , 王朱莹 , 夏 　晴 , 易懋升. 2007. 红掌四倍体的离体诱导及其鉴定. 园艺学报 , 34 ( 3 ) :
729 - 734.
Zhang Zhi2sheng, Xie L i, Xiao A i2xing, He Q iong2ying, J iang Lei. 2005. Effects of colchicine treatment on growth, differentiation and muta2
genesis of p rotocorm2like2body ( PLB) of orchid. Acta Agriculturae Nucleatae Sinica, 19 (1) : 19 - 23. ( in Chinese)
张志胜 , 谢　利 , 萧爱兴 , 何琼英 , 姜　蕾. 2005. 秋水仙素处理兰花原球茎对其生长和诱变效应的影响. 核农学报 , 19 (1) : 19 - 23.
9831