全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (10) : 1498 - 1503
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 12 - 24; 修回日期 : 2009 - 09 - 07
基金项目 : 国家林业局林业科学技术研究项目 (2007201) ; 国家林业局 ‘948’项目 (200424260)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yangkai8978@1261com)
利用早园竹叶绿体基因序列分析其在禾本科植物中
的分类地位
李潞滨 1 , 唐　征 2 , 庄彩云 1, 2 , 胡　陶 1, 2 , 姚　娜 1, 2 , 杨　凯 23
(1中国林业科学研究院林业研究所 , 国家林业局林木培育重点实验室 , 北京 100091; 2北京农学院农业应用新技术北
京市重点实验室 , 北京 102206)
摘 　要 : 从构建的早园竹 ( Phyllostachys propinqua McClure) 叶绿体 DNA基因组文库中克隆了早园竹叶
绿体 atpA ( EU64861)、psaB ( EU64863)、 rpoA ( EU64862) 和 rpoC1 ( EU64864) 4个基因 , 并将其序列分
别与 GenBank中部分禾本科植物的基因序列进行了比对分析 , 构建核苷酸序列的 Neighbor2joining系统进化
树 , 分析探讨其在禾本科中的分类地位。结果表明 , 禾本科植物在系统分类上呈现出两大类群。第一大类
中包括两个亚类 , 水稻与竹类植物聚为一亚类 ; 玉米、高粱和甘蔗聚为另一亚类。另一大类为小麦、大麦、
匍茎剪股颖和黑麦草。表明早园竹与水稻分类地位最为接近 ; 比水稻和玉米、高粱与甘蔗更为较近 , 与禾
本科中麦类及其近缘植物关系较远。
关键词 : 禾本科 ; 早园竹 ; 叶绿体 ; DNA序列 ; 系统分类
中图分类号 : S 68; Q 78　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1021498206
Taxonom ic Sta tus of Phyllos tachys propinqua M cC lure in Poaceae Ba sing on
Sequence Ana lysis of Chloropla st Genes
L ILu2bin1 , TANG Zheng2 , ZHUANG Cai2yun1, 2 , HU Tao1, 2 , YAO Na1, 2 , and YANG Kai23
(1 Key Laboratory of Tree B reeding and Cultivation, S tate Forestry A dm inistra tion, Research Institu te of Forestry, Chinese A cade2
m y of Forestry, B eijing 100091, Ch ina; 2 Key Laboratory of A gricu ltural N ew Technology and A pplication in B eijing, B eijing A g2
ricu ltura l College, B eijing 102206, Ch ina)
Abstract: Following of Phyllostachys propinqua McClure chlorop last genom ic DNA library constructed,
the a tpA ( EU64861) , psaB ( EU64863) , rpoA ( EU64862) and rpoC1 ( EU64864) genes were cloned
and analyzed basing on sequence alignment with other chlorop last genes of Poaceae species in GenBank. In
order to analyze the taxonom ic status of Phy llostachys propinqua in Poaceae, four phylogenetic trees were con2
structed by neighbor2joining method. The results indicated that the gram ineous p lants can be classified as two
classes in the phylogenetic systematics, the first class contained two subclasses, with Phyllostachys propinqua
and rice together as one of the subclass and maize, sorghum , saccharum composing another; The second
class included wheat, barley, ryegrass and creep ing bentgrass. It showed that Phyllostachys propinqua had
the closest taxonom ic status with rice, and it was much closer than that between rice and maize or sorghum
and saccharum and the relation between Phyllostachys propinqua and wheat as well as itpis kindred p lant was
far.
Key words: Poaceae; Phy llostachys propinqua McClure; chlorop last; DNA sequence; phylogenetic sys2
tematics
竹为禾本科 ( Poaceae) 竹亚科 (Bambusadea) 多年生常绿单子叶植物 , 是禾本科最原始的亚科 ,
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　10期 李潞滨等 : 利用早园竹叶绿体基因序列分析其在禾本科植物中的分类地位 　
形态构造较独特。竹秆寿命短 , 开花周期长 , 物种传播和繁殖更新主要依靠营养体分生 , 表现出木质
的秆、复合分枝、发达的根系和地下茎 , 既是养分的贮存和输导的主要器官 , 也具有强大的分生繁殖
能力。我国是世界上竹类的分布中心之一 , 有着极为丰富的竹种资源 , 自然分布约有 40余属 , 500
余种 (赵奇僧和汤庚国 , 1993)。竹类具有良好的经济价值和生态价值 , 早园竹在我国江、浙、苏、
皖一带广泛栽培。作为观赏竹 , 四季常青 ; 作为笋用竹 , 上市早、笋质鲜嫩、甘美。
竹类植物集原始和进化特征于一体 , 在进化中具有与其它亚科不同的独特路线 , 其系统分类研究
对于整个禾本科的进化关系研究具有重要意义。长期以来 , 完全针对竹类植物在禾本科内的系统研究
较少 , 竹亚科在禾本科的分类地位和进化关系一直没有达到共识 , 依据形态学、不同来源 (核、叶
绿体和线粒体 ) 的基因序列或者同一来源但不同基因获得的系统分类都有所差异 ( Grosser & L iese,
1971; Clark et al. , 1995; Mathews et al. , 2000)。
叶绿体 DNA ( chlorop last DNA, cpDNA ) 属母性遗传 , 相对于核基因组分子量小 , 结构简单 , 序
列保守 , 突变率较低 , 遗传稳定 , cpDNA分析被认为是研究系统发生和群体遗传学的理想方法 , 并
被广泛应用 ( Palmer, 1987; Badenes & Parfitt, 1995; Xu et al. , 2001)。
早园竹 ( Phyllostachys propinqua McClure) 是竹亚科刚竹属中比较高级的竹种之一。本研究中尝
试以均属保守编码基因序列、适合进行高等级分类地位研究的早园竹叶绿体 4个基因 a tpA、 psaB、
rpoA和 rpoC1为研究对象 , 对早园竹和水稻、玉米、大麦和小麦等重要禾本科植物的相关叶绿体基因
进行了分析 , 旨在对存在争议的竹类植物在禾本科中的分类地位 , 提供较为适宜和确切的分子生物学
层面的研究手段和结论。
1　材料与方法
111　材料
早园竹 ( Phyllostachys propinqua McClure) 幼嫩叶片 2008年 8月采集自中国林业科学研究院北京
良乡竹藤资源圃。
112　叶绿体基因组 D NA的提取
依照龚小松等 (1994) 的方法。1%琼脂糖凝胶电泳检测提取 DNA质量 , 用紫外分光光度计测
定 DNA样品的浓度 , 4 ℃保存备用。
113　叶绿体基因组 D NA文库的构建
用 10 U内切酶 EcoRⅠ部分酶切 10μg早园竹叶绿体基因组 DNA, 反应体积 100μL, 37 ℃酶切
15 m in, 终止反应后通过 018%琼脂糖凝胶电泳分离、回收 1～2 kb长度酶切 DNA, 将回收的部分酶
切 DNA片段与以 EcoRⅠ酶切并经牛肠碱性磷酸脂酶处理的 pUC18载体用 T4 DNA L igase进行连接 ;
连接产物转化感受态 E1coli Top 10; 铺平板培养进行文库的滴度测定。获得 3104 ×105个重组克隆。
同法构建早园竹叶绿体基因组内切酶 H ind Ⅲ部分酶切叶绿体基因组 DNA文库 , 获得约 219 ×105
个重组克隆。
114　测序和序列分析
早园竹叶绿体基因组 DNA文库克隆送北京金螺旋生物科技中心测序 , 获得早园竹叶绿体基因组
基因序列。利用 BLAST软件与 GenBank数据库中的序列进行比对分析 , 获得早园竹和其它禾本科植
物相应基因的序列。
利用 MEGA 410软件对早园竹叶绿体基因组基因序列和相应禾本科植物基因序列按照最大同源性
的原则进行排序 , 采用 Kimura 2 ( Kimura, 1980) 计算核苷酸差异值 , 并用 Neighbor2joining法 ( Sai2
tou & Nei, 1987) 构建系统进化树 , 自展数 ( bootstrap) 为 1 000。
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2　结果与分析
211　早园竹叶绿体基因的克隆和序列比对分析
经过检测 , 多数克隆插入片段长度在 300～2 000 bp之间 , 随机选取两个叶绿体基因组文库各
100个克隆进行测序 , 测序结果拼接后 , 共计长度 104 339 bp, 所测定的早园竹叶绿体 DNA片段通过
与水稻日本晴 N ipponbare叶绿体 DNA序列 (AY522330) 的比对 , 其长度相当于水稻叶绿体基因组长
度的 71%。
早园竹叶绿体基因组测序片段与 GenBank中水稻、甘蔗、高粱、玉米、匍茎剪股颖和小麦等禾
本科植物叶绿体基因比对 , 获得早园竹叶绿体基因序列。
212　基于早园竹叶绿体基因组基因序列的系统分析
为研究竹类植物的系统分类 , 本研究从克隆的早园竹叶绿体基因组基因中 , 依据 O lm stead和
Palmer (1994) 对叶绿体基因组中哪些基因适于进行系统分类研究的结论 , 选取早园竹叶绿体基因中
a tpA ( EU64861)、psaB ( EU64863)、 rpoA ( EU64862) 和 rpoC1 ( EU64864) 4个基因用于本研究 ,
通过搜索 GenBank数据库获得其它禾本科植物相应基因的序列 , 用于系统进化分析。
叶绿体基因 a tpA编码叶绿体 ATP合成酶 CF12α亚基蛋白。基于禾本科植物 a tpA基因序列构建的
系统树显示 , 禾本科植物 a tpA基因在聚类关系上分为两大类 : 水稻和早园竹一起与甘蔗、杂交甘蔗、
高粱、玉米聚为一大类 ; 小麦、大麦、匍茎剪股颖和黑麦草聚为另一大类 (图 1)。
图 1　基于早园竹和其它禾本科植物 a tpA基因序列所构建的系统进化树
分支节点数值为置信度值 , 下同。
F ig. 1　Phylogeneticm rela tion sh ips of the Phyllostachys propinqua M cC lure
together w ith gra sses ( Poaceae) inferred from a tpA gene sequence
Bootstrap supporting valuesare shown at branch nodes. The same below.
psaB基因编码光合系统中 PSⅠ复合体中的 p saB蛋白。基于禾本科植物 psaB基因序列构建的系
统树显示 , 禾本科植物 psaB基因在聚类关系上分为两类 , 水稻 Indica、Japonica和野生稻聚合后与早
园竹聚合 , 再与甘蔗、杂交甘蔗与高粱、玉米聚合为一大类 ; 小麦和大麦、匍茎剪股颖和黑麦草聚为
一大类 (图 2)。
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图 2　基于早园竹和其它禾本科植物 psaB基因序列所构建的系统进化树
F ig. 2　Phylogeneticm rela tion sh ips of the Phyllostachys propinqua M cC lure
together w ith gra sses ( Poaceae) inferred from psaB gene sequence
叶绿体基因 rpoA编码叶绿体可溶性 RNA聚合酶的α亚基。基于早园竹和其它禾本科植物 rpoA
基因序列构建的系统树显示 , 禾本科植物甘蔗、高粱、玉米聚为一类 , 早园竹与野生稻和水稻 Indica
聚为一类 , 这两类聚合后与匍茎剪股颖、小麦、大麦聚合 (图 3)。
图 3　基于早园竹和其它禾本科植物 rpoA基因序列所构建的系统进化树
F ig. 3　Phylogeneticm rela tion sh ips of the Phyllostachys propinqua M cC lure
together w ith gra sses ( Poaceae) inferred from rpoA gene sequence
叶绿体基因 rpoC1编码叶绿体可溶性 RNA聚合酶的β′亚基。基于禾本科植物 rpoC1基因序列构
建的系统树显示 , 水稻 Indica、Japonica和野生稻先聚为一类 , 然后与早园竹聚为一大类 ; 另一大类
为甘蔗、玉米、高粱先聚合 , 然后和小麦聚为一类 (图 4)。
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图 4　基于早园竹和其它禾本科植物 rpoC1基因序列的系统进化树
F ig. 4　Phylogenetic tree of the Phyllostachys propinqua M cC lure and Poaceae ba sed on rpoC1 gene sequence
3　讨论
植物叶绿体 DNA ( cpDNA) 为闭环双链 DNA , 原核生物型 , 大小为 120～210 kb。叶绿体基因相
当保守 , 进化速率平均每年每个位点约为 ( 012～110) ×10 - 9 , 这仅为核基因的 1 /5 (Badenes &
Parfitt, 1995) ; 此外 , cpDNA属母体遗传 , 一般不会在杂交中出现胞质混合 , 在物种进化中形成相
对独立稳定的体系 , 有独立的进化路线 , 不依赖于其它任何数据即可构建分子系统树。故对 cpDNA
进行分析 , 可为从历史和系统发育的角度解释生物多样性提供可靠和准确的信息。迄今为止的植物分
子系统学研究大多基于对 cpDNA比较分析。研究结果表明 , 在分类群中亲缘关系越近 , 其 cpDNA的
同源性越高 , 符合协同进化的理论。另外 , cpDNA不同区域的 DNA序列的进化速率存在着差异 , 这
就使 cpDNA序列的分析可以适合于任何一级分类群的系统学研究。在一些保守区域的序列比较可以
应用于研究大类群的系统与进化。而在特定的非编码区 , 由于序列结构特征而出现突变热点区 , 这对
于较近分类群的研究有重要价值。本研究选取的早园竹叶绿体基因中 rpoA、 rpoC1分别编码 RNA聚
合酶的α和β′亚基。RNA聚合酶在进化过程中高度保守 , 其许多结构特征在从细菌到人类的不同物
种间也具有保守性 (Chapman, 2007)。
目前对竹类植物的分子生物学研究薄弱 , 公布的竹类植物 DNA序列也多集中在对核、叶绿体和
线粒体个别基因的研究上。多数有关竹类植物系统学方面的研究是以单个叶绿体基因组基因或核基因
为研究对象 , 分别得出竹类植物与水稻 , 竹类植物与玉米 , 竹类植物与小麦有较近亲缘关系的结论
(Mason2Gamer et al. , 1998; Gaut et al. , 1999; Mathews et al. , 2000)。由于不同叶绿体基因可能存
在进化速度的不同 , 而核基因还存在进化过程中的重组、重排、加倍等情况 , 利用单个基因研究系统
进化关系可能导致一些偏差。本研究以 a tpA、 psaB、 rpoA和 rpoC1为研究对象 , 其中 a tpA、 psaB和
rpoA的结果显示出高度的一致性 ; 而 rpoC1的结果与其它 3个基因的分析结果有部分出入。所以在进
行系统学亲缘关系分析时 , 采用多个基因为研究对象进行分析可以避免单个基因分析过程中的偏差 ,
有助于正确反映物种的分类地位和系统进化关系。
本研究结果表明 : 选用的 4个基因 a tpA、psaB、 rpoA和 rpoC1在系统进化关系上都显示出早园竹
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与水稻亲缘关系最为接近 ; 其次与甘蔗、玉米、高粱进化关系较近 , 与禾本科中麦类和麦类近缘植物
的进化关系较远。樊龙江等 ( 2006 ) 依据 GenBank 中已测序的绿竹 (D endroca lam opsis oldham i
Munro)、毛竹 ( Phy llostachys heterocycla Carr. ) 和麻竹 (D endroca lam us la tif lorus Munro) 的 8个全长
mRNA进行的系统学分析得出的竹类植物与水稻亲缘关系最近的结果。 Zhang ( 2000 ) 基于叶绿体
rpl16基因获得的系统进化关系为竹类与水稻先聚合然后与玉米再聚在一起 ; Nadot等 (1995) 同样基
于叶绿体基因 rps4获得竹类与水稻先聚合然后与玉米、小麦再聚在一起。
研究认为禾本科植物在系统进化上大体分为两个进化类群 , 第一个类群中包括两个亚类 , 水稻和
竹类为一亚类 ; 高粱、甘蔗和玉米为另一亚类 ; 第二类群为麦类植物和其近缘植物。水稻与竹类植物
有最近的亲缘关系 , 这种较近的亲缘关系比水稻与玉米、高粱与甘蔗的亲缘关系更接近。水稻是目前
禾本科植物中研究最为详细的物种 , 已经完成基因组测序 ; 由于水稻和竹类植物具有很近的亲缘关
系 , 提示我们可充分利用水稻的研究背景加速竹类植物的分子生物学研究。
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